唐定洪 李能源 任維 梁盼 羅群 黃銳 蒲清榮 趙劍 任桂林

[關(guān)鍵詞]柴芍胃炎顆粒；超高效液相色譜-質(zhì)譜；胃炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接

慢性胃炎（chronicgastritis，CG）指不同病因引起的各種慢性胃黏膜炎性病變，臨床上以上腹部疼痛、飽脹、燒灼感、反酸噯氣、食欲不振等癥狀多見，是一種常見病，“十人九胃病”，據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計(jì)，胃病的發(fā)病率高達(dá)80%，且日趨年輕化，故而胃病已成世界之殤。而CG位居胃病之首，病情反復(fù)，影響患者生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。在我國，基于內(nèi)鏡診斷的CG患病率在90%左右[1]。

胃病的病機(jī)多為胃氣阻滯，胃失和降，不通則痛。若情志不暢，肝郁氣滯，肝胃不和，損傷脾胃，而中焦升降失調(diào)，運(yùn)化不利，則胃脘部脹痛，故胃病與肝密切相關(guān)[2]。故將CG的病機(jī)概括為肝郁、胃熱、脾虛，治療以疏肝、清熱、補(bǔ)虛為主[3]。柴芍胃炎顆粒是西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院（我院）醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，由柴胡、黃連、吳茱萸、白芍、莪術(shù)、丹參、延胡索、酒大黃、黃芪、木香等中藥制成，其中柴胡疏肝解郁，白芍柔肝止痛，黃連、吳茱萸清肝胃郁熱，木香行氣止痛，延胡索、丹參、酒大黃活血化瘀，黃芪補(bǔ)氣健脾，諸藥共奏疏肝和胃，清熱止痛的功效[4]，用于肝胃不和、肝胃郁熱所致的胃脘脹痛、灼痛噯氣、口干口苦、情志不暢加重等癥[5]。柴芍胃炎顆粒在我院已使用多年，臨床療效顯著，但作用機(jī)制仍不清楚。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接對(duì)柴芍胃炎顆粒治療CG的成分及靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

Ultimate3000超高效液相色譜儀，美國Waters公司；LTQOrbitrapvelospro高分辨質(zhì)譜儀，美國ThermoFisher公司。柴芍胃炎顆粒，西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室，批號(hào)：20211115。

1.2 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：Hss-T3色譜柱（1.8μm，2.1mmID×150mm，Waters）；35℃柱溫；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～5min，2%B；5～8min，2%B→20%B；8～38min，20%B→55%B；38～45min，55%B→70%B；45～50min，70%B→80%B；50～56min，80%B→100%B；56～58min，100%B；58～58.5min，100%B→2%B；58.5～65min，2%B；流速0.2ml/min。質(zhì)譜條件：電噴霧（ESI）離子源，加熱器溫度300℃，毛細(xì)管溫度350℃，毛細(xì)管電壓35V，噴霧電壓為±3.5kV，鞘氣（N2）流速35arb，輔助氣（N2）流速10arb；一級(jí)質(zhì)譜正負(fù)離子模式全掃描，m/z掃描范圍100～1500，二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴性掃描。

1.3 樣品的制備

取柴芍胃炎顆粒10g，加8倍量的水，超聲30min，過濾，濾液12000r/min離心20min，取上清液，即得供試品。

1.4 柴芍胃炎顆?；钚猿煞謾z索及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/）獲取柴芍胃炎顆粒中每味中藥的化學(xué)成分，以口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18作為條件篩選活性成分。在TCMSP中篩選出候選活性成分的靶點(diǎn)信息[6]。將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一基因名稱。

1.5 胃炎相關(guān)靶點(diǎn)的搜集

以“gastritis”“chronicgastritis”“chronicsuperficialgastritis”為檢索關(guān)鍵詞，分別通OMIM（https：//omim.org/），Drugbank（https：//go.drugbank.com/），DisGeNET（https：//www.disgenet.org/），GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫獲取胃炎的相關(guān)靶點(diǎn)[7]。

1.6 “中藥-有效成分-治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將化學(xué)成分的靶點(diǎn)與胃炎疾病的靶點(diǎn)取交集，作為柴芍胃炎顆粒治療胃炎的潛在作用靶點(diǎn)。將化學(xué)成分的靶點(diǎn)與潛在治療靶點(diǎn)相互映射，構(gòu)建“中藥-有效成分-治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)[8]，并導(dǎo)入Cytoscape3.8.0進(jìn)行可視化，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)，篩選重要的化合物及作用靶點(diǎn)。

1.7 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將潛在作用靶點(diǎn)上傳到STRING11.0數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org/），構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），并將此網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0進(jìn)行可視化，篩選重要的蛋白質(zhì)[9]。

1.8 功能富集分析

應(yīng)用R及Rstudio軟件對(duì)柴芍胃炎顆粒治療胃炎的潛在作用靶點(diǎn)的生物過程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）、細(xì)胞成分（cellcomponent，CC）和KEGG通路富集分析，運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫（www.kegg.jp）繪制靶點(diǎn)作用通路，進(jìn)一步揭示柴芍胃炎顆粒治療胃炎的作用機(jī)制[10]。

1.9 分子對(duì)接

通過pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫下載化學(xué)成分結(jié)構(gòu)（.sdf），PDB（http：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。用DiscoveryStudio軟件分別對(duì)靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)進(jìn)行去除結(jié)晶水、加氫等處理，將PPI中Degree值前10的靶點(diǎn)與“中藥-有效成分-治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值前15的化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)接，以libdockscore值作為對(duì)接程度的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

1.10 中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過檢索《中華人民共和國藥典》2020年版[11]，對(duì)柴芍胃炎顆粒中的中藥歸經(jīng)進(jìn)行整理，構(gòu)建柴芍胃炎顆粒中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 柴芍胃炎顆粒主要化學(xué)成分

將柴芍胃炎顆粒供試品按照上述條件進(jìn)行UPLC-HR-MS分析，利用XcaliburQualBrowser軟件及文獻(xiàn)鑒定化合物，圖1為正、負(fù)離子檢測(cè)模式下的柴芍胃炎顆粒色譜圖，成分鑒定結(jié)果見表1。

2.2 柴芍胃炎顆粒活性成分及對(duì)應(yīng)靶標(biāo)

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫并篩選，得到柴芍胃炎顆粒候選活性化合物249個(gè)，其中白芍7個(gè)、柴胡11個(gè)、大黃6個(gè)、丹參54個(gè)、黨參13個(gè)、莪術(shù)1個(gè)、甘草86個(gè)、黃連9個(gè)、黃芪16個(gè)、木香5個(gè)、吳茱萸24個(gè)、延胡索49個(gè)、枳殼5個(gè)，共有成分19個(gè)。對(duì)活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，獲取靶點(diǎn)303個(gè)。

2.3 “中藥-有效成分-治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

利用OMIM、Drugbank、DisGeNET、GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取胃炎的相關(guān)靶點(diǎn)共計(jì)2060個(gè)。將成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，共有134個(gè)交集靶點(diǎn)。將上述結(jié)果構(gòu)建“中藥-有效成分-治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。圖中共有396個(gè)節(jié)點(diǎn)（中藥13個(gè)、成分249個(gè)、靶點(diǎn)134個(gè)），其中菱形代表治療靶點(diǎn)，上方圓形的代表共有化學(xué)成分，其余則代表中藥及各自中藥的化學(xué)成分。對(duì)節(jié)點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析，篩選網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)，Degree值在前10位的化合物分別是：槲皮素、木樨草素、山柰酚、川陳皮素、柚皮素、β-谷甾醇、芒柄花黃素、異鼠李素、甘草查爾酮A、丹參酮ⅡA，這些成分作用于胃炎的潛在靶點(diǎn)較多，說明這些成分與胃炎的靶點(diǎn)關(guān)系密切。Degree值在前10位的靶點(diǎn)分別是：PTGS2、HSP90AA1、PTGS1、AR、NOS2、PPARG、CHRM3、ESR2、F2、GSK3B，說明柴芍胃炎顆粒治療胃炎與這幾個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)性較大。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將134個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到蛋白質(zhì)間的相互作用信息，除了COA7靶點(diǎn)，其余靶點(diǎn)均具有相互作用。其Degree值較高的靶點(diǎn)為AKT1、IL6、TNF、TP53、IL1B、CASP3、JUN、PTGS2、MMP9、STAT3，其值分別為104、104、102、99、95、92、92、88、87、87。見圖3。

2.5 靶點(diǎn)富集通路分析

由GO富集分析結(jié)果可知，柴芍胃炎顆粒治療胃炎的作用靶點(diǎn)主要涉及的生物過程包括對(duì)脂多糖的反應(yīng)，對(duì)細(xì)菌源性分子的反應(yīng)，活性氧代謝過程和對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等。分子功能主要包括細(xì)胞因子活性，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。細(xì)胞組分主要涉及膜筏，膜微區(qū)等結(jié)果見圖4。KEGG富集分析P值最小的通路為脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路，見圖5，在該通路中，淺色靶點(diǎn)代表該通路中最為關(guān)鍵的靶點(diǎn)。

2.6 分子對(duì)接

運(yùn)用DiscoveryStudio軟件對(duì)靶點(diǎn)和化學(xué)成分進(jìn)行分子對(duì)接，篩選對(duì)接分?jǐn)?shù)值最高的靶點(diǎn)和其對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分，木犀草素、吳茱萸次堿、山柰酚等化學(xué)成分與靶點(diǎn)對(duì)接值較高，靶點(diǎn)中PTGS2、CAPS3等靶點(diǎn)對(duì)接分?jǐn)?shù)值最高，其中PTGS2與木犀草素、吳茱萸次堿、山柰酚對(duì)接分?jǐn)?shù)值達(dá)到了130，分子對(duì)接圖見圖6，表明這幾個(gè)分子具有的潛在作用活性強(qiáng)。

2.7 中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的分析

中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖中有11味中藥均歸脾經(jīng)，有8味中藥歸肝經(jīng)，有6味中藥歸胃經(jīng)，可見柴芍胃炎顆粒的主要作用部位在脾、肝、胃，這與柴芍胃炎顆粒的功效主治一致，見圖7。

3 討論

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，初步探討了柴芍胃炎顆粒治療胃炎的作用機(jī)制。分子對(duì)接的結(jié)果表明PTGS2與木犀草素、吳茱萸次堿、山柰酚對(duì)接分?jǐn)?shù)值較高，起主要作用。PTGS2、PTGS1又分別名為COX-1、COX-2，是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素代謝中的關(guān)鍵酶。PTGS1參與前列腺素的成分生成，特別是在胃和血小板中，是胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素和血小板產(chǎn)生血栓素A2（TXA2）的關(guān)鍵步驟。PTGS2在平滑肌及絕大多數(shù)被生長因子、細(xì)胞因子或激素刺激的組織中表達(dá)，負(fù)責(zé)產(chǎn)生炎癥性前列腺素，參與細(xì)胞生長、PG的產(chǎn)生等生物過程。通過降低PTGS2的表達(dá)起到抗炎作用[16]。因此，柴芍胃炎顆粒治療胃炎的靶點(diǎn)主要與抗炎、細(xì)胞增生等機(jī)制相關(guān)。

本研究運(yùn)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，對(duì)柴芍胃炎顆粒的多成分-多靶點(diǎn)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行探究，初步闡釋了柴芍胃炎顆粒治療胃炎的作用機(jī)制，為探索藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供了方向。