王倩,彭露,蘭曉玲,江雪梅,張麗霞,劉剛,劉偉

光動力治療(photodynamic therapy, PDT)有破壞生物分子并殺傷細(xì)胞或微生物的作用,在臨床中應(yīng)用廣泛。但近期研究發(fā)現(xiàn),低劑量PDT可對人體細(xì)胞起到增殖和功能改善的正向作用。PDT作為嫩膚手段已被廣泛認(rèn)可,近年有研究顯示低劑量PDT在改善皮膚光老化的同時(shí),亦增強(qiáng)了皮膚屏障功能,但其改善皮膚屏障的具體機(jī)制尚不明確[1]。一些重要的皮膚屏障蛋白,如中間絲相關(guān)蛋白、水通道蛋白及緊密連接蛋白等可在一定程度反映皮膚屏障功能,目前尚無低劑量5-氨基酮戊酸光動力療法(5-aminolevulinic acid-photodynamic therapy, ALA-PDT)影響皮膚屏障蛋白表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過研究低劑量ALA-PDT對人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)中皮膚屏障相關(guān)蛋白表達(dá)的影響來初步探討低劑量光動力改善皮膚屏障功能的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 HaCaT細(xì)胞,即永生化人角化細(xì)胞細(xì)胞系,經(jīng)多次傳代后仍保持正常分化能力,常用于人角質(zhì)形成細(xì)胞功能的研究(武漢普諾賽生命科技有限公司),ALA(西安天豐生物科技股份有限公司),含0.25%EDTA胰蛋白酶、MEM培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司),TRIZOL試劑、PerfectStart Green qPCRSuperMix及TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司),鼠抗人絲聚合蛋白(filaggrin,FLG)抗體、鼠抗人緊密連接蛋白(claudin-1,CLDN1)抗體[圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司],兔抗人內(nèi)皮蛋白(involucrin,IVL)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),兔抗人閉鎖蛋白(occludin,OCLN)抗體(杭州華安生物技術(shù)有限公司),兔抗人水通道蛋白(aquaporin,AQP3)抗體[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司],BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2主要儀器 半導(dǎo)體激光治療儀[(635±3) nm,武漢亞格光電技術(shù)有限公司]、激光功率計(jì)(長春鐳仕光電科技有限公司)、倒置顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量儀、Nanodrop及全功能酶標(biāo)儀MK3(美國ThermoFisher有限公司)。

1.3HaCaT細(xì)胞培養(yǎng) 使用含15%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的MEM培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng);細(xì)胞增殖至80%融合時(shí),以含0.25%EDTA胰蛋白酶消化細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL;將HaCaT細(xì)胞以5×103/孔的密度接種在96孔板中(內(nèi)含200 μL完全培養(yǎng)基),培養(yǎng)48 h后,待細(xì)胞達(dá)到60%～70%融合度時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4最適ALA濃度及照光劑量的摸索 將HaCaT細(xì)胞接種于96孔板中,細(xì)胞密度為4×104/孔,分別加入0、0.01、0.05、0.1、0.5及1 mmol/L濃度的 ALA孵育4.5 h,每個濃度設(shè)4個復(fù)孔,使用PBS洗3遍,每孔加入含0.45 mg 葡萄糖的PBS 200 μL,每個濃度分別予以0、0.5、1.85、3.72及10 J/cm2能量的輻照干預(yù)[(635±3) nm紅光,6.2 mW/cm2,均為到達(dá)細(xì)胞表面測得的功率密度],照射完成后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,進(jìn)行CCK-8檢測。

1.5HaCaT細(xì)胞活性檢測 按上述條件處理HaCaT細(xì)胞后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,在37 ℃繼續(xù)孵育1 h,使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度值,每組各重復(fù)3次。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR, qPCR)檢測皮膚屏障相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá) 用TRIZOL法提取各組HaCaT細(xì)胞的總RNA,Nanodrop測定RNA濃度及純度,取等量RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,得到對應(yīng)cDNA,再通過qPCR檢測皮膚屏障相關(guān)蛋白FLG、IVL、AQP3、CLDN1及OCLN的mRNA水平,qPCR引物序列見表1。反應(yīng)體系如下:2×PerfectStart Green qPCRSuperMix 10.0 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA模板1.0 μL,無核酸酶水8.2 μL。反應(yīng)條件:以95 ℃ 10 min預(yù)變性,95 ℃ 10 s變性,60 ℃ 30 s退火,72 ℃ 10 s延伸,重復(fù)40個循環(huán)。每個樣本設(shè)三個復(fù)孔,取其平均Ct值,以GAPDH為內(nèi)參,通過2-△△Ct計(jì)算mRNA相對表達(dá)量,共重復(fù)3次。

表1 皮膚屏障相關(guān)蛋白引物序列及產(chǎn)物大小

1.7Western blot檢測皮膚屏障相關(guān)蛋白在蛋白水平的表達(dá) 用含有蛋白酶抑制劑的RIPA法提取細(xì)胞總蛋白質(zhì),BCA法測定蛋白濃度,使用凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離,隨后將蛋白通過轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移至NC膜上,最后進(jìn)行封閉及一、二抗孵育。一抗稀釋比例如下: FLG 1∶200,IVL 1∶1 000,AQP3 1∶1 000,Claudin-1 1∶200,Occludin 1∶500,GAPDH 1∶10 000);用化學(xué)發(fā)光圖像分析成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光及圖像采集,結(jié)果以目的蛋白相對表達(dá)量表示。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白積分光密度值(IOD)/內(nèi)參積分光密度值(IOD)。

2 結(jié)果

2.1不同劑量ALA-PDT處理下HaCaT細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 HaCaT細(xì)胞接種48 h后使用倒置顯微鏡觀察,HaCaT細(xì)胞為貼壁狀態(tài),上皮細(xì)胞樣,匯合連接成片。0.1 mmol/L及以下濃度ALA聯(lián)合不同照光能量處理后對細(xì)胞形態(tài)及貼壁狀態(tài)無明顯影響;0.5 mmo/L及1 mmo/L ALA聯(lián)合1.85 J/cm2及以上照光能量時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)脫離貼壁狀態(tài),形態(tài)出現(xiàn)明顯皺縮,結(jié)構(gòu)不完整,細(xì)胞密度驟減,見圖1。

2.2不同劑量ALA-PDT對HaCaT細(xì)胞活力的影響 采用CCK-8法對細(xì)胞活力進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,ALA在0.1 mmol/L及以下濃度時(shí),予以不照光及不同照光能量處理對細(xì)胞活力影響均不大,甚至有促進(jìn)細(xì)胞活力的作用;在0.1 mmol/L ALA+3.72 J/cm2照光能量參數(shù)下具有最高促進(jìn)效應(yīng)。該參數(shù)處理與無處理(0 mmol/L ALA+0 J/cm2)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.877,P=0.000),為低劑量ALA-PDT促進(jìn)HaCaT細(xì)胞活力的最適ALA濃度及照光能量。而ALA濃度在0.5 mmo/L和1 mmo/L時(shí),照光能量為0.5 J/cm2時(shí)細(xì)胞存活率輕度下降,隨著照光能量繼續(xù)增大,細(xì)胞存活率明顯下降,絕大部分細(xì)胞死亡,見圖2。因此選取0.1 mmol/L濃度ALA及3.72 J/cm2照光能量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3低劑量ALA-PDT對皮膚屏障相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響 將HaCaT細(xì)胞分為對照組(無處理)、光照組(3.72 J/cm2紅光)、ALA組(0.1 mmol/L ALA)、低劑量PDT組(0.1 mmol/L ALA+3.72 J/cm2),分別予以相應(yīng)處理,48 h后qPCR檢測皮膚屏障相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,低劑量PDT組的FLG mRNA表達(dá)水平較對照組、光照組及ALA組均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.318,P=0.044);AQP3 mRNA在低劑量PDT組中的表達(dá)水平較對照組及ALA組均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.386,P=0.025); IVL、CLDN1及OCLN mRNA表達(dá)水平在幾組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表2。

2.4低劑量ALA-PDT對皮膚屏障相關(guān)蛋白在蛋白水平表達(dá)的影響 對照組、光照組、ALA組及低劑量PDT組經(jīng)過上述處理,48 h后Western-blot檢測皮膚屏障相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,FLG、IVL、AQP3及Claudin-1蛋白表達(dá)水平在低劑量PDT組均明顯高于空白組、光照組及ALA組(F=8.800、17.222、13.684、5.898,P=0.006、0.001、0.002、0.020);Occludin的蛋白表達(dá)水平在幾組細(xì)胞中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.195,P=0.166),見圖3。

圖2 不同劑量ALA-PDT對HaCaT細(xì)胞活力的影響

表2 不同處理后HaCaT細(xì)胞中FLG、IVL、AQP3、CLDN1及OCLN mRNA的相對表達(dá)量

Note:*P<0.05,**P<0.01 vs.low-dose PDT;NS indicated no significance.

3 討論

光動力技術(shù)是利用光敏劑作為介導(dǎo),將特定波長光的能量傳遞到靶組織的光化學(xué)反應(yīng)技術(shù)。由于PDT靶向選擇性高、創(chuàng)傷小、美容效果好等優(yōu)勢,近年來在臨床中得到廣泛應(yīng)用。在皮膚科,PDT主要用于治療皮膚腫瘤、痤瘡、尖銳濕疣等疾病,均是利用PDT對異常增生細(xì)胞或病原體的殺傷作用。但近年研究發(fā)現(xiàn),除了常規(guī)劑量PDT對細(xì)胞的殺傷作用,低劑量PDT可在促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化、啟動和維持重塑等方面起到正向作用[2-3]。近年來低劑量PDT已被較多地用于皮膚年輕化的治療,取得了良好療效并且疼痛等副作用輕微[4-6]。有趣的是,在低劑量PDT改善光老化的研究中,有研究發(fā)現(xiàn)它能同時(shí)改善皮膚屏障功能,使受試者的角質(zhì)層含水量增加、經(jīng)皮水丟失減少[7-9]。理論上來說,位于皮膚最外層的角質(zhì)層由于直接接觸光敏劑并且離輻射最近,所以臨床進(jìn)行光動力治療時(shí)難以避免出現(xiàn)局部皮膚的紅腫與脫屑,在短期內(nèi)對表皮的屏障功能并無益處。目前這些試驗(yàn),幾乎是在療程結(jié)束后數(shù)周至數(shù)月后觀察到的結(jié)果。其中有學(xué)者提到,PDT治療區(qū)域在隨訪初期顯示出一過性的角質(zhì)層含水量降低和經(jīng)皮水分流失增多,反映了皮膚屏障損傷,但該兩項(xiàng)指標(biāo)在隨訪后期均優(yōu)于治療前水平,說明光動力治療對皮膚屏障最終為有利影響[9]。所以,在這些研究中,皮膚屏障功能指標(biāo)的提升是PDT治療的后期效應(yīng)。有學(xué)者認(rèn)為這可能與PDT清除異常的表皮細(xì)胞使得表皮細(xì)胞趨于正?；嘘P(guān)[1]。

平常所說的皮膚屏障通常是指狹義的皮膚屏障,即物理性屏障結(jié)構(gòu),由角質(zhì)層和緊密連接構(gòu)成,兩者共同阻止了外部抗原由外向內(nèi)的滲透或內(nèi)部成分由內(nèi)而外的泄漏[10]。皮膚屏障中的多種關(guān)鍵蛋白對于維持正常的屏障功能非常重要,如中間絲相關(guān)蛋白(FLG、IVL等)、水通道蛋白(AQP3等)、緊密連接蛋白(Claudin-1、Occludin等)[11-14]。FLG與角蛋白中間絲相互作用形成致密的角蛋白纖維束,IVL是角質(zhì)化包膜的重要組成部分,角質(zhì)化包膜包裹角蛋白纖維束形成不溶性的角質(zhì)屏障結(jié)構(gòu)。AQP3是細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水、甘油、尿素等小分子物質(zhì),在皮膚水合、維護(hù)皮膚屏障等方面也有重要作用。緊密連接的主要組成部分包括Claudin蛋白、Occludin蛋白等,可參與維持緊密連接的柵欄功能及細(xì)胞旁彌散等。皮膚屏障相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)及功能障礙可能導(dǎo)致屏障損傷、表皮炎癥反應(yīng)及影響表皮分化等。那么是否可以將光動力的參數(shù)設(shè)置到足夠低的劑量,使其對上訴這些重要的皮膚屏障蛋白的表達(dá)直接產(chǎn)生影響,從而起到短期內(nèi)改善皮膚屏障的作用呢?

低劑量PDT通常是指低濃度的光敏劑和/或低水平光照劑量,但其具體參數(shù)并無確切標(biāo)準(zhǔn)。既往有學(xué)者認(rèn)為是具有亞致死性的光敏劑和/或光的PDT,具有免疫調(diào)節(jié)作用,能保持細(xì)胞活力完好[15]。文獻(xiàn)報(bào)道,對于HaCaT細(xì)胞,使用0.1 mmol/L ALA甲酯孵育5 h,在細(xì)胞培養(yǎng)位置獲得3.72 J/cm2LED紅光的照光能量可以起到促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果,并且不會產(chǎn)生遺傳毒性損傷[16-17]。Jang等[18]發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L ALA孵育30 min并照射3 J/cm2紅光的低劑量ALA-PDT促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖,這是由于在該P(yáng)DT條件下,細(xì)胞內(nèi)低水平活性氧的產(chǎn)生誘導(dǎo)了成纖維細(xì)胞ERK通路激活的延長。Chen等[19]的研究結(jié)果顯示低劑量ALA-PDT(0.1 mmol/L ALA+21 J/cm2) 通過 Nrf2介導(dǎo)的抗氧化作用減少UVA介導(dǎo)的光老化。還有研究顯示,使用0.1 mmol/L ALA和4 J/cm2635 nm紅光處理表皮干細(xì)胞可使細(xì)胞遷移率顯著增高[20]。以上研究均說明適當(dāng)?shù)牡蛣┝縋DT參數(shù)可對細(xì)胞產(chǎn)生直接正向效應(yīng)。該研究也發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L ALA及3.72 J/cm2輻照能量[(635±3) nm紅光]是能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞活力的最適ALA濃度及照光劑量,所以筆者利用此參數(shù)在體外初步研究低劑量PDT對皮膚屏障蛋白的影響。

本研究顯示,在此參數(shù)設(shè)置的低劑量ALA-PDT的作用下,HaCaT細(xì)胞中FLG及AQP3 mRNA相對表達(dá)量較對照組、光照組及ALA組明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,IVL、CLDN1及OCLN mRNA表達(dá)量也有上升趨勢,從轉(zhuǎn)錄組水平證明了低劑量ALA-PDT對一些重要的皮膚屏障蛋白的有益作用。同時(shí)采用Western blot進(jìn)行蛋白水平的驗(yàn)證,結(jié)果顯示低劑量ALA-PDT對于促進(jìn)皮膚屏障蛋白表達(dá)的優(yōu)勢依然存在,除了Occludin外,低劑量PDT組HaCaT細(xì)胞中FLG、IVL、AQP3、Claudin-1蛋白表達(dá)的水平均較其余幾組顯著升高,進(jìn)一步從蛋白水平證實(shí)了低劑量PDT可以直接促進(jìn)部分皮膚屏障蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果說明,足夠低劑量的PDT可能直接作用于表皮屏障功能的主要載體角質(zhì)形成細(xì)胞,通過提高FLG、IVL、AQP3、Claudin-1等重要的皮膚屏障蛋白水平來促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分化、維持皮膚水合、穩(wěn)定細(xì)胞連接,從而達(dá)到改善皮膚屏障功能的作用。

綜上所述,0.1 mmol/L ALA及3.72 J/cm2紅光的低劑量光動力能直接促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的活力;該低劑量ALA-PDT可能直接通過提高HaCaT細(xì)胞中FLG、IVL、AQP3、Claudin-1等關(guān)鍵的皮膚屏障蛋白的表達(dá)來改善皮膚屏障功能,但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。