張文杰 郭凱 張發(fā)進(jìn) 王者江 董玉香 姬勝利

【摘 要】目的 對(duì)μ-CnIIIC芋螺多肽的3種二硫鍵異構(gòu)體進(jìn)行合成鑒定及生物安全性、活性評(píng)價(jià)。方法通過(guò)固相多肽合成法（SPPS）人工合成μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ線性肽；采用氧化法對(duì)線性肽進(jìn)行氧化折疊，獲得3種折疊肽異構(gòu)體（μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ），并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜表征和HPLC純化；通過(guò)MTT法測(cè)試3種異構(gòu)體的細(xì)胞毒性；采用雙電極電壓膜片鉗技術(shù)測(cè)試3種異構(gòu)體對(duì)NaV1.2的抑制作用。結(jié)果 質(zhì)譜表征結(jié)果顯示成功合成μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ 3種芋螺多肽異構(gòu)體；μ-CnIIIC 3種異構(gòu)體濃度在50 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞存活率均在75%以上且不發(fā)生溶血現(xiàn)象；μ-CnIIIC異構(gòu)體濃度為20 μmol/L時(shí)，μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ對(duì)對(duì)鈉通道的抑制率為23.64%、52.43%、81.21%，皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)每天每只動(dòng)物積分均值為0.107、0.179和0.286。結(jié)論 芋螺多肽μ-CnIIIC異構(gòu)體具有良好的生物安全性，二硫鍵連接為Ⅰ-Ⅳ、Ⅱ-Ⅴ和Ⅲ-Ⅵ的μ-CnIIIC異構(gòu)體對(duì)鈉通道有更好的選擇性，抑制作用較強(qiáng)，可發(fā)揮更好的生物活性。

【關(guān)鍵詞】μ-CnIIIC芋螺多肽；二硫鍵；鈉通道

中圖類分號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1004-4949（2023）02-0001-05

Synthesis， Identification and Activity Evaluation of μ-CnIIIC Conopeptide Disulfide Bond Isomer

ZHANG Wen-jie1， GUO Kai2， ZHANG Fa-jin1， WANG Zhe-jiang2， DONG Yu-xiang1， JI Sheng-li1，2

[1.College of Pharmacy， Binzhou Medical University， Yantai 264003， Shandong， China； 2.ReaLi Tide Biological technology （Weihai） Co.， Ltd， Weihai 264402， Shandong， China]

【Abstract】Objective To study the synthesis， identification and activity of three disulfide bond isomers of μ-CnIIIC. Methods The linear peptides of μ-CnIIIC-Ⅰ， μ-CnIIIC-Ⅱ and μ-CnIIIC-Ⅲ were synthesized by solid phase peptide synthesis（SPPS）. Three-fold peptide isomers （μ-CnIIIC-Ⅰ， μ-CnIIIC-Ⅱ and μ-CnIIIC-Ⅲ） were obtained by oxidative folding of the linear peptides， which were characterized by mass spectrometry and purified by HPLC. The cytotoxicity of the three isomers was tested by MTT method. The inhibition effect of three isomers on NaV1.2 was tested by using double electrode voltage patch clamp technique. Results Mass spectrometry characterization results showed thatμ-CnIIIC-Ⅰ， μ-CnIIIC-Ⅱ andμ-CnIIIC-Ⅲ were successfully synthesized. When the concentration of three isomers of μ-CnIIIC was in the range of 50μmol/L， the cell survival rate was above 75% and no hemolysis occurred. When the concentration of μ-CnIIIC isomer was 20 μmol/L， the inhibition rates of μ-CnIIIC-Ⅰ， μ-CnIIIC-Ⅱ and μ-CnIIIC-Ⅲ on sodium channel were 23.64%， 52.43% and 81.21%， respectively. The average scores of skin irritation test were 0.107， 0.179 and 0.286 per animal per day. Conclusion The μ-CnIIIC isomers of conopeptides have good biosafety. The μ-CnIIIC isomers with disulfide bonds of Ⅰ-Ⅳ， Ⅱ-Ⅴ and Ⅲ-Ⅵhave better selectivity to sodium channels， stronger inhibitory effect and better biological activity.

【Key words】μ-CnIIIC conopeptide； Disulfide bond； Sodium channel

芋螺毒素（conotoxins，CTX）是來(lái)源于海洋芋螺毒液的一類活性多肽，又稱芋螺多肽。大多數(shù)芋螺多肽富含二硫鍵，具有特定的分子構(gòu)型，能選擇性作用于細(xì)胞膜上特異的離子通道和受體等，具有激活乙酰膽堿受體等生物活性[1]。鈉通道廣泛分布于各種組織和器官中，參與多種生理過(guò)程，其功能異常會(huì)導(dǎo)致疼痛、癲癇、周期性麻痹等多種疾病發(fā)生，開(kāi)發(fā)針對(duì)鈉離子通道的新型化合物有助于多種疾病的治療和新型藥物的開(kāi)發(fā)[2]。芋螺含有超過(guò)上百萬(wàn)的天然多肽類化合物，但迄今為止僅百余種多肽化合物被發(fā)現(xiàn)，具有很大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力[3]。μ-CnIIIC屬于μ類芋螺毒素，其為14至26個(gè)氨基酸殘基肽，共享CCXnCXnCXnCC的特定半胱氨酸框架[4]。二硫鍵（disulfide bond）是多肽鏈內(nèi)或鏈間中的兩個(gè)半胱氨酸殘基側(cè)鏈的巰基氧化形成的共價(jià)鍵，μ類芋螺毒素具有6個(gè)半胱氨酸殘基的骨架，理論上可以形成15種不同的二硫鍵異構(gòu)體。研究表明[5]，并非所有的“活性”芋螺多肽折疊是最有效的生物活性肽，而具有非天然二硫鍵連接的芋螺毒素優(yōu)于天然的“活性”對(duì)應(yīng)物；同時(shí)二硫鍵的結(jié)構(gòu)對(duì)芋螺多肽的功效具有重要意義。為了解二硫鍵對(duì)芋螺多肽μ-CnIIIC異構(gòu)體活性的影響，本研究采用固相法合成3種μ-CnIIIC異構(gòu)體線性肽，并通過(guò)氧化法合成3種μ-CnIIIC異構(gòu)體，對(duì)其細(xì)胞毒性、鈉通道活性進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8只實(shí)驗(yàn)小鼠來(lái)源于濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，所用小鼠均為（體重30～40 g）普通級(jí)雌性昆明小白鼠，并嚴(yán)格按照“動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的護(hù)理和使用指南”飼養(yǎng)。8只實(shí)驗(yàn)家兔來(lái)源于濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，所用家兔均為普通級(jí)新西蘭白兔，并嚴(yán)格按照“動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的護(hù)理和使用指南”飼養(yǎng)。

1.2 主要材料與試劑 二氯甲烷（DCM）及乙腈（旺通化工有限公司）；1-羥基苯并三唑（HOBT）、二異丙基碳二亞胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）及氨基酸（蘇州昊帆生物股份有限公司）；3，4，5-三羥基苯甲醛（麥克林生化科技有限公司）；三異丙基硅烷（Tis，湖北永闊有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，魯西化工基團(tuán)股份有限公司）；Rink Amide 樹(shù)脂（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；RAW 264.7細(xì)胞（南京科佰生物科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于魯西化工基團(tuán)股份有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)液（山東致圣生物科技有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 智能磁力攪拌器（上海越眾有限公司，型號(hào)：ZNCL-BS 230*230）；高效液相色譜儀（美國(guó)Waters有限公司，型號(hào)：Waters-0150）；質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters有限公司，型號(hào)：Waters-2695）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗有限公司，型號(hào)：N-1300）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：101-2AB）；紫外分析儀（上海光豪有限公司，型號(hào)：ZF-5）；Axon Axoclamp 900A膜片鉗微電極放大器系統(tǒng)（美國(guó)Molecular Devices公司）；真空冷凍干燥機(jī)（青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司，型號(hào)：CTFD-18）；高壓滅菌鍋（廈門(mén)致微儀器有限公司，型號(hào)：San Yo MLS-3750）。

1.4 芋螺多肽合成 采用傳統(tǒng)Fmoc保護(hù)的固相多肽合成法合成[5]。采用可酰胺化的Rink Amide樹(shù)脂，并采用DCC、HOBT及DIEA為縮合體系，DMF為反應(yīng)溶劑。線性肽合成后使用裂解溶液室溫下切割2 h，切割后的多肽釋置于甲基叔丁基醚中析出后經(jīng)冷凍干燥，進(jìn)行下一步氧化折疊；采用三步氧化法對(duì)線性肽進(jìn)行氧化折疊，獲得μ-CnIIIC-Ⅰ（見(jiàn)圖1）、μ-CnIIIC-Ⅱ（見(jiàn)圖2）和μ-CnIIIC-Ⅲ（見(jiàn)圖3）3種折疊肽異構(gòu)體，然后對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜表征和HPLC純化，合成產(chǎn)物凍干后分裝備用。

1.5 芋螺多肽表征 流動(dòng)相采用乙腈-水（75∶25），流速為0.4 ml/min，柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為30 μl。采用電噴霧離子源，正離子模式，全掃描模式（Full Scan），掃描范圍m/z 400～2600，電噴霧電壓4500 V；加熱毛細(xì)管溫度380 ℃；毛細(xì)管電壓100 V；Tube lens 150 V；氮?dú)猓∟2）壓力30 arb；輔助氣（N2）壓力10 arb；二級(jí)離子采用碰撞誘導(dǎo)解離（collision-induced dissociation，CID）采集數(shù)據(jù)。

1.6 生物相容性研究 生物相容性是驗(yàn)證化合物能否作為候選藥物的重要指標(biāo)，因此對(duì)3種多肽的溶血活性和細(xì)胞毒性進(jìn)行研究。用熒光顯微鏡觀察紅細(xì)胞形態(tài)，分析其溶血活性。測(cè)定3種多肽對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞毒性[6]。8只實(shí)驗(yàn)小鼠分為a、b、c、d 四組，每組2只。4組小鼠分別尾靜脈注射生理鹽水（NS）0.2 ml和3種芋螺多肽0.2 ml（8 mg/kg）進(jìn)行溶血試驗(yàn)，2 h后從小鼠眼眶取血2滴，分別用生理鹽水稀釋，熒光顯微鏡下觀察紅細(xì)胞形態(tài)。用MTT法測(cè)定3種多肽對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW 264.7細(xì)胞）的細(xì)胞毒性。將RAW 264.7細(xì)胞（約2000個(gè)細(xì)胞）接種于96孔板，然后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞粘附。將不同濃度的芋螺多肽經(jīng)多次稀釋后加到細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育24 h。孵育完成后，吸掉上清液，每孔加入150 μl DMSO溶解溶液，37 ℃下孵育2 h；然后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度強(qiáng)度，確定3種多肽的細(xì)胞毒性。每個(gè)測(cè)試至少重復(fù)3次。

1.7 電生理活性檢測(cè) 使用自動(dòng)全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)μ-CnIIIC 3種異構(gòu)體對(duì)鈉離子通道抑制作用。首先將鈉通道穩(wěn)定表達(dá)的HEK293細(xì)胞系培養(yǎng)在10%的胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基（含10% FBS和1%雙抗）中，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；除去舊培養(yǎng)基用PBS洗滌1次，加入1.5 ml TrypLETM Express酶溶液孵育1 min；加入培養(yǎng)液輕輕吹打使細(xì)胞分離，轉(zhuǎn)移至離心管中離心，離心完成后將細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞密度不超過(guò)80%。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前24 h轉(zhuǎn)移至24孔板中培養(yǎng)，每孔體積為500 μl。細(xì)胞外液為145 mmol NaCl，4 mmol KCl，2 mmol CaCl2，1 mmol MgCl2，10 mmol 4-羥乙基哌嗪乙磺酸和10 mmol葡萄糖，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4。細(xì)胞內(nèi)溶液為140 mmol CsF，1 mmol乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸，5 mmol CsOH，10 mmol 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，10 mmol NaCl，用CsOH調(diào)節(jié)pH為7.3。用0.1%牛血清白蛋白的細(xì)胞外液稀釋3種芋螺多肽。鈉通道在全細(xì)胞膜片鉗模式下將細(xì)胞膜電位鉗制在-80 mV，從-60 mV起施加，以10 mV步幅遞增、并去極化方波刺激至+60 mV，確定能夠激發(fā) HEK-293細(xì)胞最大鈉電流的激活電壓，再固定該刺激電壓值以50 ms、間隔時(shí)間5 s進(jìn)行連續(xù)去極化方波刺激，待電流穩(wěn)定后開(kāi)始給藥，并同時(shí)記錄細(xì)胞膜上通道電流變化情況。

1.8 皮膚刺激性檢測(cè) 根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中的毒理學(xué)試驗(yàn)方法檢測(cè)多肽對(duì)家兔皮膚的刺激性與腐蝕性，8只家兔分為四組，每組2只。試驗(yàn)前24 h剪掉家兔背部脊柱兩側(cè)毛，去毛范圍為3 cm×3 cm，注意不要損傷皮膚表面；取0.5 ml 2 mmol/L的多肽溶液或純化水涂抹在家兔皮膚上，涂抹面積為2.5 cm×2.5 cm，1次/d，連續(xù)涂抹14 d[7]。第2天開(kāi)始每次涂抹前應(yīng)剪毛，用水或無(wú)刺激性溶劑清除殘留受試物，1 h后觀察結(jié)果，各組別相同方法處理。參考表1進(jìn)行評(píng)分，每天每只動(dòng)物平均積分均值=Σ紅斑和水腫積分/受試動(dòng)物數(shù)/14。每只動(dòng)物積分均值在0.5以下為無(wú)刺激性，每只動(dòng)物積分均值0.5～2.0為輕刺激性，2.0～6.0為中刺激性，6.0～8.0為強(qiáng)刺激性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理本研究數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x-±s）表示，行t檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2 結(jié)果

2.1 3種異構(gòu)體表征 μ-CnIIIC-Ⅰ質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4，峰m/z 1188.45為[M+2H]2+離子信號(hào)，峰m/z 792.63為[M+3H]3+離子信號(hào)，峰m/z 594.73為[M+4H]4+離子信號(hào)；μ-CnIIIC-Ⅱ質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5，峰m/z 1188.45為 [M+H]+分子離子峰；μ-CnIIIC-Ⅲ質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6，峰m/z 1188.37為[M+2H]2+離子信號(hào)，峰m/z 792.74為[M+3H]3+離子信號(hào)，峰m/z 594.82為[M+4H]4+離子信號(hào)，峰m/z 475.97為[M+5H]5+離子信號(hào)。

2.2 生物相容性 a組紅細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖7a，b、c、d組紅細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖7b、7c、7d。四組紅細(xì)胞均正常，未觀察到明顯的紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象。同時(shí)，小鼠體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)溶血跡象。因此3種芋螺多肽均不會(huì)引起溶血現(xiàn)象，有良好的生物相容性。3種芋螺多肽對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的毒性見(jiàn)圖8，3種芋螺多肽細(xì)胞毒性均較低。當(dāng)濃度低于50 μmol/L時(shí)，μ-CnIIIC-Ⅰ對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的相對(duì)存活率大于80%，μ-CnIIIC-Ⅱ、μ-CnIIIC-Ⅲ對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的相對(duì)存活率大于75%，表明μ-CnIIIC-Ⅰ的細(xì)胞毒性低于μ-CnIIIC-Ⅱ、μ-CnIIIC-Ⅲ，具有很好的安全性。

2.3 μ-CnIIIC異構(gòu)體對(duì)鈉通道的抑制作用 與異構(gòu)體μ-CnIIIC-Ⅰ比較，μ-CnIIIC-Ⅱ異構(gòu)體在NaV1.2上的活性提高，μ-CnIIIC-Ⅲ異構(gòu)體的活性最高，見(jiàn)圖9；μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ對(duì)鈉離子通道的抑制率為23.64%、52.43%、81.21%。

2.4 皮膚刺激性研究 試驗(yàn)觀察期內(nèi)家兔出現(xiàn)非常輕的紅斑和水腫，純化水組每天每只動(dòng)物積分均值為0.036，μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ、μ-CnIIIC-Ⅲ組每天每只動(dòng)物積分均值為0.107、0.179和0.286，雖略大于純化水組，但值均<0.5，說(shuō)明3種多肽異構(gòu)體對(duì)皮膚多次給藥刺激性較低，具有較高的安全性。

3 討論

芋螺多肽可以作用于離子通道，其中鈉通道廣泛分布于各種組織和器官中，參與多種生理過(guò)程，其功能的異常會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如疼痛、癲癇、心臟傳導(dǎo)病、周期性麻痹等[8]。開(kāi)發(fā)針對(duì)鈉離子通道的新型化合物有助于多種疾病的治療和新型藥物的開(kāi)發(fā)[9]。

本研究采用固相多肽合成法合成μ-CnIIIC 3種異構(gòu)體線性肽，進(jìn)一步氧化合成了μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ 3種異構(gòu)體，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜表征，結(jié)果表明3種芋螺多肽異構(gòu)體成功合成。μ-CnIIIC 3種異構(gòu)體濃度在50 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞存活率均在75%以上，對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)殺傷作用；細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)中紅細(xì)胞完整，無(wú)溶血現(xiàn)象；說(shuō)明3種芋螺多肽都有良好的生物安全性和較低的細(xì)胞毒性。μ-CnIIIC異構(gòu)體濃度為20 μmol/L時(shí)，μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ對(duì)鈉通道的抑制率為23.64%、52.43%、81.21%，說(shuō)明芋螺多肽可特異性地阻斷鈉離子通道，使鈉離子內(nèi)流受阻，導(dǎo)致肌肉動(dòng)作電位不能形成，表情肌得以放松，從而有效預(yù)防和減少皺紋，說(shuō)明其可作為抗皺產(chǎn)品中的活性成分；另外，也表明二硫鍵的復(fù)雜程度對(duì)其功能活性有很大的影響，二硫鍵的連接次序越復(fù)雜，芋螺多肽對(duì)鈉通道的抑制作用越明顯。此外皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)每天每只動(dòng)物積分均值為0.107、0.179和0.286，表明芋螺多肽的三種異構(gòu)體對(duì)皮膚具有良好的安全性，可作為外用制劑發(fā)揮療效，通過(guò)涂抹即可達(dá)到注射肉毒桿菌毒素的作用，有望替代注射等侵入式祛皺方法，從而更安全有效地祛皺，避免侵入式產(chǎn)品對(duì)人體造成感染、面癱等潛在危害。

綜上所述，芋螺多肽活性受二硫鍵結(jié)構(gòu)的影響比較確切，二硫鍵結(jié)構(gòu)越復(fù)雜的芋螺多肽可更好的作為外用制劑阻斷鈉離子通道發(fā)揮抗皺等生物活性。

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編輯 劉雯