雷 宇，郭一慧，許家威，程緯民，何 艾，曾 清，陸海頌

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種以骨髓中單克隆漿細(xì)胞惡性增殖為特征的漿細(xì)胞疾病，其主要臨床表現(xiàn)為骨痛、骨質(zhì)破壞、腎功能不全、高鈣血癥及貧血[1]。MM發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢，目前估計(jì)全球發(fā)病率為7/10萬，比1975年增加143%。隨著免疫調(diào)節(jié)劑、蛋白酶體抑制劑、抗體類、具有新型作用機(jī)制的靶向藥物及嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）等治療手段的普及，患者的生存期顯著延長，MM中位生存期現(xiàn)為7～10年[2]。由于醫(yī)療費(fèi)用高昂，臨床患者仍多選擇多次長期誘導(dǎo)化療及對癥治療，隨之而來的毒副作用、易復(fù)發(fā)、療效不理想等問題常使療程受到中斷[3-4]。我們迫切需要開發(fā)療效確切并且毒副作用小的中藥復(fù)方來減輕治療毒副反應(yīng)，從而達(dá)到改善患者預(yù)后的目的?；谥嗅t(yī)“扶正祛邪”“標(biāo)本兼治”理論開發(fā)的毒結(jié)清復(fù)方，是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院根據(jù)多年治療腫瘤的臨床經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合當(dāng)?shù)蒯t(yī)家治療癌病的驗(yàn)方制成的院內(nèi)制劑。該制劑具有化瘀毒、散癌結(jié)、益氣陰、健脾腎之功效。臨床研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，毒結(jié)清復(fù)方可較好地改善骨髓瘤患者的骨痛癥狀。基礎(chǔ)研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，除治療骨髓瘤外，毒結(jié)清復(fù)方還可以通過去甲基化來抑制肺癌小鼠體內(nèi)腫瘤的增殖。因此，考慮毒結(jié)清具有多靶點(diǎn)、多通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討毒結(jié)清復(fù)方治療MM的機(jī)制，旨在為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件 （1）中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）；（2）高通量中藥實(shí)驗(yàn)和參考數(shù)據(jù)庫（本草組鑒，https://www.herb.ac.cn）；（3）UniProt全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫（UniProt，https://www.uniprot.org/）；人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https://www.genecards.org）；（4）功能蛋白結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（String，https://www.string-db.org）；（5）R語言（version 3.4.1）；（6）軟件Cytoscape 3.8。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 RPMI-8226細(xì)胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司，于-180 ℃液氮環(huán)境下保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量為（200±20）g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0014，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，自由攝食飲水，飼料和飲用水均高壓消毒，所用大鼠實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后開展實(shí)驗(yàn)，批準(zhǔn)編號：approval NO.DW20220511-079。

1.4 藥物與試劑 毒結(jié)清復(fù)方，方藥組成：人參10 g，黃芪20 g，補(bǔ)骨脂15 g，菟絲子15 g，白術(shù)30 g，薏苡仁15 g，當(dāng)歸10 g，三七8 g，沉香1.5 g，川芎10 g，蟾皮5 g，土鱉蟲5 g，蘄蛇10 g，佛手8 g，解毒草20 g，土茯苓30 g，八角蓮20 g，白花蛇舌草20 g，八月札10 g，山慈菇10 g，蜈蚣半條。上述中藥飲片均購于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部文雋主任藥師鑒定合格。胎牛血清（批號：12B052）購自ExCell Bio公司；青鏈霉素混合液（批號：P1400）購自Solarbio公司；CCK8試劑（批號：BS350B）購自Biosharp公司；兔抗人β連接蛋白（β-catenin）一抗（批號：00103090）、兔抗人Wnt1一抗（批號：00095183）、兔抗人周期蛋白D1（cyclinD1）一抗（批號：10016419）均購自Proteintech公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH-抗）（批號：22004515）、山羊抗GAPDH兔IgG HRP標(biāo)記二抗（批號：22004515）均購自Biosharp公司。

1.5 主要儀器 Mini-protean tetra蛋白垂直電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；TY-201-01 M-Blot快速轉(zhuǎn)膜儀（南京中科通儀科技有限公司）；Multiskan FC酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；AI 600多功能成像儀（美國GE公司）。

2 方 法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

2.1.1 獲取毒結(jié)清復(fù)方中藥物的活性成分與靶標(biāo)蛋白 將毒結(jié)清復(fù)方中的“人參”“黃芪”“補(bǔ)骨脂”“菟絲子”“白術(shù)”“薏苡 仁”“當(dāng) 歸”“三 七”“沉 香”“川 芎”“蜈 蚣”“蟾 皮”“土 鱉 蟲”“蘄蛇”“佛手”“解毒草”“土茯苓”“八角蓮”“白花蛇舌草”“八月札”“山慈菇”輸入TCMSP中，設(shè)定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，篩選出該方每味中藥的有效成分及其對應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。未收錄在TCMSP的中藥，利用本草組鑒數(shù)據(jù)庫搜索獲取中藥對應(yīng)成分，再將成分輸入至TCMSP，根據(jù)成分對應(yīng)的OB及DL值，篩選具有活性的中藥成分，并獲取該成分相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。利用Uniprot的Swiss-Prot子數(shù)據(jù)庫對上述獲得的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范化注釋，獲取靶標(biāo)蛋白對應(yīng)的基因名稱。

2.1.2 篩選MM疾病靶點(diǎn) 以“Multiple Myeloma”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索，得到MM疾病靶點(diǎn)。

2.1.3 潛在治療靶點(diǎn)獲取與蛋白交互網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 在R語言環(huán)境下，將毒結(jié)清復(fù)方的靶標(biāo)蛋白與MM疾病靶點(diǎn)基因取交集，得到交集靶點(diǎn)，即毒結(jié)清復(fù)方治療MM的潛在治療靶點(diǎn)，在線繪制韋恩圖將交集靶點(diǎn)可視化。將潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫中，將最低交互要求分?jǐn)?shù)設(shè)為0.9，構(gòu)建交集靶點(diǎn)的蛋白交互網(wǎng)絡(luò)（PPI），使用Cytoscape插件Cytohubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)計(jì)算拓?fù)鋮?shù)[最大團(tuán)中心性（maximal clique centrality, MCC）、節(jié)點(diǎn)度值（degree centrality, DC）、接近中心度（closeness centrality, CC）、介數(shù)中心度（betweenness centrality, BC）]值，若交集靶點(diǎn)的以上4個(gè)參數(shù)值均大于各參數(shù)均值，即為核心靶點(diǎn)。

2.1.4 核心靶點(diǎn)的富集分析 利用R語言中的clusterProfiler包，對核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG富集分析，設(shè)置P<0.05，并根據(jù)P值大小，對結(jié)果升序排序，將前20條目結(jié)果可視化。

2.2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)，2～3 d換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到3×105～2×106個(gè)/mL，以1∶3傳代。取處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

通過南通地名變遷，考察南通社會(huì)的發(fā)展變遷，社會(huì)進(jìn)步，從而產(chǎn)生對社會(huì)的認(rèn)可、對社會(huì)制度的理解、對社會(huì)環(huán)境資源配置的厚重感。南通從條件惡劣轉(zhuǎn)變?yōu)椴皇軞夂蛱鞛?zāi)影響，從最偏僻唯恐避之不及的邊疆轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣酱蚬ふ邞汛粝胱分鹬?，從只能從事圍土晾曬的制鹽業(yè)發(fā)展到農(nóng)工商各行業(yè)發(fā)達(dá)；從少有文明種子播撒的蠻荒之地進(jìn)化為尊師重教已經(jīng)內(nèi)化為傳統(tǒng)習(xí)俗的文明之所，通過歷史演變激發(fā)可以民眾愛家鄉(xiāng)愛國熱情。

2.2.2 血清制備 毒結(jié)清復(fù)方水煎劑的制備：將毒結(jié)清復(fù)方按照原方劑量稱取，加10倍量純水，浸泡30 min，煎煮30 min，過濾并收集原藥液。剩余藥渣中再加入8倍量純水，煎煮20 min，過濾并收集濾液，此過程重復(fù)2次。合并3次濾液，濃縮至生藥濃度為1.4 g/mL的毒結(jié)清復(fù)方水煎劑，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

20只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，并隨機(jī)分為毒結(jié)清復(fù)方組、正常組，每組10只。毒結(jié)清復(fù)方組大鼠灌胃給予2 mL 1.4 g/mL毒結(jié)清復(fù)方水煎劑；正常組大鼠灌胃2 mL PBS，2次/d，連續(xù)7 d。末次灌胃后2 h，麻醉下于無菌環(huán)境下腹主動(dòng)脈采血。全血于室溫靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，取出上層血清，于56 ℃水浴30 min滅活，-80 ℃冰箱貯藏，備用。使用RPMI-1640培養(yǎng)液配置含有20%、10%、5%含藥血清的培養(yǎng)液，0.22 μm濾膜過濾除菌后使用。

2.2.3 CCK-8法檢測RPMI-8226細(xì)胞活力 取處于對數(shù)生長期的RPMI-8226細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，每孔100 μL細(xì)胞液接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中適應(yīng)性培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分組，每組分別加入20%、10%、5%含藥血清，分別命名為高劑量組、中劑量組、低劑量組；設(shè)置對照組，加入10%空白血清。每組5個(gè)復(fù)孔。放置于37 ℃、5% CO2的恒溫箱培養(yǎng)，分別培養(yǎng)12、24、36 h后取出細(xì)胞，每孔中加入CCK-8試劑10 μL，避光，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，通過酶標(biāo)儀在450 nm處檢測細(xì)胞吸光度（OD）值。并通過公式計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=（A0-A1）/（A2-A3）×100%，其中A0代表含有細(xì)胞、含藥血清和CCK-8溶液孔的OD值；A1代表無細(xì)胞，含有含藥血清和CCK-8溶液孔的OD值；A2代表含有細(xì)胞、空白血清和CCK-8溶液孔的OD值；A3代表無細(xì)胞，含有空白血清和CCK-8溶液孔的OD值。

2.2.4 ELISA檢測Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量 取處于對數(shù)生長期的RPMI-8226細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，每孔100 μL細(xì)胞液接種于96孔板中，為避免骨髓瘤細(xì)胞自分泌IL-6對細(xì)胞增殖的干擾，首先各組中加入IL-6 1.0 ng/mL單抗中和骨髓瘤分泌的IL-6，靜置中和4 h后隨機(jī)分組，每組分別加入20%、10%、5%含藥血清，分別命名為高劑量組、中劑量組、低劑量組，并設(shè)置對照組，加入10%空白血清。每組5個(gè)復(fù)孔。24 h后收集各組細(xì)胞上清液或細(xì)胞裂解液，使用ELISA試劑盒檢測Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量。具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。

2.2.5 Western blotting檢測Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白相對表達(dá)量 取處于對數(shù)生長期的RPMI-8226細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為3×105個(gè)/mL，每孔2 mL，細(xì)胞液接種于6孔板中，靜置中和4 h后隨機(jī)分組，每組分別加入20%、10%、5%含藥血清，分別命名為高劑量組、中劑量組、低劑量組，并設(shè)置對照組，采用ECL化學(xué)發(fā)光顯影劑于顯影儀中顯影。收集圖片，采用Image J軟件對圖片處理，計(jì)算各目標(biāo)蛋白條帶的灰度值，后續(xù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白相對表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，兩樣本比較采用成組t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果

圖1 毒結(jié)清復(fù)方有效成分與多發(fā)性骨髓瘤疾病靶點(diǎn)韋恩圖

3.1.2 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn) 將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，以高可信度選項(xiàng)構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)。（見圖2）利用多個(gè)拓?fù)鋮?shù)比單用Degree參數(shù)更能客觀地反映節(jié)點(diǎn)的重要性，故本研究利用Cytoscape插件Cytohubba算PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，得到MCC、DC、CC、BC參數(shù)值。各參數(shù)值均數(shù)分別為7 003.02、9.74、62.42、298.67。以靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)大于均數(shù)為篩選規(guī)則，從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選得到13個(gè)核心靶點(diǎn)。（見表1）

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）

表1 PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)

3.1.3 交集靶點(diǎn)富集分析 在R語言環(huán)境下利用clusterProfiler包，導(dǎo)入148個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，得到KEGG富集結(jié)果155條，根據(jù)校正P值及Count數(shù)，以氣泡圖形式可視化前20條。（見圖3）其中包括低氧誘導(dǎo)因子1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、細(xì)胞衰老（Cellular senescence）等與MM疾病進(jìn)展與治療效果密切相關(guān)的通路。結(jié)合Pubmed、Google Scholar檢索查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，除了可視化的20條通路外，其余135條結(jié)果中包含有Ras信號通路（Ras signaling pathway）、NF-κB信號通路（NF-κB signaling pathway）、JAK-STAT信號通路（JAK-STAT signaling pathway）、mTOR信號通路（mTOR signaling pathway）、Wnt信號通路（Wnt signaling pathway）等與MM疾病密切相關(guān)的通路，表明毒結(jié)清復(fù)方可能通過多條通路起到治療MM的作用。在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在參與骨髓瘤的增殖和骨破壞中起非常重要的作用[9-10]。目前研究中發(fā)現(xiàn)該通路的作用機(jī)制和效應(yīng)遠(yuǎn)比可視化圖排位重要得多，故認(rèn)為毒結(jié)清復(fù)方可能通過Wnt信號通路起到治療MM的作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究也圍繞Wnt信號通路開展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖3 交集靶點(diǎn)KEGG 富集分析

GO富集分析得到生物過程1 682條，分子功能98條，細(xì)胞成分36條，分別以氣泡圖可視化前20條。（見圖4）生物過程主要包括內(nèi)毒素應(yīng)答（response to lipopolysaccharide）、對細(xì)菌源分子的應(yīng)答（response to molecule of bacterial origin）、對營養(yǎng)水平的應(yīng)答（response to nutrient levels）、對氧水平的應(yīng)答反應(yīng)（response to oxygen levels）、氧化應(yīng)激反應(yīng)（response to oxidative stress）、對抗生素的應(yīng)答反應(yīng)（response to antibiotic）、缺氧應(yīng)激反應(yīng)（response to hypoxia）、對低氧水平的應(yīng)答（response to decreased oxygen levels）等條目，這些條目主要與體內(nèi)氧水平及細(xì)菌感染相關(guān)。分子功能主要包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、信號分子（receptor ligand activity）、信號受體激活物的活性（signaling receptor activator activity）、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding）等。細(xì)胞成分主要包括細(xì)胞膜（membrane region）、染色質(zhì)（nuclear chromatin）、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體（transcription regulator complex）等。

圖4 交集靶點(diǎn)GO 富集分析

3.1.4 構(gòu)建“中藥-有效成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò) 利用上述過程得到的中藥及中藥有效成分、交集靶點(diǎn)和KEGG富集分析結(jié)果構(gòu)建“中藥-有效成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。（見圖5）

圖5“中藥-有效成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3.2 體外實(shí)驗(yàn)研究

3.2.1 毒結(jié)清復(fù)方對RPMI-8226細(xì)胞活力的影響 與對照組比較，低、中、高劑量組RPMI-8226細(xì)胞12、24、36 h的OD值均明顯降低（P<0.05），且存在劑量依賴性，即高劑量組RPMI-8226細(xì)胞12、24、36 h的OD值均低于中劑量組（P<0.05），中劑量組RPMI-8226細(xì)胞12、24、36 h的OD值均低于低劑量組（P<0.05）。（見圖6）

圖6 各組RPMI-8226 細(xì)胞OD 值比較 （±s，n=5）

3.2.2 各組RPMI-8226細(xì)胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量比較 與對照組比較，低、中、高劑量組RPMI-8226細(xì)胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量均明顯降低（P<0.05），且呈劑量依賴性；高劑量組RPMI-8226細(xì)胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量均明顯低于中劑量組（P<0.05）；中劑量組RPMI-8226細(xì)胞β-catenin、cyclin D1蛋白含量均明顯低于低劑量組（P<0.05），Wnt1蛋白含量與低劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見表2）

表2 各組RPMI-8226 細(xì)胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量比較 （±s，pg/mL）

表2 各組RPMI-8226 細(xì)胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量比較 （±s，pg/mL）

注：與對照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05

組別 n Wnt1 β-catenin cyclin-D1對照組 5 213.80±7.82 859.12±29.27 315.67±11.58低劑量組 5 124.77±1.96a 687.28±29.62a 288.42±9.81a中劑量組 5 122.40±7.28a 615.88±26.38a b 240.47±0.63a b高劑量組 5 111.82±7.75a bc 552.61±29.00a bc 188.45±0.90a bc F 252.415 106.922 165.364 P 0.000 0.000 0.000

3.2.3 各組RPMI-8226細(xì)胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白相對量比較 與對照組比較，低、中、高劑量組RPMI-8226細(xì)胞β-catenin蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P<0.05），且高劑量組RPMI-8226細(xì)胞β-catenin蛋白相對表達(dá)量明顯低于低劑量組（P<0.05）。與對照組比較，中、高劑量組RPMI-8226細(xì)胞Wnt1、cyclin D1蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P<0.05），高劑量組RPMI-8226細(xì)胞Wnt1、cyclin D1蛋白相對表達(dá)量均明顯低于低劑量組（P<0.05）；高劑量組RPMI-8226細(xì)胞Wnt1蛋白相對表達(dá)量明顯低于中劑量組（P<0.05）。（見圖7、表3）

圖7 各組RPMI-8226 細(xì)胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

表3 各組RPMI-8226 細(xì)胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1 蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表3 各組RPMI-8226 細(xì)胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1 蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05

組別 n β-catenin Wnt1 cyclinD1對照組 3 1.00±0.09 1.00±0.11 1.00±0.02低劑量組 3 0.62±0.13a 0.94±0.07 0.94±0.06中劑量組 3 0.49±0.04a 0.69±0.09a b 0.78±0.05a高劑量組 3 0.39±0.04a b 0 .48±0.12a b c 0.71±0.09a b F 29.061 17.576 141.100 P 0.000 0.001 0.001

4 討 論

中醫(yī)學(xué)根據(jù)MM臨床癥狀，將其歸屬于“骨痹”“骨蝕”“虛勞”的范疇，認(rèn)為本病乃本虛標(biāo)實(shí)之證，以肝、脾、腎三臟虧損為本，痰、濕、毒蘊(yùn)、血瘀為標(biāo)[9]。近代許多醫(yī)家應(yīng)用中藥、中成藥治療MM及相關(guān)外周神經(jīng)并發(fā)癥取得了良好的療效[10-12]。中醫(yī)血液學(xué)專家應(yīng)用補(bǔ)腎通絡(luò)、祛瘀消瘤法治療骨髓瘤髓外病變?nèi)〉妹黠@療效，對于髓外病變，施以馬錢子、黃鼠骨粉聯(lián)合中藥內(nèi)服可達(dá)到縮小局部軟組織腫瘤的效果[13-15]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，利用KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)毒結(jié)清復(fù)方對MM的治療作用可能是通過調(diào)控Wnt1、NF-κB、PI3K/AKT、AP-1和MAPK等多通路起到治療MM疾病的作用[16-17]。Wnt通路及其下游sclerostin蛋白在骨髓瘤腫瘤增殖和骨破壞發(fā)揮重要作用，因此，本研究重點(diǎn)探討該通路及其相關(guān)蛋白表達(dá)。

Cyclin D1蛋白是Wnt信號通路下游的轉(zhuǎn)錄蛋白。Wnt信號通路是高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在正常情況下，其不存在Wnt配體，β-catenin主要被糖原合成酶激酶3（GSK3）和酪蛋白激酶1α（CK1α）磷酸化，并被E3泛素蛋白連接酶泛素化后降解。當(dāng)Wnt/β-bcatenin信號通路異常激活時(shí)，大量的Wnt蛋白與其受體結(jié)合，抑制GSK-3b活性及β-catenin降解，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的積累。當(dāng)β-catenin濃度達(dá)到一定水平時(shí)，其可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)Wnt靶基因如癌基因Myc、Cyclin D1的表達(dá)[18]。Wnt/β-catenin信號通路及下游CCND1轉(zhuǎn)錄蛋白通過調(diào)節(jié)MM細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和遷移參與MM的發(fā)病機(jī)制。GUO B L等[19]研究發(fā)現(xiàn)在MM患者體內(nèi)過表達(dá)miR-744-5p可以靶向癌癥相關(guān)蛋白SOX12而抑制Wnt/βcatenin信號通路，進(jìn)而抑制MM細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。多個(gè)臨床前MM模型研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Wnt信號抑制劑（DKK1、SFRP-2、sclerostin）可增加成骨細(xì)胞的形成，減少溶骨性病變[17,20-21]。Wnt信號通路一方面參與MM細(xì)胞的增殖、遷移，另一方面在骨生長、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)cyclinD1只有在高劑量干預(yù)下才與對照組有差異，這表明要克服增殖旺盛的細(xì)胞需要高劑量毒結(jié)清復(fù)方干預(yù)才能實(shí)現(xiàn)。

本研究結(jié)果表明，毒結(jié)清復(fù)方可降低RPMI-8226細(xì)胞活力，抑制其增殖，并且抑制作用和時(shí)間呈濃度依賴，同時(shí)發(fā)現(xiàn)毒結(jié)清含藥血清可以抑制骨髓瘤細(xì)胞株RPMI-8226細(xì)胞wnt/β-bcatenin信號通路中Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白濃度。因此推測在Wnt經(jīng)典信號通路中，毒結(jié)清是通過降低β-catenin蛋白濃度，從而減少轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核中的β-catenin數(shù)量，使β-catenin的數(shù)量減少從而導(dǎo)致cyclin D1蛋白轉(zhuǎn)錄減少。cyclin D1轉(zhuǎn)錄減少就會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更多停留在G0期，腫瘤細(xì)胞繁殖減慢，從而達(dá)到減少腫瘤負(fù)荷的目的。毒結(jié)清復(fù)方中槲皮素為主要抗骨髓瘤成分，類似柚皮素抗骨髓瘤增殖的實(shí)驗(yàn)在多通路中也有驗(yàn)證。徐亞文等[24]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素在骨髓瘤細(xì)胞株中通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯而發(fā)揮抗腫瘤作用。楊軍嶺等[25]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠通過抑制NF-κB信號通路而降低骨髓瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。據(jù)此本研究推測：毒結(jié)清復(fù)方通過多靶點(diǎn)、多通路對骨髓瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制作用，從而達(dá)到治療目的。

IL-6可促進(jìn)MM細(xì)胞生長，引起機(jī)體免疫紊亂及病理損傷，使機(jī)體腫瘤負(fù)荷持續(xù)增加，貧血和骨病持續(xù)加重。骨硬化蛋白（sclerostin）是一種來源于骨細(xì)胞的分泌蛋白，它可以通過抑制Wnt/β-catenin通路來抑制骨的形成，同時(shí)受到多種細(xì)胞因子及mRNA等多因素調(diào)控。β2-微球蛋白（β2-MG）與MM細(xì)胞的克隆及增殖活性相關(guān)，能直接反映患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷。毒結(jié)清復(fù)方聯(lián)合化療可降低MM患者體內(nèi)血鈣、sclerostin、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、C反應(yīng)蛋白（CRP）及β2-MG水平，從而有效緩解MM患者骨痛癥狀，抑制腫瘤進(jìn)展[6,26-27]。本研究推測毒結(jié)清在對MM細(xì)胞的抑制作用過程中是多方面、多通路的抑制作用，而Wnt1/β-catenin是一條重要的通路。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對毒結(jié)清復(fù)方與MM疾病靶點(diǎn)間復(fù)雜的網(wǎng)狀關(guān)系進(jìn)行研究，預(yù)測藥物主要活性成分、作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路，最后通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測。下一步我們將通過提取患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞對毒結(jié)清復(fù)方治療MM的作用進(jìn)行進(jìn)一步確證，以期得到治療骨髓瘤有效的機(jī)制探討。