王 娟，范婷婷，劉豐茂

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京 100193)

1 前言

2-(乙酰氧基)苯甲酸(Acetylsalicylic acid，ASA)又稱阿司匹林，乙酰水楊酸，是一種廣泛用于農(nóng)業(yè)中的植物生長調(diào)節(jié)劑[1]。外源施用能夠有效減輕活性氧對植物葉面細(xì)胞膜的傷害，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性得到保護(hù)，有效地調(diào)節(jié)植物葉面毛孔關(guān)閉抑制葉片水分蒸騰，延續(xù)作物衰老，具有細(xì)胞激活、抗旱、助長、抗病作用[2-5]。目前已經(jīng)建立了2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC-MS[1，6]分析方法，雖然方法靈敏度很高，但不適合用于農(nóng)藥產(chǎn)品的定量分析；此外，還報道了通過分光光度法[7]和化學(xué)滴定法[8]快速地測定藥片中2-(乙酰氧基)苯甲酸的含量，但結(jié)果會產(chǎn)生較大誤差。有研究也建立了2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC法，操作簡單、應(yīng)用范圍廣[9-10]，檢測結(jié)果能達(dá)到農(nóng)藥產(chǎn)品定量分析的檢測要求，但在研究中并未對其在分析過程中易分解成水楊酸的問題進(jìn)行探討并對分析條件進(jìn)行優(yōu)化。

本文針對已登記的產(chǎn)品，建立了有效成分2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC相分析方法，探討了其在分析過程中易分解成水楊酸的問題，還通過對溶解溶劑、流動相、洗脫方式及特異性參數(shù)進(jìn)行了方法優(yōu)化，并對99%原藥及30%可溶粉劑進(jìn)行了分析。最終所建立方法具有快速、穩(wěn)定、分離效果好、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，符合農(nóng)藥產(chǎn)品定量分析的檢測要求，為農(nóng)藥產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)分析方法的建立提供依據(jù)。

2 實驗部分

2.1 試劑 甲醇(色譜純)，冰乙酸，氯化鉀(分析純)；水：新蒸二次蒸餾水或超純水；2-(乙酰氧基)苯甲酸原藥(99%)和標(biāo)樣(ω≥99.8%)，水楊酸標(biāo)樣(ω≥99.8%)；2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑(30%)。

2.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent1260，具有可變波長紫外檢測器；Agilent色譜工作站；色譜柱：250 mm×4.6 mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝Innoval C18、5 μm填充物；微量進(jìn)樣器：50 μL；定量進(jìn)樣管：5 μL。

2.3 色譜操作條件 流動相：Ψ(甲醇∶0.1%冰乙酸溶液)=45∶55；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：276 nm；進(jìn)樣體積：5 μL；保留時間：2-(乙酰氧基)苯甲酸約6.6 min。典型的2-(乙酰氧基)苯甲酸標(biāo)樣和樣品色譜圖(圖1～3)。

圖1 2-(乙酰氧基)苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖

2.4 測定步驟

2.4.1 標(biāo)樣溶液配制 稱取0.02 g(精確至0.000 01 g)2-(乙酰氧基)苯甲酸標(biāo)樣于25 mL容量瓶中，加入適量1%冰乙酸甲醇溶液，超聲5 min，冷卻至室溫，用1%冰乙酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻備用。

圖2 99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原藥的HPLC圖

圖3 30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑的HPLC圖

2.4.2 試樣溶液的配制 稱取0.02 g(精確至0.000 01 g)2-(乙酰氧基)苯甲酸試樣于25 mL容量瓶中，加入適量1%冰乙酸甲醇溶液，超聲5 min，冷卻至室溫，用1%冰乙酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻備用。

2.4.3 測定 在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針2-(乙酰氧基)苯甲酸峰面積相對變化<1.2%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測定。

高溫對體外唾液鏈球菌clpP基因表達(dá)的影響 … ……………………………… 朱銘慧，等(12):1396

2.4.4 計算 將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中2-(乙酰氧基)苯甲酸峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中2-(乙酰氧基)苯甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)按以下公式計算：

式中：

ω1—試樣中2-(乙酰氧基)苯甲酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

A2—試樣溶液中2-(乙酰氧基)苯甲酸峰面積的平均值；

m1—2-(乙酰氧基)苯甲酸標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

ω—標(biāo)樣中2-(乙酰氧基)苯甲酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

A1—標(biāo)樣溶液中2-(乙酰氧基)苯甲酸峰面積的平均值；

m2—試樣的質(zhì)量，g。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測波長的選擇 2-(乙酰氧基)苯甲酸的紫外光譜圖(圖4)，從圖中可以看到在190～400 nm范圍內(nèi)，2-(乙酰氧基)苯甲酸在235 nm和276 nm處有紫外特征吸收峰。由于235 nm近紫外末端，干擾較大，為減少干擾，因此本方法將檢測波長確定為276 nm，這也與前期研究報道的檢測波長一致[11]。

圖4 2-(乙酰氧基)苯甲酸的紫外光譜圖

3.2 溶解溶劑的選擇 因2-(乙酰氧基)苯甲酸苯環(huán)上的乙?；菀姿獬伤畻钏岷鸵宜?圖5)，本研究比較了不同溶劑(甲醇和1%冰乙酸甲醇)溶解2-(乙酰氧基)苯甲酸產(chǎn)品時的效果。當(dāng)使用純甲醇溶解2-(乙酰氧基)苯甲酸產(chǎn)品時，部分2-(乙酰氧基)苯甲酸會發(fā)生分解，產(chǎn)生水楊酸(圖5)，在以往的文獻(xiàn)中也有相似的報道[8]。

圖5 2-(乙酰氧基)苯甲酸水解產(chǎn)生水楊酸和乙酸反應(yīng)式

當(dāng)在溶劑中加入適量乙酸，使用1%冰乙酸甲醇溶解時，能有效抑制2-(乙酰氧基)苯甲酸分解成水楊酸，有效成分會更穩(wěn)定(圖6)。因此本方法選擇1%冰乙酸甲醇作為溶解2-(乙酰氧基)苯甲酸農(nóng)藥產(chǎn)品的溶劑。

圖6 甲醇溶解(左)、1%冰乙酸甲醇溶解(右)色譜圖(峰1—2-(乙酰氧基)苯甲酸；峰2—水楊酸)

3.3 流動相、洗脫方式的選擇 為了得到更好的分離效果和峰形，本研究比較了不同流動相及洗脫方式對有效成分色譜峰的影響，流動相采用甲醇/水、甲醇/0.1%冰乙酸水溶液(pH=3.3)。

結(jié)果表明，當(dāng)流動相中不加入冰乙酸時，會出現(xiàn)明顯的水楊酸峰(圖7A)，說明目標(biāo)化合物水解嚴(yán)重；當(dāng)在流動相中加了0.1%冰乙酸后，水解受到抑制，穩(wěn)定了2-(乙酰氧基)苯甲酸(圖7B、C)。

在對比等度洗脫和梯度洗脫效果時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用梯度洗脫時，洗脫程序(表1)，有效成分的色譜峰峰型更好，峰寬更窄(圖7B)；而使用甲醇：0.1%冰乙酸溶液進(jìn)行等度洗脫時，有效成分的色譜峰峰型偏寬(圖7C)。從儀器設(shè)備角度考慮，梯度洗脫更復(fù)雜，對儀器設(shè)備要求更高。將流動相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗，隨著甲醇比例減少，雜質(zhì)水楊酸出峰時間越晚，運(yùn)行時間延長，最終選擇甲醇∶0.1%冰乙酸溶液(V/V，45∶55)作為流動相。該條件下，2-(乙酰氧基)苯甲酸色譜峰峰形較好，與雜質(zhì)能完全分離，并且分析時間較短，提高了工作效率。

圖7 不同流動相洗脫色譜圖A：甲醇：水等度洗脫、B：甲醇：0.1%冰乙酸溶液梯度洗脫、C：甲醇：0.1%冰乙酸溶液45∶55等度洗脫

3.4 特異性實驗 本試驗采用HPLC-DAD峰純度分析法來鑒別2-(乙酰氧基)苯甲酸。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)因有效成分2-(乙酰氧基)苯甲酸在235 nm有吸收，流動相中又含有乙酸，其截止波長為230 nm。因此在采用梯度洗脫時，乙酸含量變化會影響方法特異性，計算特異性的起始波長選取對峰吸收純度干擾很大(表2)，起始波長達(dá)到240 nm，特異性才合格。而當(dāng)選擇等度洗脫時，乙酸含量是恒定的，干擾因素大大降低，計算特異性的起始波長選取對對峰吸收純度影響較小，起始波長在200 nm以上特異性就合格。因此當(dāng)采用梯度洗脫時，應(yīng)注意選取高于溶劑截止波長的起始波長進(jìn)行特異性參數(shù)確認(rèn)。而采取等度洗脫時未發(fā)現(xiàn)溶劑截止波長對特異性的影響，因此本方法洗脫方式最終選擇等度洗脫。

表2 梯度洗脫時不同起始波長對純度因子的影響

圖8 2-(乙酰氧基)苯甲酸標(biāo)樣HPLC-DAD峰純度色譜圖

3.5 分析方法的線性相關(guān)性試驗 按標(biāo)樣溶液制備方法配制(201.6～2016.0 mg/L)5個不同濃度的有效成分線性相關(guān)溶液，測定每個溶液中2-(乙酰氧基)苯甲酸的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，2-(乙酰氧基)苯甲酸質(zhì)量濃度在201.6～2 016.0 mg/L之間與相應(yīng)的峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=1.756 86x+23.487 31，R=0.999 8，可以滿足定量分析要求。

3.6 分析方法的精密度試驗 按2.5.2試樣溶液的制備方法配制5個99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原藥的精密度溶液，和5個30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑的精密度溶液，進(jìn)行測定，測得99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原藥和30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.49%和1.42%，變異系數(shù)分別為0.49%和1.42%，結(jié)果表明(表3)該分析方法具有良好的重現(xiàn)性、良好的精密度。

表3 虱螨脲(氯蟲苯甲酰胺)的線性相關(guān)性試驗數(shù)據(jù)

表3 2-(乙酰氧基)苯甲酸精密度試驗結(jié)果

3.7 方法準(zhǔn)確度實驗 稱取0.01 g(精確至0.000 01 g)2-(乙酰氧基)苯甲酸的30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑于25 mL容量瓶中，再加入2-(乙酰氧基)苯甲酸標(biāo)樣0.01 g(精確至0.000 01 g)，按2.5.2試樣溶液的制備方法配制5個30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑的準(zhǔn)確度溶液進(jìn)行測定。

實驗結(jié)果可知，按所建立的方法進(jìn)行HPLC測定，其添加回收率在98.21%～99.33%范圍內(nèi)(表4)，符合農(nóng)藥產(chǎn)品定量分析的檢測要求。

4 結(jié)論

本文建立了2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC分析方法，并對溶劑對樣品的穩(wěn)定性影響，梯度或等度洗脫的差異，以及特異性參數(shù)設(shè)置對純度因子的影響進(jìn)行了研究，得出以下幾條結(jié)論：

(1)2-(乙酰氧基)苯甲酸易分解為水楊酸和乙酸，因此在溶解此類產(chǎn)品時，在溶劑中加入一定量的冰乙酸，同時在流動相中也加入冰乙酸，都能有效抑制其分解，能在產(chǎn)品定量分析時提高準(zhǔn)確度。

(2)在對2-(乙酰氧基)苯甲酸進(jìn)行梯度洗脫時，能產(chǎn)生比等度洗脫峰形更好、峰寬更窄的色譜峰，但梯度洗脫更復(fù)雜，對儀器設(shè)備要求更高。此外，在進(jìn)行梯度洗脫時，乙酸含量變化會影響方法特異性，需選取高于溶劑截止波長的起始波長進(jìn)行特異性參數(shù)確認(rèn)；因此推薦選用等度洗脫。

(3)方法以甲醇∶0.1%冰乙酸溶液(V/V，45∶55)為流動相，等度洗脫，使用Innoval C18色譜柱和二極管陣列檢測器，在276 nm的檢測波長下，對99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原藥及30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑進(jìn)行分析。方法確證結(jié)果表明，該分析方法條件下的2-(乙酰氧基)苯甲酸的線性相關(guān)系數(shù)為0.999 8，99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原藥及30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉劑變異系數(shù)分別為0.49%和1.42%，30%2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶性粉劑的平均回收率分別為98.58%。此方法快速、靈敏，具有良好的線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度，是2-(乙酰氧基)苯甲酸產(chǎn)品質(zhì)量控制的有效可行的分析方法。