徐靜怡,張心雨,李連俊,劉陽(yáng),余建東,馮占輝,葛榮靖

驚厥(seizure)是由短暫腦功能障礙引發(fā)的一系列以軀體抽動(dòng)為特征的疾病過(guò)程。嚴(yán)重或者持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的驚厥可致受累腦區(qū)發(fā)生驚厥后損傷,引起繼發(fā)性腦功能障礙[1]。這種驚厥繼發(fā)性腦損傷也可能是促進(jìn)癲癇發(fā)生發(fā)展的原因。因此,及時(shí)中止發(fā)作等級(jí)較高或持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的驚厥具有非常重要的意義。

瑞替加濱(retigabine, RTG)是一種K+通道開(kāi)放劑,特異性作用于電壓門(mén)控K+通道 KCNQ2-5(Kv7.2-7.5)[2-3]。RTG可增加KCNQ2-5通道的開(kāi)放頻率及開(kāi)放持續(xù)時(shí)間,通過(guò)增加K+外流對(duì)神經(jīng)元發(fā)揮持續(xù)超極化影響,使過(guò)度興奮的細(xì)胞恢復(fù)靜息狀態(tài)[4-5]。RTG也可減慢大腦中抑制性遞質(zhì)GABA的代謝[6],增強(qiáng)神經(jīng)元中抑制性突觸電流,發(fā)揮抑制神經(jīng)元興奮的作用[7-8]。在藥代學(xué)方面,RTG易于吸收,Tmax為1～2 h。在單次和多次給藥后,其血藥濃度隨劑量線(xiàn)性增加。本研究擬通過(guò)毛果蕓香堿誘導(dǎo)的急性驚厥小鼠模型,采用RTG進(jìn)行干預(yù),分析其抗驚厥效果以及是否對(duì)海馬神經(jīng)元的驚厥性損傷具有保護(hù)作用,為探索該藥的抗驚厥療效提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑

RTG(上海麥克林公司)、東莨菪堿(美國(guó)Sigma)、毛果蕓香堿鹽酸鹽(美國(guó)MCE公司)、苯巴比妥鈉(力捷進(jìn))、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天)、Axon 700B放大器(美國(guó)Molecular Devices公司)、Axon 1550B數(shù)模轉(zhuǎn)換器(美國(guó)Molecular Devices公司)、玻璃微電極(美國(guó)Sutter公司)、電極拉制儀(美國(guó)Sutter公司)及正置相差顯微鏡(日本尼康FN1)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年雄性ICR小鼠40只,8周,體質(zhì)量30～40 g,購(gòu)于杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司,合格證號(hào)為SCXK(浙)2019-0004。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合《用于科學(xué)目的的動(dòng)物保護(hù)歐共體條例(2010/63/EU)》,并獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于專(zhuān)用的動(dòng)物房,飼養(yǎng)環(huán)境恒定溫度為23 ℃、保持光照/黑暗12 h恒定循環(huán),自由飲水和攝食。40只ICR小鼠隨機(jī)分為空白組(control group)、驚厥組(seizure group)、RTG組(RTG group)及苯巴比妥鈉組(phenobarbital group),每組 10 只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 小鼠急性驚厥模型制作

腹腔注射東莨菪堿(2 mg/kg),30 min后再給予毛果蕓香堿腹腔注射(285 mg/kg)誘發(fā)急性驚厥。若ICR小鼠1 h內(nèi)出現(xiàn)Racine 4～5級(jí)驚厥發(fā)作(表1),在給予毛果蕓香堿90 min后腹腔注射RTG(2 mg/kg,RTG組)[9-10],或腹腔注射苯巴比妥鈉(94 mg/kg,苯巴比妥鈉組)[11],繼續(xù)觀察1 h。詳細(xì)給藥方案見(jiàn)圖1。對(duì)小鼠造模過(guò)程中各級(jí)發(fā)作的持續(xù)時(shí)間及發(fā)作次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。小鼠的驚厥發(fā)作等級(jí)按照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)(表1)[12-13]。

表1 Racine的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及特征

1.4 蘇木素-伊紅染色方法

急性癲癇模型建立1周后,用20%的烏拉坦麻醉小鼠,心臟灌流處死、取腦,將腦固定于4%的多聚甲醛24 h,組織在蔗糖中完成脫水后進(jìn)行冰凍切片。貼片充分干燥后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色,顯微鏡明場(chǎng)拍攝海馬區(qū)圖片。

1.5 膜片鉗記錄方法

用異氟烷將小鼠誘導(dǎo)麻醉后,迅速斷頭取腦,與冰水混合并置于持續(xù)通入二元?dú)?95% O2,5% CO2)的氧飽和人工腦脊液中(artificial cerebrospinal fluid, ACSF),對(duì)鼠腦行冠狀切片(切片厚度為300 μm)。腦片置于持續(xù)通二元?dú)獾腁CSF中,于35 ℃孵育30 min,再于室溫孵育30 min。將孵育好的腦片轉(zhuǎn)移至相差顯微鏡下觀察并進(jìn)行電生理記錄(氧飽和ACSF持續(xù)灌流)。鏡下選擇海馬齒狀回顆粒細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞記錄。ACSF成分(mM)為124 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、24 NaHCO3、5 HEPES、12.5 Glucose、2 MgSO4及2 CaCl2。電極內(nèi)液成分(mM)為150 KGlu、0.5 EGTA、10 HEPES、4 NaCl、4 Mg2ATP、1 TrisGTP及5 phosphocreatine。電極電阻控制在5～8 MΩ,全細(xì)胞記錄的串聯(lián)阻抗控制在15～30 MΩ。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RTG可減少小鼠驚厥發(fā)作的等級(jí)及頻次

在毛果蕓香堿的作用下,小鼠出現(xiàn)不同級(jí)別的驚厥發(fā)作。本研究選擇注射毛果蕓香堿后1 h內(nèi)有4～5級(jí)大發(fā)作的小鼠作為研究對(duì)象。采用苯巴比妥鈉作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。驚厥組只注射東莨菪堿和毛果蕓香堿,RTG組與苯巴比妥鈉組在此注射基礎(chǔ)上,觀察到大發(fā)作后,于毛果蕓香堿注射后90 min進(jìn)行干預(yù)藥物注射(圖1)。觀察90～150 min時(shí)間段內(nèi)各組小鼠的驚厥發(fā)作等級(jí),比較藥物的干預(yù)效果。

驚厥組小鼠在經(jīng)歷90 min的前期發(fā)作后,在90～150 min觀察時(shí)間窗內(nèi)仍具有較高頻率的驚厥發(fā)作,主要以1～3級(jí)發(fā)作為主,也可出現(xiàn)4～5級(jí)大發(fā)作。驚厥組小鼠在造模期內(nèi)死亡率為40%。與驚厥組比較,RTG組小鼠注射RTG后無(wú)4～5級(jí)大發(fā)作出現(xiàn),但仍可出現(xiàn)數(shù)次3級(jí)發(fā)作,且驚厥發(fā)作等級(jí)及持續(xù)時(shí)間降低。注射陽(yáng)性對(duì)照藥物苯巴比妥鈉后,苯巴比妥鈉組小鼠不再出現(xiàn)驚厥發(fā)作癥狀。RTG組與苯巴比妥鈉組小鼠的死亡率均在10%以下。

注:實(shí)驗(yàn)分為4組,小鼠驚厥發(fā)作等級(jí)用不同顏色表示,并以時(shí)間軸進(jìn)行呈現(xiàn)。紅色箭頭為RTG和苯巴比妥鈉的注射時(shí)間。開(kāi)始節(jié)點(diǎn)與結(jié)束節(jié)點(diǎn)之間為組間驚厥發(fā)作對(duì)比的時(shí)間窗口。藥物干預(yù)后,與驚厥組比較,RTG組小鼠的發(fā)作等級(jí)降低且頻次逐漸減少。

2.2 RTG可減輕癲癇小鼠海馬神經(jīng)元的損傷

在急性驚厥造模結(jié)束后,繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠1周,以觀察驚厥后的遲發(fā)性腦損傷情況。選取海馬作為觀察腦區(qū),發(fā)現(xiàn)模型小鼠在海馬CA1區(qū)出現(xiàn)較為顯著的驚厥后神經(jīng)元損傷。

蘇木素-伊紅染色結(jié)果顯示,空白組小鼠CA1區(qū)細(xì)胞帶排列整齊、緊密,細(xì)胞核清晰、胞質(zhì)飽滿(mǎn);驚厥組小鼠海馬區(qū)則出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)破壞,神經(jīng)元細(xì)胞周?chē)g隙增大、排列紊亂。細(xì)胞丟失導(dǎo)致細(xì)胞帶變窄,細(xì)胞密度降低(圖2A)。與驚厥組比較,RTG組小鼠CA1區(qū)細(xì)胞損傷程度較輕。與空白組比較,RTG組小鼠的細(xì)胞密度降低(P<0.01),細(xì)胞帶寬度變窄(P<0.05)。苯巴比妥鈉組小鼠CA1區(qū)細(xì)胞帶形態(tài)與RTG組相似,兩組在細(xì)胞帶寬度及細(xì)胞密度兩個(gè)方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B、C)。提示RTG具有與苯巴比妥鈉相似的驚厥損傷保護(hù)效果。

注:A為蘇木素-伊紅染色圖(海馬CA1區(qū));B為海馬CA1區(qū)細(xì)胞帶寬度;C為海馬CA1區(qū)細(xì)胞帶內(nèi)細(xì)胞密度。B、C圖中每個(gè)點(diǎn)表示一只小鼠。組間方差齊,采用單因素方差分析。*為P<0.05,**為P<0.01。

2.3 RTG可降低驚厥小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的興奮性

齒狀回是海馬外信息流入海馬的重要門(mén)控。驚厥后,海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的興奮性增高,是促進(jìn)海馬環(huán)路過(guò)度興奮的重要因素。本研究采用膜片鉗記錄空白組與驚厥組小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的興奮性。在驚厥組小鼠完成正常記錄后隨即灌流RTG,觀察其對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞放電的影響?？瞻仔∈箢w粒細(xì)胞的放電頻率較低,而驚厥組小鼠顆粒細(xì)胞的興奮性顯著增高(圖3)。RTG可顯著減少驚厥小鼠顆粒細(xì)胞的放電,降低其興奮性,提示驚厥中應(yīng)用RTG可通過(guò)降低顆粒細(xì)胞的興奮性,來(lái)減少興奮性信息向海馬中的傳入。

3 討論

本研究應(yīng)用毛果蕓香堿誘導(dǎo)急性驚厥小鼠模型,采用RTG進(jìn)行抗驚厥處理并與當(dāng)前一線(xiàn)抗驚厥藥物苯巴比妥鈉的干預(yù)效果進(jìn)行比較,分析RTG的抗驚厥效果及對(duì)海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明,RTG有一定的抗驚厥作用,可減少驚厥的發(fā)作等級(jí)及頻次,并對(duì)驚厥性海馬損傷具有顯著的保護(hù)作用。

RTG是KCNQ2/3通道的特異性開(kāi)放劑,可以增加由該類(lèi)通道介導(dǎo)的外向K+電流[14-15]。這種K+電流受到M型膽堿能受體的調(diào)控,又被稱(chēng)為M電流[16-17]。由于該通道慢激活慢失活的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn),M電流變化速度較慢,往往影響序列動(dòng)作電位后半段動(dòng)作電位的發(fā)放,使得神經(jīng)元的發(fā)放呈現(xiàn)為發(fā)放頻率逐漸降低的適應(yīng)性發(fā)放模式[18-20]。此外,RTG可增加GABAA受體介導(dǎo)的抑制性突觸后電流(Inhibitory postsynatic current, ISPC),增強(qiáng)GABA能遞質(zhì)的抑制效果[8]。

注:A為空白組(黑色曲線(xiàn))與驚厥組(紅色與灰色曲線(xiàn))小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞動(dòng)作電位。驚厥組顆粒細(xì)胞放電增多(紅色曲線(xiàn)),灌流RTG可降低驚厥小鼠顆粒細(xì)胞的興奮性(灰色曲線(xiàn));B為顆粒細(xì)胞輸入輸出曲線(xiàn)。驚厥組小鼠(紅色)顆粒細(xì)胞放電比空白組(黑色)增多。RTG可降低驚厥小鼠顆粒細(xì)胞的輸入輸出曲線(xiàn),減少顆粒細(xì)胞放電(灰色);C為取B圖曲線(xiàn)中100 pA刺激電流強(qiáng)度所誘發(fā)的顆粒細(xì)胞動(dòng)作電位個(gè)數(shù),對(duì)比灌流RTG前后對(duì)顆粒細(xì)胞放電的抑制作用(紅色和灰色分別表示驚厥組小鼠同一顆粒細(xì)胞灌流RTG前后的放電情況)?？瞻捉M虛線(xiàn)表示該組平均值位置。B、C圖中每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)顆粒細(xì)胞。組間方差齊,空白組與驚厥組之間采用t檢驗(yàn),驚厥組與RTG組之間采用配對(duì)t檢驗(yàn)。**為P<0.01。

基于以上機(jī)制,RTG通過(guò)抑制神經(jīng)元放電從而發(fā)揮抗癲癇作用。從本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,RTG雖然可以減少小鼠驚厥發(fā)作的等級(jí)及頻次,但不能完全消除發(fā)作。經(jīng)過(guò)RTG處理的小鼠,仍然可出現(xiàn)3級(jí)以下發(fā)作。而苯巴比妥鈉的抗驚厥效果顯著,可以完全中斷小鼠的驚厥發(fā)作,從而使小鼠進(jìn)入鎮(zhèn)靜麻醉狀態(tài)。然而,在海馬損傷方面,RTG的保護(hù)效果與苯巴比妥鈉相似,均可顯著減少海馬神經(jīng)元的損傷。提示對(duì)于腦組織損傷而言,更重要的是及時(shí)中止高等級(jí)的發(fā)作。此外,苯巴比妥鈉可快速解除肢體陣攣,是臨床治療癲癇大發(fā)作的首選藥物,但由于其血藥濃度的不穩(wěn)定性及肝損傷等副作用,故仍有待尋找既可有效抗癲癇發(fā)作而副作用又小的藥物來(lái)進(jìn)行替代[11]。

顆粒細(xì)胞是海馬外電信號(hào)流入海馬的門(mén)控因素[21]。在驚厥小鼠模型中,顆粒細(xì)胞的興奮性增加,促進(jìn)海馬外信息傳入海馬回路,引起海馬三突觸環(huán)路的過(guò)度激活,該過(guò)程是促進(jìn)癲癇發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[22]。本研究中全細(xì)胞電流鉗記錄顯示,急性驚厥小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞在RTG作用后電發(fā)放數(shù)量明顯減少。因此,應(yīng)用RTG可以降低驚厥小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的興奮性,有利于海馬內(nèi)電活動(dòng)的穩(wěn)定。

綜上所述,RTG在急性驚厥模型小鼠中具有抗驚厥作用,對(duì)驚厥性海馬損傷具有較好的保護(hù)效果。其機(jī)制可能涉及對(duì)顆粒細(xì)胞興奮性的抑制,減少海馬內(nèi)的興奮性損傷。