關文靈　張海立　榮輝　孟靜

關鍵詞：墨脫花椒；休眠解除；種子萌發(fā)；物理休眠；生理休眠

中圖分類號：S573 文獻標識碼：A

墨脫花椒（Zanthoxylum motuoense）為蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum）落葉小喬木，產(chǎn)于西藏墨脫縣境內(nèi)，分布于海拔1000～1900 m的亞熱帶濕潤氣候地帶[1]。其果實和葉片具有濃郁的香氣，果實是西藏地區(qū)常用的香辛調(diào)料，用于烹制牦牛肉等食物。由于其風味獨特，深受西藏人民的喜愛，主要用作烹飪調(diào)料，具有較高的經(jīng)濟價值和開發(fā)潛力，目前已成為墨脫縣重點發(fā)展的特色經(jīng)濟林木[2]。由于墨脫花椒自然繁殖系數(shù)低，人工繁育困難，想要產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，僅靠對野生資源的挖掘移栽不能滿足市場需要，種苗缺乏問題亟待解決。因此，解決墨脫花椒的人工繁育問題，對墨脫花椒的種質(zhì)資源保護及開發(fā)利用具有深遠的意義。播種育苗具有繁殖系數(shù)高、操作方便的優(yōu)點，但墨脫花椒種子存在休眠現(xiàn)象，自然條件下萌發(fā)困難，發(fā)芽率極低。有關墨脫花椒種子萌發(fā)特性的研究未見報道，只有對其分類學、形態(tài)學及扦插育苗技術[2]的相關研究報道。為了探究墨脫花椒種子的休眠原因和萌發(fā)特性，本研究以墨脫花椒種子為研究對象，通過對種子吸水性和萌發(fā)抑制物質(zhì)的研究，探討墨脫花椒種子休眠的原因；采用單因素試驗設計探究不同溫度和光照對種子萌發(fā)的影響，設置濃硫酸和GA3組合處理試驗，篩選破除種子休眠及促進萌發(fā)的最佳處理方案，為墨脫花椒的播種育苗及綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的墨脫花椒種子于2017 年10 月采收于西藏自治區(qū)林芝市墨脫縣，將新鮮果實帶回實驗室晾干后去除果皮和雜質(zhì)，收集純凈的種子干燥條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 種子形態(tài) 隨機取10 粒種子，在體式顯微鏡下觀測種子形狀、顏色以及橫縱軸直徑，將種子沿中心線切成兩半，觀察種子內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)，重復3 次。

1.2.2 種子空殼率 采用水選法。隨機取100 粒種子，放入盛有水的燒杯中，用玻璃棒適當攪拌，讓全部種子充分浸沒在水中，5 min 后統(tǒng)計上浮種子占試驗種子的百分比，重復3 次。將下沉種子自然晾干備用。

1.2.3 種子千粒重 采用百粒法測千粒重[3]。從篩選后種子中隨機取100 粒為1 組，共取8 組，分別稱重，計算平均質(zhì)量，轉(zhuǎn)換成千粒重。

1.2.4 種子含水量 采用103 ℃低恒溫干燥法[4]。從篩選后的種子中隨機取30 粒為一組，在103 ℃烘干箱中將樣品盒及盒蓋質(zhì)量烘干至不再變化，再稱取樣品盒和盒蓋的重量M1，稱取樣品盒和盒蓋及樣品的烘前總重量M2，放入103 ℃烘干箱烘12 h，再取出稱取樣品盒和盒蓋及樣品的烘后總重量M3。

1.2.5 種子生活力 采用TTC 法[5]。隨機取10粒飽滿種子，沿種子胚中心線切成兩半，置于培養(yǎng)皿中，加入0.5%TTC 浸沒種子，將培養(yǎng)皿放入30 ℃全黑暗恒溫箱中24 h，胚被染成紅色為有生活力的種子，重復3 次。

1.2.6 種子吸水性 分別隨機取去皮種子、酸蝕種子（濃硫酸浸種10 min 后洗凈晾干備用的種子）和完整種子各30 粒，分別稱其干重，放在盛水的燒杯中浸泡，每4 h（白天）和10 h（晚上）取出一次，用濾紙吸干表面水分，用電子天平迅速稱其濕重，直到種子質(zhì)量不再增加為止停止試驗，觀測種皮對其吸水性的影響，每個處理重復3次。將酸蝕種子與完整種子在體式顯微鏡下進行外部形態(tài)對比觀察。

1.2.7 種子發(fā)芽抑制物質(zhì)測定 分別取10 g 完整種子和空殼種子磨碎，置于100 mL 容量瓶中，加80%甲醇定容至100 mL，在4 ℃恒溫箱中浸提24 h，期間震蕩3 次，然后充分過濾，濾液即為抑制物的提取液，分別稀釋為原濃度的75%、50%、25%、0%，在室溫下分別用稀釋后的溶液浸泡白菜種子2 h， 再用0.1%高錳酸鉀消毒10 min，用無菌水沖洗干凈，置于直徑9 cm 的培養(yǎng)皿中的濾紙上，在25 ℃恒溫、光照條件為12 h光照/12 h 黑暗的培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗。每個處理50 粒白菜種子，重復3 次，以胚根露出種胚為發(fā)芽標準，24 h 后統(tǒng)計發(fā)芽率。

1.2.8 種子休眠解除的方法 用0.1%高錳酸鉀浸泡種子消毒10 min，后用無菌水沖干凈，進行不同試驗處理。將處理后的種子放入直徑9 cm 裝滿濕潤珍珠巖的培養(yǎng)皿中，分別置于培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗，每個處理30 粒種子，重復3 次。試驗期間每天觀察，并保持珍珠巖濕潤。參照《1996國際種子檢驗規(guī)程》的鑒定標準統(tǒng)計萌發(fā)情況，種子的萌發(fā)以胚根長度超過種子半徑作為萌發(fā)標準，連續(xù)5 d 無萌發(fā)種子視為萌發(fā)結(jié)束。具體試驗處理如下：

處理1（CK）：消毒后的種子未經(jīng)其他處理，放置于培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗。溫度為25 ℃和15 ℃各12 h 循環(huán)。處理2（機械去皮處理）：用手術刀對種子進行去皮處理，將種仁取出進行發(fā)芽試驗。發(fā)芽條件同上。處理3（低溫沙藏處理）：隨機取30 粒完整種子，用濕沙包裹，后置于4 ℃冰箱中，每個月檢查其萌發(fā)情況，1 年后統(tǒng)計種子發(fā)芽率。處理4（常規(guī)播種處理）：隨機取30粒完整種子，在深8 cm、內(nèi)口徑8 cm 的育苗盆中直接播種，再放置于大棚，用75%遮陽網(wǎng)覆蓋，每個月檢查其萌發(fā)情況，1 年后統(tǒng)計種子發(fā)芽率。處理5（濃硫酸+GA₃組合處理方案的優(yōu)化篩選）：濃硫酸處理時間（T）設置4 個水平，分別為T₁（0 min）、T₂（5 min）、T₃（10 min）、T₄（15 min），GA₃濃度（G）設置5 個水平，分別為G₁（0 mg/L）、G₂（500 mg/L）、G₃（1000 mg/L）、G₄（1500 mg/L）、G₅（2000 mg/L），GA₃ 處理時間為48 h，共計20個處理，在30 ℃全時段黑暗條件的培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗。處理6（溫度對種子萌發(fā)的影響）：室溫條件下，用濃硫酸處理種子10 min，在流水下反復搓洗干凈，再結(jié)合1500 mg/L GA₃浸泡48 h，分別在30 ℃、25 ℃和15 ℃/25 ℃條件下，全時段黑暗的培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)結(jié)構(gòu)及千粒重

如圖1 所示，墨脫花椒種子主要為卵圓形，少數(shù)半卵圓形，卵圓形種子種皮堅硬表面光滑，種臍位于其腹面中部，其橫軸直徑為（3.18±0.036）mm，縱軸直徑為（3.86±0.04）mm。半卵圓形種子橫切面光滑，橫軸直徑為（1.63±0.06）mm，縱軸直徑為（3.83±0.02）mm。

如圖2 所示，種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)由三部分組成：種皮、胚、胚乳，胚為白色抹刀型。

種子空殼率為25.67%±2.40%，對上浮種子進行破殼處理，發(fā)現(xiàn)均為無胚的空殼，而下沉種子為飽滿種子。飽滿種子千粒重為（13.73±0.08）g，含水量為12.31%±0.62%，生活力為97.78%±1.11%，種子具備萌發(fā)的可能性。

2.2 種子吸水性

由圖3 可知，在同一時間段內(nèi)，去皮種子與完整種子相比，吸水率差異較大。去皮種子在0～4 h 階段，為快速吸水階段，吸水率為60.40%，在4～26 h 階段為緩慢吸水階段，在26 h 后吸水逐漸趨于平穩(wěn)，最終吸水率為76.41%。而酸蝕種子與完整種子吸水曲線差異不大，各階段吸水率接近持平，在0～4 h 階段為快速吸水階段，吸水率分別為9.95%和10.61%，4～30 h 吸水逐漸緩慢，后期逐漸接近吸水飽和， 最終吸水率分別為23.40%和21.19%。結(jié)果表明，墨脫花椒完整種子種皮透水性差，吸水速率慢，對種子萌發(fā)存在一定程度物理障礙，酸蝕處理后對種子吸水速率影響不大。

如圖4 所示，經(jīng)酸蝕處理后的種子與對照種子外部形態(tài)差異較大，酸蝕后的種子表面凹凸不平色澤暗淡，部分表面由于灼燒而產(chǎn)生裂痕，與對照種子表面光滑油亮形成鮮明對比?？梢姡瑵饬蛩峤N能去除種皮表面油脂物質(zhì)，還能使種皮開裂，從而增強透水透氣性。

2.3 種子發(fā)芽抑制物質(zhì)的生物測定

由圖5 可知，不同濃度的種皮和完整種子浸提液對白菜種子發(fā)芽率均有抑制作用，且隨著浸提液濃度的增加，白菜種子發(fā)芽率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，且完整種子浸提液的抑制程度高于種皮浸提液。經(jīng)方差分析和多重比較結(jié)果顯示，當種皮浸提液濃度為25%和50%時，發(fā)芽率與對照相比均無顯著差異（P>0.05），當其濃度為75%和100%時，與對照相比均存在顯著差異（P<0.05），發(fā)芽率分別降低了87.34%、92.67%，表明當種皮浸提液達一定濃度（≥75%）時，才具有抑制作用；而完整種子浸提液濃度在25%、50%、75%、100%時，與對照相比均存在顯著差異，發(fā)芽率分別降低了19.33%、44%、88.66%、92.66%；完整種子浸提液與種皮浸提液相比，在浸提液濃度為25%、50%、75%和100%時，白菜種子發(fā)芽率均低于種皮浸提液，且在25%和50%時均存在顯著差異，而完整種子由種皮和種仁構(gòu)成，說明種胚內(nèi)部也存在抑制物質(zhì)。由此可知，種皮和完整種子的甲醇浸提液對白菜種子均存在抑制作用，抑制物質(zhì)主要分布在種仁和種皮，抑制強度為完整種子>種皮，且隨浸提液濃度增加，抑制作用增強。

2.4 促進種子萌發(fā)方法

2.4.1 物理處理 通過試驗得出，對照、機械去皮、低溫沙藏、常規(guī)播種4 種處理后的種子均未萌發(fā)?？梢姡摶ń贩N子不易萌發(fā)，存在休眠性。

2.4.2 化學處理 由表1 可知，當濃硫酸處理時間（T）為0 時，無論GA3 濃度（G）有多大，種子都不會萌發(fā)，與對照（T1G1）結(jié)果一致，說明單獨的GA3 處理對種子萌發(fā)沒有促進作用。當GA3 濃度為0 mg/L（G1）時，濃硫酸處理時間為5 min（T2）和10 min（T3）時，種子發(fā)芽率分別為4.44%和3.33%，與對照相比不存在顯著差異，說明單獨的濃硫酸處理對種子萌發(fā)沒有實質(zhì)性促進作用。在經(jīng)濃硫酸處理5～15 min 后，隨著GA3處理濃度的增大，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先增后降的趨勢，在GA3 濃度為1500 mg/L（G4）時，種子發(fā)芽率達到最高。其中濃硫酸浸泡10 min+1500 mg/LGA3 浸泡48 h（T3G4）的組合處理發(fā)芽率最高，達83.33%；其次是濃硫酸浸泡15 min+1500 mg/LGA3 浸泡48 h 的組合處理（T4G4），發(fā)芽率為77.78%，上述2 個處理的效果無顯著差異，但與其他處理間均達到差異顯著水平。由此可知，濃硫酸和GA3 共同作用可解除墨脫花椒種子休眠，促其萌發(fā)，2 種藥劑單獨處理時均不能有效解除種子休眠。

2.4.3 溫度 由表2 可知，30 ℃條件下種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均為最高。其中，30 ℃發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)均顯著高于25 ℃ 和25 ℃/15 ℃，發(fā)芽率只顯著高于25 ℃/15 ℃，與25 ℃差異不顯著。綜合來看，溫度也是影響墨脫花椒種子萌發(fā)的一個重要因素，30 ℃條件更適合其萌發(fā)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，墨脫花椒種子具有較高的空殼率，達25.67%。在實踐生產(chǎn)中，種子的結(jié)實率主要受到播種、施肥、灌溉、病蟲害防治、輔助授粉等多種因素的影響[7]。而在自然條件下，種子產(chǎn)量和質(zhì)量主要受環(huán)境影響，其中氣候條件是影響種子生產(chǎn)的關鍵因素，包括光照、溫度、降雨量等[8-9]。資料顯示，墨脫花椒在全世界僅分布于中國西藏的墨脫縣[1]。西藏墨脫地區(qū)具有青藏高原獨特的地理環(huán)境和特殊的氣候條件，雨量十分充沛，年降雨量達2000～3000 mm，屬于喜馬拉雅山東側(cè)亞熱帶潮濕氣候區(qū)[10-11]。推測原產(chǎn)地濕熱的氣候影響了傳粉受精，這可能是造成墨脫花椒種子空殼的主要原因。劉元生等[12]研究頂壇花椒成苗技術時，選用的種子采收自環(huán)境惡劣的喀斯特溫熱河谷區(qū)，花椒種子的空殼率高達70%～90%；崔星星[13]在研究竹葉花椒種子休眠特性時，發(fā)現(xiàn)采自四川不同地區(qū)的花椒種子空殼率均高達50%以上?？梢姡煌沫h(huán)境條件對花椒種子結(jié)實都會造成一定影響，而環(huán)境條件如何影響花椒種子空殼則還需進一步探究。

種子萌發(fā)過程不僅受到自身遺傳因素和形態(tài)特征的影響，還受到光照、溫度、水分、化學物質(zhì)等外界環(huán)境條件的調(diào)控[14]。已有研究證明，種子萌發(fā)的最適溫度通常和原生境氣候條件具有很大的關系[15]，也有可能與植物本身有關[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，墨脫花椒在30 ℃條件催芽時發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)都最高，說明30 ℃為發(fā)芽最適宜溫度。墨脫地區(qū)晝夜溫差大，最熱月平均氣溫30.1 ℃，較為接近發(fā)芽最適溫度。甘肅[18]、山東[19]兩地的大紅袍花椒催芽時也是選擇30 ℃恒溫黑暗條件，在此條件下發(fā)芽率較高。這一原因是否是花椒屬植物本身的遺傳特性還需深入探討。

種子吸水性試驗結(jié)果顯示，去皮種子的吸水率在72 h 內(nèi)高達76.41%，而完整種子的飽和吸水率僅為21.19%，說明種皮嚴重阻礙了墨脫花椒種子的吸水性。經(jīng)濃硫酸處理后的種子飽和吸水率為23.40%，與完整種子的接近，這可能與酸蝕種子流水清洗時種子已充分吸水及流水洗凈后未完全晾干有關。對比完整種子，酸蝕種子表面已經(jīng)出現(xiàn)裂痕，種皮已難以阻礙吸水透氣。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）[20]、巨紫荊（Cercis giganteaCheng et Keng f.）[21]、東北紅豆杉（Taxuscuspidata Sieb. et Zucc.）[22]等種子也都存在類似的吸水障礙。由此可見，種皮的透水性障礙是墨脫花椒種子休眠的原因之一。

抑制物質(zhì)存在于種子的各個部位，包括果皮、種皮、胚、胚乳部位，其中脫落酸是這些部位最常見的抑制物質(zhì)[23]。本研究通過甲醇對抑制物質(zhì)進行提取。結(jié)果表明，墨脫花椒種子種皮和種仁中都存在抑制物質(zhì)，且隨著浸提液濃度的增大抑制作用逐漸增強。這與青花椒種子抑制物測定結(jié)果一致[13]，但青花椒種子不同部位的抑制強度表現(xiàn)為種仁>種皮，對于墨脫花椒種子種皮和種仁的抑制強度及抑制物類型都需要進一步探究。

根據(jù)休眠因素所在種子部位的角度可將種子休眠分為內(nèi)源休眠、外源休眠和綜合休眠[24-25]。墨脫花椒種子的種皮存在吸水障礙，屬于外源因素；種子存在萌發(fā)抑制物質(zhì)，屬于內(nèi)源因素。由此認為墨脫花椒種子屬于綜合休眠類型。在破除休眠的方法中，酸蝕處理有利于增加種皮透水性而解除其外源限制因素，GA3 處理可能有助于消減發(fā)芽抑制物質(zhì)而解除其生理休眠（內(nèi)源休眠）。

綜上，本研究認為由種皮造成的吸水障礙和種子含有內(nèi)源抑制物是引起墨脫花椒種子休眠的主要原因，其休眠類型屬于復合休眠（PY+PD）。濃硫酸處理10 min+1500 mg/L GA₃浸種48 h+30 ℃恒溫培養(yǎng)可有效解除墨脫花椒種子休眠，提高其發(fā)芽率。研究結(jié)果為墨脫花椒人工繁育提供了科學依據(jù)。