丘文龍，彭瑜威，楊心怡，譚曉君，張雪楊，趙文昌，吳都督，盧洪梅，劉小柳，阮永隊(duì)*，陳稚*（.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東東莞 5808；.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞第一醫(yī)院，廣東東莞 570；.中國(guó)深圳市深圳羅湖人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 5800）

2 型糖尿?。═2DM）是危害人類(lèi)健康的重大疾病，其病死率在腫瘤、心血管之后居第三位，是目前備受全球關(guān)注的公眾衛(wèi)生問(wèn)題。在我國(guó)T2DM 的患病率高達(dá)11.6%，T2DM 的防治已成為研究熱點(diǎn)[1-2]。目前T2DM 的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，但普遍認(rèn)為胰島素抵抗是T2DM 的主要發(fā)病機(jī)制。而腸道菌群與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，腸道菌群在胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[3-6]。因此，靶向調(diào)控腸道菌群及其代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，被認(rèn)為是治療T2DM 的有效手段。

另外，在中醫(yī)理論中，糖尿病屬于“消渴病”范疇，是以氣陰虛弱為本，燥熱熾盛為標(biāo)的一種慢性發(fā)展性疾病。不少研究表明，生脈散能有效改善胰島素抵抗，明顯改善T2DM 患者的臨床癥狀和體征[7-9]。目前生脈散改善胰島素抵抗的作用機(jī)制并未明了，本研究將從腸道微生態(tài)的角度探討生脈散調(diào)節(jié)糖脂代謝治療 T2DM 的可能作用機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選擇SD 大鼠70 只，雄性，SPF 級(jí)，身體質(zhì)量（100.0±10.0）g，由廣東醫(yī)科大學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)碼SCXK（粵）2013-0008。所有動(dòng)物均在無(wú)病原體的環(huán)境中飼養(yǎng)并隨意喂食。照顧和使用動(dòng)物的程序得到廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并遵守了有關(guān)動(dòng)物道德使用的所有適用的機(jī)構(gòu)和政府法規(guī)。

1.1.2 藥物與試劑 受試藥物：生脈散，藥物組成按照普通高等教育中醫(yī)藥類(lèi)規(guī)劃教材 《方劑學(xué) 》第五版所載 : 人參、麥冬、五味子按3∶3∶2 比例組成，本實(shí)驗(yàn)中取人參9 g、麥冬9 g、五味子6 g，以上藥物麥冬和五味子以10 倍量水煎煮1.5 h 后，人參10 倍水另煎1.5 h 后濾出藥液和其余藥物藥液混合、過(guò)濾，濃縮至0.5 g/mL。用藥劑量依據(jù)2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》，根據(jù)人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表計(jì)算，用藥總量為200 mg/kg，將該劑量設(shè)為中劑量，低、中、高劑量分別為50.0、200.0、400.0 mg/kg。對(duì)照藥物：（1）鹽酸二甲雙胍，250 mg/片，河北天成藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20031134，按照臨床常用劑量換算后給動(dòng)物灌服，劑量為4.0 mg/kg；（2）辛伐他汀，20 mg/片，浙江京新藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20000009，按照臨床常用劑量換算后給動(dòng)物灌服，劑量為0.32 mg/kg。采用葡萄糖氧化酶測(cè)定試劑盒、胰島素放免試劑盒、大鼠胰島素試劑盒、DNA 提取試劑盒（美國(guó)Cayman 試劑公司）、鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma 公司）。

1.1.3 主要儀器 AUW120D 電子分析天平，Shimadzu 公司，日本；DYCP-24DN 電泳儀，北京六一儀器廠，中國(guó)；TQ8040 氣相色譜-質(zhì)譜儀，日本島津公司；MiSeq PE300 高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina 公司。ABI 9700 逆轉(zhuǎn)錄PCR 儀，ABI 公司，美國(guó)；PikoReal熒光定量PCR 儀，Thermo Scientific 公司，美國(guó)；iMark 酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 造模與分組

大鼠飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室內(nèi)溫度（25±2）℃，濕度50%～70%，采用12 h∶12 h 晝夜間斷照明，每天給予換水1 次，定量添加飼料1 次，并及時(shí)更換墊料次，動(dòng)物自由飲水進(jìn)食，維持飼料由廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按隨機(jī)區(qū)組法分為正常組10 只，造模組60 只。造模組用高糖高脂飼料（豬油∶蔗糖∶奶粉∶雞蛋∶常規(guī)飼料=10∶20∶4∶3∶63）持續(xù)喂養(yǎng)8 周并結(jié)合腹腔注射30 mg/kg 鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠制備成糖尿病模型，正常組動(dòng)物腹腔注射等劑量的生理鹽水作為對(duì)照。

1.3 干預(yù)方法

選取造模成功的實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠隨機(jī)分組，共分為正常組、模型組、二甲雙胍組（4.0 mg/kg）、辛伐他汀組（0.32 mg/kg）、生脈散低劑量組（50.0 mg/kg，L-SMS）、生脈散中劑量組（200.0 mg/kg，M-SMS）和生脈散高劑量組（400.0 mg/kg，H-SMS），每組10 只。給藥組每日上午定時(shí)灌胃給藥，模型組和正常組用等劑量（1 mL/100 g）的生理鹽水灌胃，連續(xù)6 周，期間配合普通飼料喂養(yǎng)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 血清FBG、FINS、HbAlc 的檢測(cè) 所有動(dòng)物在取標(biāo)本前均禁食并自由飲水，禁食12 h 后，采用剪尾法從尾靜脈末梢取血0.2 mL 收集于干燥試管中，3 000 r/ min 離心15 min 后，取血清用于檢測(cè)。檢測(cè)藥物干預(yù)后的空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）及糖化血紅蛋白（HbAlc）的水平，其中FBG 使用葡萄糖氧化酶試劑盒檢測(cè)，F(xiàn)INS 采用胰島素放免試劑盒檢測(cè)，血清中HbAlc 使用相關(guān)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2 血脂水平的檢測(cè) 測(cè)量完小鼠空腹血糖后，從小鼠眼球部取血，取血后采用頸椎脫臼方法處死小鼠。全血室溫靜置3 h，以3 000 r/min 離心15 min，緩慢輕柔吸取上層血清樣品，利用試劑盒及酶標(biāo)儀分析血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平。

1.4.3 DNA 提取和測(cè)序 采用DNA 提取試劑盒提取各組小鼠結(jié)腸及盲腸內(nèi)容物中的微生物總DNA。對(duì)樣品進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、文庫(kù)制備與庫(kù)檢及 Miseq 上機(jī)測(cè)序。利用 overlap 將雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，并進(jìn)行質(zhì)控、嵌合體過(guò)濾，獲得高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)。由于序列數(shù)量龐大，本試驗(yàn)對(duì)最終獲得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行 97% 的相似度聚類(lèi)，為降低假陽(yáng)性率，會(huì)過(guò)濾 singleton 序列，獲得最終的 OTU 豐度及代表序列，進(jìn)一步進(jìn)行多樣性分析、主坐標(biāo)分析分析（principal coordinates analysis，PCoA）及微生物菌屬組成差異分析等。

1.4.4 短鏈脂肪酸含量的測(cè)定 從收集的糞便中取0.1 g 置于2 mL 離心管中，加500 μL 的飽和氯化鈉溶液，在冰浴條件下用打碎機(jī)打碎均勻，再加20 μL 10% H2SO4溶液，混合器振蕩混勻，到通風(fēng)櫥中加 500 μL 無(wú)水乙醚，混合器振蕩混勻，14 000 r/min 離心15 min，取上清液置于裝有0.25 g 無(wú)水硫酸鈉的2 mL離心管中，再以同樣的條件離心，取上清液置于氣相瓶中待測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生脈散對(duì)大鼠血糖的影響

與正常組比較，模型組大鼠的FBG、FINS、HbAlc水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，生脈散不同劑量組的FBG、FINS、HbAlc 水平均降低（P<0.01 或0.05），且其降糖作用隨劑量增加而增加，尤其是生脈散高劑量組，其效果與二甲雙胍組接近，提示生脈散可降低胰島素抵抗大鼠的血糖水平。見(jiàn)表1。

表1 生脈散對(duì)大鼠血糖的影響（,n=10）

表1 生脈散對(duì)大鼠血糖的影響（,n=10）

與正常組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.01，cP<0.05；與二甲雙胍組比較：dP<0.01；與生脈散低劑量組比較：eP<0.01，fP<0.05

2.2 生脈散對(duì)大鼠血脂水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠的模型組TC、TG、LDL-C 水平升高（P<0.01），HDL-C 水平降低（P<0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組和生脈散不同劑量組的TC、TG、LDL-C 水平降低，HDL-C 水平升高（P<0.01或0.05）；尤其是生脈散高劑量組，其降脂效果與辛伐他汀組基本一致，提示生脈散能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠血脂紊亂的現(xiàn)象。見(jiàn)表2。

表2 生脈散對(duì)大鼠血脂的影響（，n=10）

表2 生脈散對(duì)大鼠血脂的影響（，n=10）

與正常組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.01，cP<0.05；與辛伐他汀組比較：dP<0.01，eP<0.05；與生脈散低劑量組比較：fP<0.01，gP<0.05

2.3 生脈散對(duì)大鼠腸道菌群多樣性及組成的影響

正常組、模型組、生脈散低劑量組和生脈散高劑量組分別觀測(cè)到1 034、755、894 和971 個(gè)特有OTU數(shù)。與正常組比較，模型組的OTUs 數(shù)下降；而在大鼠接受不同劑量的生脈散后，OUTs 數(shù)目較模型組有一定程度提高。這表明生脈散有利于腸道菌群的恢復(fù)，豐富腸道菌群數(shù)。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠腸道菌群OTUs 分布的Venn 圖

Alpha 多樣性主要與種類(lèi)數(shù)目和多樣性相關(guān)，即豐富度和均勻性。菌群豐富度主要包括 Chao1 指數(shù)，而菌群均勻性主要包括Shannon 和Simpson 指數(shù)。與正常組相比，模型組的 Shannon 以及 Chao1 指數(shù)均降低（P<0.01），而生脈散組與模型組相比，能有效升高Chao1、Shannon 與Simpson 指數(shù)（P<0.01）。上述結(jié)果表明，生脈散可以有效防止糖尿病大鼠的腸道微生物群豐富度及多樣性的降低。見(jiàn)表3。

表3 生脈散對(duì)大鼠腸道菌群Alpha 多樣性的-影響（，n=10）

表3 生脈散對(duì)大鼠腸道菌群Alpha 多樣性的-影響（，n=10）

與正常組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.01

為比較微生物群落之間的差異，計(jì)算了β 多樣性并進(jìn)行主成分分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），其結(jié)果如圖2 所示。從圖2 可見(jiàn)，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)成分的貢獻(xiàn)率分別是45.39%和13.28%，提示分組關(guān)系較好。而各組（正常組、模型組、生脈散低劑量組和生脈散高劑量組）樣本點(diǎn)區(qū)別明顯，其中生脈散低劑量組和生脈散高劑量組與正常組樣本點(diǎn)距離小于模型組和正常組間的距離，說(shuō)明生脈散干預(yù)后的菌群結(jié)構(gòu)有向正常組的菌群結(jié)構(gòu)模式調(diào)節(jié)的趨勢(shì)。

圖2 大鼠腸道菌群β 多樣性的PCoA 圖

為進(jìn)一步評(píng)估腸道微生物群的組成變化，進(jìn)行了門(mén)水平的分類(lèi)學(xué)分析。在門(mén)水平上，與正常組比較，模型組腸道菌群中放線菌門(mén)和變形菌門(mén)豐度升高，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)豐度降低（P<0.01）。而與模型組相比，生脈散組使厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)豐度升高，放線菌門(mén)和變形菌門(mén)豐度降低（P<0.01 或0.05）。這表明生脈散可在一定程度上改善糖尿病大鼠體內(nèi)腸道菌群紊亂的狀態(tài)，誘導(dǎo)其腸道微生物組成恢復(fù)成正常大鼠狀態(tài)。見(jiàn)表4。

表4 生脈散對(duì)大鼠腸道菌群基于門(mén)水平的物種構(gòu)成影響（，n=10，%）

表4 生脈散對(duì)大鼠腸道菌群基于門(mén)水平的物種構(gòu)成影響（，n=10，%）

與正常組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.01，cP<0.05

2.4 生脈散對(duì)大鼠糞便中短鏈脂肪酸含量的影響

采用高效液相色譜法，考察了生脈散對(duì)大鼠糞便中SCFAs 含量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)灌胃高劑量生脈散后，大鼠糞便中的水分含量高于正常組，表明生脈散可能具有一定的潤(rùn)腸通便的功能；另外，大鼠糞便中SCFAs 的含量較正常組和模型組均有增加，表明生脈散能有效促進(jìn)大鼠腸道內(nèi)產(chǎn)SCFAs 細(xì)菌的增殖，增加SCFAs 的產(chǎn)生量。見(jiàn)表5。

表5 生脈散對(duì)大鼠糞便中SCFAs 含量的影響

3 討論

隨著人們生活方式尤其是飲食習(xí)慣的變化，使得諸如冠心病和糖尿病之類(lèi)的慢性代謝性疾病發(fā)病率增加[10]。糖尿病是由于體內(nèi)胰島素分泌缺陷而引發(fā)的以高血糖為特征的代謝性疾病，其中90%以上患者為T(mén)2DM。而胰島素抵抗被認(rèn)為是造成T2DM 的主要病理基礎(chǔ)和發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)，中藥復(fù)方因具有多成分、多靶點(diǎn)、毒性低、價(jià)格低、整體調(diào)節(jié)糖代謝、改善胰島素抵抗的作用而成為了研究熱點(diǎn)[11-13]。且臨床研究已證明，生脈散對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥有良好的防治作用[14]。本研究以傳統(tǒng)的中藥為切入口，使用生脈散對(duì)T2DM模型大鼠進(jìn)行治療，從腸道微生態(tài)的角度探討生脈散調(diào)節(jié)糖脂代謝治療 T2DM 的可能作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生脈散可以降低T2DM 模型大鼠的血糖以及HbAlc 水平，也可以調(diào)節(jié)血脂水平。同時(shí)通過(guò)16SrDNA 高通量測(cè)序法研究腸道微生物，大鼠腸道菌群的OTUs 分布結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組腸道菌群Chao1、Shannon、Simpson 指數(shù)均降低，表明模型組的腸道菌群豐度、多樣性均有降低；而生脈散低劑量與高劑量組中，Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)明顯回調(diào)，提示生脈散對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性有顯著改善且效果良好。此外，β 多樣性的PCoA 圖顯示，生脈散低劑量和高劑量組之間相互聚攏，表明生脈散低、高劑量這兩組在相應(yīng)的維度上菌群群落組成相似；而且生脈散低、高劑量?jī)山M有向正常組靠近的趨勢(shì)，提示大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成，在生脈散的干預(yù)下可以在一定程度上往正常大鼠菌群的結(jié)構(gòu)組成回調(diào)。

此外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在T2DM 患者腸道內(nèi)，厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比值與血糖水平呈正相關(guān)，而且這兩門(mén)菌群也是影響能量代謝平衡的主要群落[15-18]。因此我們?cè)陂T(mén)水平上評(píng)估了腸道微生物的群落變化，結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組的腸道菌群中放線菌門(mén)和變形菌門(mén)豐度明顯增加，擬桿菌門(mén)降低。作為腸道微生態(tài)失調(diào)的潛在生物標(biāo)志物，變形菌門(mén)相對(duì)豐度增加與體內(nèi)代謝紊亂有關(guān)聯(lián)，這一結(jié)果證實(shí)了模型組大鼠體內(nèi)出現(xiàn)了腸道菌群失調(diào)[19]。經(jīng)生脈散干預(yù)后，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)豐度升高，變形菌門(mén)豐度降低，說(shuō)明生脈散對(duì)T2DM 大鼠腸道菌群有一定改善作用。最后，本實(shí)驗(yàn)還考察了大鼠糞便中SCFAs 含量。SCFAs 主要包括乙酸、丙酸和丁酸，丙酸是擬桿菌門(mén)發(fā)酵的主要產(chǎn)物，可抑制膽固醇合成，丁酸是厚壁菌門(mén)發(fā)酵的主產(chǎn)物，可維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的SCFAs 含量較正常組少，而生脈散組SCFAs 含量顯著回調(diào)且高于正常組，表明生脈散可使產(chǎn)SCFAs 的菌群豐度增加。

綜上，生脈散能顯著調(diào)節(jié)T2DM 模型大鼠的血糖、HbAlc 和血脂水平，且能增加腸道厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)的豐度，降低變形菌門(mén)的豐度，生脈散改善糖脂代謝的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)體內(nèi)腸道菌群的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。