徐媛媛，陳 萌，徐曉飛

（廣東海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 陽江 529500)

食用菌有悠久的食用和藥用歷史，因其富含纖維、多種營養(yǎng)素、美味和低熱量而廣受歡迎，許多體外和動(dòng)物研究報(bào)告了食用菌的保健作用，如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等[1]。繡球菌是近年來人工培育成功的一種新興食用菌，子實(shí)體呈白色或淡黃色，外形似繡球，又名為花椰菜菇，野生資源非常稀少，是名貴食藥用菌[2]，在生物學(xué)分類上隸屬繡球菌科（Sparassisidaceae）繡球菌屬（Sparassis）[3]。研究發(fā)現(xiàn)，繡球菌中含有高比例高分子多糖、氨基酸和豐富的礦物質(zhì)和維生素[4]，此外還有多酚類、黃酮類、萜類、生物堿、鄰苯二甲酸酯等活性成分[5]，特別是β-(1,3)-葡聚糖的含量非常豐富。日本食品分析化驗(yàn)所測得β-(1,3)-葡聚糖含量為43.5 g/100 g干重[2]；我國學(xué)者報(bào)道繡球菌柄部和瓣片部分的含量分別為54%和56%，極顯著高于猴頭菇、香菇、蛹蟲草和草原黃蘑菇[6]，為已知食用菌之最。因此，對食用菌進(jìn)行深加工有利于開發(fā)食用菌資源，發(fā)揮其活性成分豐富的優(yōu)勢[7]。

近年來，我國腫瘤患者數(shù)量持續(xù)增長，給社會醫(yī)療系統(tǒng)帶來巨大負(fù)擔(dān)[8]。機(jī)體免疫功能特性與狀態(tài)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中具有重要的作用[9]。因此，增強(qiáng)腫瘤病人的免疫功能成為提高抗腫瘤治療效果的一個(gè)重要手段。在眾多具有激活機(jī)體免疫系統(tǒng)、提高免疫功能的天然活性物質(zhì)中，β-(1,3)-葡聚糖具有來源廣泛、活性強(qiáng)、耐受性好、副作用小等特點(diǎn)[10]，已經(jīng)有超過10 000 項(xiàng)在同行評審期刊上發(fā)表的科學(xué)研究[11]，也是眾多臨床試驗(yàn)的對象[12]。繡球菌是β-(1,3)-葡聚糖的良好來源，日本學(xué)者用繡球菌粉喂食接種S180 腫瘤細(xì)胞的小鼠5 周后，發(fā)現(xiàn)腫瘤重量明顯比對照組小，且小鼠生存時(shí)間延長[13]，提示繡球菌可應(yīng)用于輔助抑制腫瘤食品。在前期研究中，通過將繡球菌子實(shí)體粉碎結(jié)合微壓提取方式，開發(fā)了一種繡球菌深加工標(biāo)準(zhǔn)化原料，并取得了食品原料標(biāo)準(zhǔn)備案[廣東省食品安全企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《繡球菌濃縮液》（Q/WQYS 0083 S—2022），備案號：44020005S-2023][14]。為方便加工使用，進(jìn)一步將濃縮液凍干制得凍干片[廣東省食品安全企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《繡球菌凍干片（壓片糖果）》（Q/WQYS 0088 S—2023），備案號：44020023S-2023]。本試驗(yàn)通過建立S180 荷瘤小鼠模型，探究繡球菌凍干片對S180 腫瘤的抑制作用，檢測小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫功能指標(biāo)變化，分析腸道中短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acids，SCFAs）水平，旨在為繡球菌凍干片的抗腫瘤作用及機(jī)理提供試驗(yàn)證據(jù)，也為食用菌深加工方向提供一種參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

4～8 周齡BALB/C 小鼠，雄性SPF 級100 只購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2022－0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號№440072001202044。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF 級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，設(shè)施使用許可證號：SYXK（粵）2020-0059。試驗(yàn)倫理由廣東省第二中醫(yī)院試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)（049176）。

1.2 材料與試劑

繡球菌凍干片（0.5 g/片×3片/袋，每100 g含β-1,3-葡聚糖10.7 g），批號：20230501，本研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)并由上海雪榕源生物有限公司制造，推薦服用量1.5 g·d-1。破壁靈芝孢子粉膠囊（0.3 g/?！?0粒，每100 g含多糖1 g，總?cè)? g），批號：2301091P142，廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司，推薦服用量1.8 g·d-1。茯苓多糖口服液（每100 mL 含茯苓多糖1.6 g），批號：20230601，湖南補(bǔ)天藥業(yè)股份有限公司，臨床治療推薦服用量30 mL·d-1。乙酸（純度99.8%）、丙酸（純度99.5%）、異丁酸（純度99.5%）、丁酸（純度99.5%）、異戊酸（純度99%）、戊酸（純度99%），上海麥克林公司。

S180 細(xì)胞、L929 細(xì)胞，武漢普諾賽生命科技有限公司；1640 培養(yǎng)基，上海中喬新舟生物科技有限公司；胎牛血清，維森特生物技術(shù)（南京）有限公司產(chǎn)品；CCK-8 試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；刀豆凝集素ConA，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；小鼠白細(xì)胞介素2（IL-2）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

小型高速離心機(jī)（5450 型），德國Eppendorf 公司；電子天平（BSA2245 型），賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Varsoskan Flash 多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；倒置顯微鏡（DMi1 型），Leica 公司；GC-2010PLUS氣相色譜儀，島津儀器公司；DB-FATWAX 毛細(xì)管色譜柱，安捷倫儀器公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 S180 細(xì)胞培養(yǎng)

S180 細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，染色鑒定活細(xì)胞數(shù)≥95%，隨后用培養(yǎng)液調(diào)整至106個(gè)/mL 濃度。

1.4.2 S180 荷瘤小鼠模型建立與試驗(yàn)分組

取50 只小鼠腹腔注射S180 細(xì)胞，接種7 d 后，在無菌條件下取荷瘤小鼠的腹水與生理鹽水按1 ∶3 的比例稀釋至2×107～3×107個(gè)/mL 濃度。然后對剩余50 只小鼠右腋皮下注射0.2 mL 腹水稀釋液，建立S180 荷瘤小鼠模型[15]，隨后按表1 將小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只。本實(shí)驗(yàn)以造模當(dāng)天記為第“0 d”，造模次日，口服灌胃給藥體積0.2 mL，1 次/天，持續(xù)18 d。

表1 S180 荷瘤小鼠分組與灌胃劑量設(shè)計(jì)表

1.4.3 荷瘤小鼠體質(zhì)量、瘤體質(zhì)量、瘤體指數(shù)和體積測定

每天觀察并記錄小鼠的活動(dòng)情況，在第2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d、18 d 測定小鼠的體重。給藥18 d 后斷頸處死小鼠，剖取腫瘤測定瘤重，按式（1）計(jì)算瘤體指數(shù)。

式中：m1為腫瘤質(zhì)量，mg；m2為小鼠體重，g。

用游標(biāo)卡尺測量腫瘤尺寸并按式（2）計(jì)算瘤體體積。

式中：D為腫瘤最大直徑，cm，d為腫瘤最小直徑，cm[16]。

1.4.4 腫瘤抑制率的測定

根據(jù)式（3）計(jì)算各樣品的腫瘤抑制率。

式中：M為模型組瘤重與小鼠體重的比值；N為試驗(yàn)組瘤重與小鼠體重的比值[15]。

1.4.5 白細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞因子和臟器指數(shù)的測定

結(jié)束實(shí)驗(yàn)后，小鼠麻醉后進(jìn)行眼眶采血，測定白細(xì)胞數(shù)量；4 ℃、3 000 r·min-1離心l0 min 收集血清，按ELISA 試劑盒操作方法分別測定小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平。無菌剖取小鼠胸腺、脾臟，準(zhǔn)確稱重并計(jì)算胸腺/脾臟指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.4.6 脾淋巴細(xì)胞增殖活性和脾NK 細(xì)胞殺傷活性測定

按照文獻(xiàn)制備脾細(xì)胞懸液[17]，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106/mL 后，將細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)板（0.2 mL/孔），加7.5 μg·mL-1ConA（0.01 mL/孔），以未加ConA孔作對照孔，5%CO2、37 ℃飽和濕度下培養(yǎng)24 h，于培養(yǎng)結(jié)束前1 h 左右，每孔吸棄100 μL 培養(yǎng)液上清后加入CCK-8（0.01 mL/孔），并設(shè)RPMI1640培養(yǎng)液空白對照，各處理均采用3個(gè)復(fù)孔。用酶標(biāo)儀450 nm 波長測定每孔OD值。脾淋巴細(xì)胞增殖活性=（刺激孔OD值/對照孔OD值）×100%。

同上法制備脾細(xì)胞懸液，按文獻(xiàn)報(bào)道方法測定脾NK 細(xì)胞殺傷活性[18]。

1.4.7 小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸SCFAs 的測定

無菌剖取小鼠腸組織，于冰上切開腸組織，無菌PE管收集每只小鼠結(jié)腸內(nèi)容物，標(biāo)記后速凍、-80 ℃保存。按照文獻(xiàn)方法檢測內(nèi)容物中6 種短鏈脂肪酸的濃度[19]。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

所有計(jì)量資料以平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），相關(guān)性分析采用Pearson，由SPSS22.0 軟件完成，P＜0.05 代表有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)樣品對小鼠體重的影響

如圖1 所示，給藥前各組小鼠體重?zé)o明顯差異（P＞0.05）；試驗(yàn)過程中，荷瘤模型組小鼠體重呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，GS 和PCP 組體重變化趨勢與模型組相似（16 d 前）；SCL 和SCH 組體重開始增長緩慢然后明顯增加，16 d 后，SCL 和SCH 組小鼠體重均比GS 和PCP 組高。

圖1 試驗(yàn)期間各組小鼠平均體重的變化圖

2.2 試驗(yàn)樣品對小鼠存活率和腫瘤生長的影響

試驗(yàn)結(jié)束后，Model、GS、PCP、SCL 和SCH 組分別有4 只、2 只、1 只、2 只和2 只小鼠死亡，各組存活率和對腫瘤抑瘤作用見表2。各試驗(yàn)樣品均對S180腫瘤生長有一定抑制作用；從瘤體指數(shù)分析，與模型組相比，各試驗(yàn)樣品均對S180 瘤體指數(shù)有極顯著的影響，GS 組和SCH 組的抑制效果相當(dāng)，PCP 組和SCL組的抑制效果相當(dāng)；從瘤體體積來看，PCP 組和SCL組的抑制效果相當(dāng)。SCL 組與SCH 組結(jié)果反映了繡球菌凍干片對腫瘤抑制作用具有劑量依賴性，高劑量優(yōu)于低劑量。

表2 荷瘤小鼠存活率和試驗(yàn)樣品對腫瘤抑制作用表

2.3 試驗(yàn)樣品對荷瘤小鼠免疫功能的影響

2.3.1 臟器指數(shù)

白細(xì)胞是機(jī)體外周血中各種免疫細(xì)胞的統(tǒng)稱，包括T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B 細(xì)胞等。免疫器官臟器指數(shù)一定程度反映了整體免疫功能強(qiáng)弱。由圖2 可知，各樣品對荷瘤小鼠的白細(xì)胞數(shù)量無顯著影響，對脾臟指數(shù)有一定提高作用，其中SCH 組顯著高于Model 組和PCP 組，說明高劑量繡球菌凍干片能明顯提高脾臟指數(shù)；各樣品均能極顯著提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)，但各試驗(yàn)組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 試驗(yàn)樣品對荷瘤小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)和臟器指數(shù)的影響圖

2.3.2 細(xì)胞因子水平

細(xì)胞因子水平反映了體液免疫功能的變化，對荷瘤小鼠外周血細(xì)胞因子水平的影響見圖3。在IL-2 水平上，PCP、SCL 和SCH 組顯著高于Model 組，然而各樣品對IL-6 和IL-8 作用不明顯，但可以顯著或極顯著提升TNF-α 水平，其中SCH 組提升程度最大。綜上所述，靈芝孢子粉、茯苓多糖和繡球菌凍干片能夠提高荷瘤小鼠IL-2 和TNF-α 水平。

圖3 試驗(yàn)樣品對荷瘤小鼠細(xì)胞因子水平的影響圖

2.3.3 細(xì)胞活性指標(biāo)

脾淋巴細(xì)胞增殖活性和脾NK 細(xì)胞殺傷活性反映了機(jī)體細(xì)胞免疫功能。由圖4 可知，相比模型組，GS 組脾淋巴細(xì)胞增殖活性有提升但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而PCP、SCL 和SCH 組顯著增強(qiáng)（P＜0.01）；同時(shí)，各樣品也顯著提升了荷瘤小鼠的NK 細(xì)胞殺傷活性，其中以SCH 組提升程度最高。

圖4 對荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和NK 細(xì)胞殺傷活性的影響圖

綜合臟器指數(shù)、細(xì)胞因子水平和細(xì)胞活性指標(biāo)，靈芝孢子粉、茯苓多糖和繡球菌凍干片均具有提高荷瘤小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫功能的作用。繡球菌凍干片對荷瘤小鼠的免疫增強(qiáng)作用存在劑量依賴性，以高劑量繡球菌凍干片的效果為好。

2.4 試驗(yàn)樣品對腸道SCFAs 濃度的影響

為考察試驗(yàn)樣品對腸道菌群代謝的影響，采用GC-MS 檢測了小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中6 種SCFAs（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和正戊酸）的濃度。Model、GS 和PCP 組各有一只小鼠的結(jié)腸內(nèi)容物中未檢測出SCFAs，繡球菌凍干片高低劑量組小鼠均可檢出，數(shù)據(jù)結(jié)果如圖5 所示。與模型組相比，各樣品組小鼠的6 種SCFAs 濃度有增加的趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，總SCFAs 濃度也呈現(xiàn)類似的結(jié)果，其中繡球菌凍干片SCL 和SCH 組 總SCFAs 分別為（3.40±0.24）mg·g-1和（3.42±0.12）mg·g-1，提示繡球菌凍干片的劑量對SCFAs 的濃度無明顯影響。

圖5 試驗(yàn)樣品對荷瘤小鼠結(jié)腸內(nèi)SCFAs 濃度的影響圖

2.5 免疫功能指標(biāo)與抑制腫瘤作用的相關(guān)性

為探索免疫指標(biāo)與腫瘤抑制效果的關(guān)系，利用Pearson 進(jìn)行相關(guān)性分析，如圖6 所示，瘤體指數(shù)與IL-2、TNF-α 水平的Pearson 相關(guān)系數(shù)（R）分別為-0.538 和-0.536（P＜0.01），表明瘤體指數(shù)與兩種細(xì)胞因子濃度具有中等程度的負(fù)相關(guān)性。

圖6 免疫功能指標(biāo)與瘤體指數(shù)的相關(guān)性圖

3 討論

靈芝是我國傳統(tǒng)的食藥兩用真菌，孢子是靈芝的生殖細(xì)胞。三萜類化合物和多糖是靈芝孢子粉的主要活性成分[20]，眾多研究表明靈芝孢子粉可以通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能、促進(jìn)NK 細(xì)胞活性和提高細(xì)胞因子分泌，以及調(diào)控程序性細(xì)胞死亡蛋白1 表達(dá)和調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性，實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抗腫瘤作用[21]。茯苓多糖占茯苓菌核重量的70%～90%，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明茯苓多糖通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫功能、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮抗腫瘤作用[22-23]。繡球菌中富含β-1,3-葡聚糖[2]，從繡球菌中分離得到的β-1,3-葡聚糖在20～500 mg·kg-1劑量范圍注射S180荷瘤小鼠，可在小鼠體內(nèi)抑制腫瘤的生長并呈現(xiàn)量效關(guān)系[24]；從繡球菌中提取獲得的多糖，通過破壞細(xì)胞膜的完整性抑制人類結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2、LS180 和HT-29 的增殖，表現(xiàn)出抗結(jié)腸癌的潛力[25]；繡球菌多糖也可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞K562、THP-1 細(xì)胞的凋亡[26]。此外，繡球菌多糖能提高免疫低下小鼠的脾臟指數(shù)，增加白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞及血小板數(shù)量，增強(qiáng)T 淋巴細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)脾免疫細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B、穿孔素和IL-2，抑制IL-10 的分泌，證明繡球菌多糖可提高免疫低下小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫功能[27]。由此可見，繡球菌凍干片的抗腫瘤作用與繡球菌多糖的增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。同時(shí)，繡球菌中除多糖類成分外，還有其他成分如蛋白質(zhì)和多酚類成分[5]。食用菌中蛋白質(zhì)和多酚成分也具有免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)不同成分之間也可能存在協(xié)同作用[28]。然而，有關(guān)繡球菌中蛋白質(zhì)和多酚的免疫調(diào)節(jié)作用和機(jī)理暫無報(bào)道，有待未來的進(jìn)一步研究。

本研究中，Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)腫瘤指數(shù)與IL-2、TNF-α 濃度呈負(fù)相關(guān)。IL-2 是T 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞增殖和分化的刺激因子[29]，IL-2 可調(diào)節(jié)CD4+T 細(xì)胞分化和功能，也調(diào)控與癌癥免疫治療有關(guān)的CD8+T 細(xì)胞的殺傷效應(yīng)和記憶反應(yīng)[30]，CD8+T 細(xì)胞主要是細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞，具有殺傷包括被病原體感染的體細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的作用。TNF-α 主要由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，TNF-α 通過與腫瘤細(xì)胞表面腫瘤壞死因子受體1（Tumor Necrosis Factor Receptor 1，NFR1）或TNFR2 結(jié)合，激活與細(xì)胞凋亡相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）信號通路，發(fā)揮抗腫瘤作用[31]。眾多研究表明β-葡聚糖可激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞和樹突細(xì)胞，刺激細(xì)胞因子包括白介素IL-2 和TNF-α 的分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻斷血管生成等多途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[32]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)樣品增加了荷瘤小鼠細(xì)胞因子IL-2 和TNF-α 濃度，有助于提升抗腫瘤效果，與前人研究結(jié)果相符。

SCFAs 是腸道菌群的代謝物之一，具有調(diào)節(jié)宿主免疫細(xì)胞發(fā)育、分化和免疫系統(tǒng)功能的作用[33]。眾多研究表明，食用菌多糖可以調(diào)節(jié)腸道菌群組成和促進(jìn)SCFAs 的產(chǎn)生[34]。在本研究中，灌胃茯苓多糖、繡球菌多糖對結(jié)腸部位6 種SCFAs 和總SCFAs 濃度無明顯影響，表明試驗(yàn)樣品對荷瘤小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用可能是通過非SCFAs 依賴途徑來實(shí)現(xiàn)。在小腸部位，由腸上皮細(xì)胞、固有層免疫細(xì)胞和派氏結(jié)等組成腸黏膜免疫系統(tǒng)是識別和響應(yīng)外來抗原物質(zhì)的主要系統(tǒng)[35]，多糖可以通過免疫受體介導(dǎo)與黏膜免疫系統(tǒng)作用而調(diào)節(jié)整體免疫系統(tǒng)功能[36]，由此說明，食用菌多糖可以通過多種途徑實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

本文采用S180 荷瘤小鼠模型評價(jià)繡球菌凍干片的抗腫瘤潛力和小鼠免疫功能指標(biāo)的變化，推測繡球菌凍干片可能是通過提高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2 和TNF-α 分泌，增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞增殖能力和NK 細(xì)胞殺傷活性來抑制S180腫瘤生長并提高荷瘤小鼠生存率。本研究結(jié)果可以為繡球菌應(yīng)用于提高免疫功能相關(guān)的功能食品開發(fā)提供參考。