田燕歌 劉學芳 陳鍇 苗玉芳 趙高遠

(河南中醫(yī)藥大學 1呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；2河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點實驗室；3中醫(yī)藥科學院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種可預防和治療的疾病，以氣道和肺泡異常導致的持續(xù)呼吸道癥狀和氣流受限為特征〔1〕。COPD發(fā)病率、致殘率均高，社會經濟負擔重，使其成為世界范圍內重大課題，針對發(fā)病機制、藥物作用機制的基礎研究占據目前COPD研究的重要地位，以大鼠為代表的動物模型也得到廣泛應用〔2〕。肺組織病理是判定COPD最直觀的指標，故動物實驗中將其作為造模成功的標志及判定藥物療效的標準。目前研究中肺組織病理的評價方法各不相同，有描述法、定量分析法、評分法等，本文將其進行總結，為COPD的基礎研究提供病理分析方面的借鑒。

1 肺組織病理的染色方法

肺組織由肺實質和肺間質組成，肺實質包括導氣部和呼吸部，導氣部由肺內的支氣管、小支氣管、細支氣管和終末細支氣管組成；呼吸部由呼吸性細支氣管、肺泡管、肺泡囊和肺泡組成，兩者共同承擔肺的通氣功能；肺間質是肺泡之間的結締組織及其內包含的神經、血管和淋巴管等。COPD肺組織病理改變主要涉及肺泡結構、支氣管結構及肺間質改變，目前常用的染色方法主要有蘇木素-伊紅(HE)染色法、Masson染色、阿辛藍過碘酸-雪夫(AB-PAS)染色等。HE染色為常規(guī)染色方法，能較好地顯示組織結構和細胞形態(tài)，且切片可長期保存。其原理為蘇木素是堿性染料，可將細胞核染成藍紫色，伊紅是酸性染料，可使多數細胞質、肌纖維染成紅色，由此可較為清晰看到肺泡、支氣管、肺血管及肺間質結構。Masson染色即膠原纖維染色法，主要用于區(qū)分膠原纖維和肌纖維，其染色原理為小分子量易穿透結構致密、滲透性低的肌組織，而大分子量的淡綠或苯胺藍則只能進入結構疏松的、滲透性高的膠原組織，故可將肌纖維呈紅色，膠原纖維呈綠色或藍色，可直觀觀察到膠原沉積情況。AB-PAS染色主要染色糖原和多糖，可用于評價氣道黏液分泌程度，其原理為胞質內存在糖原或多糖類物質(如黏多糖、黏蛋白、糖蛋白等)中乙二醇基(CHOH-CHOH)經過碘酸氧化，轉變成二醛基(CHO-CHO)，與雪夫試劑中無色品紅結合，形成紫紅色染料而沉積于細胞內多糖處。

2 COPD肺組織病理的評價方法

肺組織病理能反映肺泡、小氣道結構及肺間質的變化，評價方法包括形態(tài)的描述及對氣道、肺泡的定量分析，定量分析可補充形態(tài)描述的不足，更為清晰準確地反映肺組織病理變化。

2.1肺組織形態(tài)描述法〔3～5〕

2.1.1對肺泡的描述 肺泡的描述主要涉及肺泡大小是否均勻、結構是否完整、有無萎陷，肺泡間隔厚度、斷裂融合及水腫情況，肺泡腔內及肺泡壁炎癥細胞浸潤情況，肺泡腔內有無滲出液、紅細胞和含有含鐵血黃素顆粒的巨噬細胞等。

2.1.2對支氣管的描述 支氣管的描述主要涉及支氣管管壁細胞、纖毛等排列是否整齊、有無斷裂，支氣管黏膜上皮的脫落情況、上皮細胞有無腫脹，黏膜皺襞是否增多，杯狀細胞、黏膜下腺體、平滑肌、結締組織的增生情況，支氣管壁、上皮下基底膜的厚度，管壁周圍是否有淋巴濾泡的形成，管腔內外炎癥細胞浸潤情況，腔內分泌物情況等。

2.1.3對肺間質的描述 對肺間質的描述主要涉及肺血管周圍及腔內炎癥細胞浸潤情況，血管壁厚度、充血、淤血、出血情況，血管是否擴張；肺間質組織成纖維細胞增生及膠原纖維增生情況、間質內充血、出血、水腫及炎癥細胞浸潤情況等。

2.2肺組織病理評分

2.2.1肺組織損傷程度 Wang等〔6〕將肺組織病理損傷分為3個級別：輕度：肺組織及各種小支氣管炎癥細胞浸潤占全視野的1/3以下，肺泡融合占全視野1/3以下；中度：肺組織及各種小支氣管炎癥細胞浸潤占全視野的2/3以下，肺泡融合占全視野2/3以下；重度：肺組織及各種小支氣管炎癥細胞浸潤占全視野的2/3以上，肺泡融合占全視野2/3以上。

2.2.2氣道炎癥評分〔7〕選取直徑≤1 100 μm(管腔最短徑/最長徑≥0.7)的膜性細支氣管，觀察以下7項指標：①上皮脫落糜爛；②上皮杯狀細胞增生；③管壁中性粒細胞(PMN)浸潤；④管壁淋巴細胞浸潤，淋巴濾泡形成；⑤管壁單核-巨噬細胞浸潤；⑥管壁嗜酸粒細胞浸潤；⑦管腔滲出。對各組大鼠按上述7項指標分別評分，無病變者為0分，將輕、中、重度異常分別評為1、2、3分，然后累加每一指標得分，將累加分占該標本內所有被檢的細支氣管可能得到的最高分的百分數，作為該標本細支氣管這一指標的病理積分，把7項指標的病理積分相加，即可得到每一標本細支氣管的病理得分。

2.2.3氣道黏液分泌評分 馬文嫻等〔8〕采用5分(0～4)評分系統(tǒng)評價氣道上皮細胞中PAS染色陽性細胞百分比：無杯狀細胞為0分；杯狀細胞<25%為1分；杯狀細胞25%～50%為2分；杯狀細胞51%～75%為3分；杯狀細胞>75%為4分。

2.3肺組織的定量分析

2.3.1肺泡損傷程度 肺泡結構異常和肺氣腫是COPD的主要病理生理改變，是氣流受限的主要因素〔9〕。有研究通過肺泡直徑(μm)〔10〕和肺泡平均橫斷面積(μm2)〔11〕反映肺泡損傷程度。肺泡平均截距(MLI)、單位面積平均肺泡數(MAN)和平均肺泡面積(MAA)是反映肺泡結構變化及肺氣腫程度的常用指標〔12，13〕。每組取6張及以上切片，每張切片在光鏡下隨機選取6個視野，在100/200倍鏡下避開支氣管和大、中血管截取圖片，以計算肺泡大小和密度。

MLI(μm)=L/Ns：在每張切片中間畫“十”，測量其長度(L)，計數經過此“十”字線的肺泡隔膜數(Ns)，其反映視野內平均肺泡的直徑。

MAN(/mm2)=Na/S：計算每個視野的肺泡數(Na)，測量每個視野的面積(S)，其反映視野內單位面積肺泡數目。

MAA=(S-P)/Na：計算每個視野的肺泡數(Na)，測量S，再測出HE染色陽性區(qū)域(肺實質)面積(P)，其反映視野內平均肺泡面積大小。

2.3.2氣道重塑程度 氣道重塑是以氣道炎癥引起氣道壁損傷和分子結構發(fā)生功能性改變?yōu)樘攸c，氣道壁增厚、杯狀細胞增生、黏液腺肥大等導致的不可逆性氣道阻塞是COPD的主要特征〔14〕。肺內支氣管分級較多，定量時需選取同等級別支氣管，需限定支氣管直徑或周長。支氣管壁厚度(BWT)是反映氣道重塑的主要指標，Sun等〔15〕選取周長<100 μm的支氣管，測量BWT及支氣管直徑(D)，計算BWT/D，發(fā)現(xiàn)CSE暴露16 w的大鼠BWT/D顯著增高。Xu等〔16〕每張隨機選取3個直徑為200 μm的支氣管，用醫(yī)學圖像定量分析(MIQAS)軟件進行測量，支氣管平滑肌面積(WAsm)=平滑肌層外側面積(Asmo)-平滑肌層內側面積(Asmi)，用管壁周長(Pi)進行標準化，單位長度平滑肌層面積(WAsm/Pi，μm2/μm)表示平滑肌層厚度。王紅崗等〔17〕采用 Image-Pro Plus 圖像分析軟件測量各組大鼠細BWT(μm)、管壁面積(WA，μm2)、WA/腔周長(μm2/μm)。譚玉萍等〔18〕選取膜性細支氣管(直徑750～1 100 μm)，測量各組大鼠管壁厚度(WT)、管壁平滑肌厚度并計算比值，測量WA、管腔面積(LA)并計算比值以反映氣道重塑程度。

2.3.3血管重構程度 肺血管重構是COPD的主要病理特征，是誘發(fā)肺動脈高壓的根源〔19〕。何飛等〔20〕研究藥物對COPD大鼠肺血管重構的影響，HE染色后光學顯微鏡下觀察肺小動脈形態(tài)學改變，利用病理圖文分析系統(tǒng)采集圖像，測量與終末細支氣管伴行的肺小動脈WT、血管直徑(VD)、LA、血管總面積(TA)、WA，然后計算WT占血管外徑百分比(WT%)、WA占血管總面積百分比(WA%)、LA占TA百分比(LA%)，以此作為大鼠的肺血管形態(tài)計量學指標對血管重構程度進行分析。楊宏寬等〔21〕200倍視野下測量細支氣管伴行的小動脈的腔面積和總面積及周長，以WT%和WA%評價肺血管重構程度。譚玉萍等〔18〕選取腺泡內肺動脈(直徑<400 μm)，測量血管平滑肌厚度、血管壁厚度并計算比值，測量血管壁面積、血管面積并計算比值，檢測血管平滑肌增殖情況評價肺血管重塑。Xing等〔22〕選擇外徑在100～200 μm范圍內的小肺動脈進行定量分析。采用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，對每個樣本5條動脈的WA和TA進行測量和記錄，WA%來評估血管重構。Zeng等〔23〕選取僅限于肺泡管附近的小動脈(直徑≤50 μm)，測量肺WT，以外徑的百分比表示〔(外徑-內徑)/外徑×100%〕，至少測量10條血管以獲得每只動物的平均值。

2.3.4膠原沉積程度 楊宏寬等〔21〕同時也評價了支氣管膠原沉積的程度。Masson染色肺組織切片，在100倍光鏡下測量氣道壁膠原面積(WAc)和氣道基底膜周長(Pbm)，膠原沉積的程度用小氣道基底膜單位長度的膠原面積(WAc/Pbm)評價。李小龍等〔24〕每張切片選取 3 個視野，采用 Image-ProPlus 測量膠原面積、整個圖像總面積，計算膠原面積比(%)=(膠原面積/整個圖像總面積)×100%，以此評價肺組織膠原沉積的程度。

2.3.5黏液分泌程度 白學敏等〔25〕進行AB-PAS 染色后采用IPP 軟件計數每個切片上的陽性杯狀細胞和總上皮細胞數，以陽性杯狀細胞/總上皮細胞數比例作為最終參考數據。Feng等〔26〕采用IPP6.0軟件計算AB/PAS陽性染色面積與相關支氣管上皮總面積的比率以評價支氣管上皮細胞杯狀細胞化生程度。

綜上所述，COPD病理評價方法主要有描述法、評分法、定量法，3種方法各有優(yōu)勢，可綜合應用，其中定量法更為客觀準確，主要針對肺泡、支氣管及小血管形態(tài)等進行定量分析，雖然定量分析方法已有較多參考，但實驗過程中仍需根據具體實驗選取合適的分析方法或者進行改進。例如，在支氣管測量時，有些切片難以找到規(guī)定范圍的支氣管，就需要根據實際情況再設定范圍，課題組在實驗〔27〕過程中發(fā)現(xiàn)支氣管或小血管WT并不均勻，就選取了3個位置(最長、最短、中間)進行內外徑的測量，最后求其平均值，也是在現(xiàn)有報道上的改進。本文根據文獻報道結合前期研究經驗，對COPD肺組織病理分析的應用進行了舉例，并且發(fā)現(xiàn)這些分析方法能夠較好反映COPD肺泡、支氣管及小血管形態(tài)結構的病理變化。COPD肺組織病理分析方法的應用或進一步改進可為COPD的基礎研究及藥物療效機制的研究提供較為直觀的依據，但仍需探索和改進。