蔣文 石丁華 何艷娟 陳淳媛

（1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院兒科，湖南長(zhǎng)沙 410013；2.長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院兒科，湖南長(zhǎng)沙 410005）

膿毒癥是指由于宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)，而產(chǎn)生的危及生命的器官功能障礙［1］。目前膿毒癥是全球性的醫(yī)療保健問題，也是重癥監(jiān)護(hù)室內(nèi)常見的疾病，以及感染導(dǎo)致死亡的主要原因，在兒童重癥監(jiān)護(hù)室內(nèi)嚴(yán)重膿毒癥的全球患病率為8.2%，膿毒癥休克的病死率高達(dá)40%，甚至更高［2-3］。膿毒癥是一個(gè)炎性反應(yīng)過程，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要因素。在膿毒癥事件中，血管內(nèi)皮細(xì)胞是炎性因子首先攻擊的目標(biāo)［4-5］，受病原體及內(nèi)毒素等細(xì)菌產(chǎn)物攻擊，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是參與膿毒癥休克、器官功能障礙及凝血功能障礙的中心環(huán)節(jié)［6-8］。

焦亡是一種依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-1、caspase-4/5介導(dǎo)的，以細(xì)胞質(zhì)膜破裂并釋放白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18 等促炎性細(xì)胞因子引發(fā)細(xì)胞死亡為特點(diǎn)的細(xì)胞程序性死亡方式，也是宿主對(duì)抗細(xì)菌、真菌、病毒或原生動(dòng)物病原體侵襲的一種方式［9-10］。細(xì)胞焦亡的本質(zhì)是一種炎性宿主反應(yīng)，研究表明在膿毒癥過程中，細(xì)胞焦亡一方面起到抗原提呈及清除細(xì)胞內(nèi)病原體的作用，另一方面過度的焦亡激活會(huì)加重膿毒癥器官功能損害［11-12］。降鈣素原（procalcitonin，PCT）被公認(rèn)為是鑒別細(xì)菌感染和病毒感染的重要生物標(biāo)志物，目前作為膿毒癥的潛在生物標(biāo)記物被廣泛研究［13］。最新研究表明，PCT不僅僅作為膿毒癥的重要炎性標(biāo)志物，也是一種重要的炎性介質(zhì)［14］。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）為研究對(duì)象，旨在探討PCT對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為尋找膿毒癥致病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVECs 系購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection）。人PCT 凍干粉（用蒸餾水溶解，配制成100 μg/mL的母液備用）和LPS 凍干粉（用完全培養(yǎng)基溶解，配制成1 mg/mL的母液備用）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone 公司。胰蛋白酶-EDTA 消化液和青鏈霉素混合液購(gòu)于中國(guó)凱基生物公司。RNA 提取試劑盒（D9108A）購(gòu)于美國(guó)OMEGA 公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Rever TraAce q-PCR RT Kit）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（KOD SYBR qPCR Mix）購(gòu)于日本TOYOBO公司。BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)于北京碧云天生物科技有限公司。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 （nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）兔多克隆抗體和caspase-1 兔多克隆抗體購(gòu)于中國(guó)武漢三鷹公司。β-actin 兔多克隆抗體和羊抗兔IgG二抗購(gòu)于中國(guó)博士德生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs 用含10%胎牛血清及雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，間隔2 d 左右換液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs進(jìn)行分組和干預(yù)，培養(yǎng)基中以濃度為1 μg/mL 的LPS 對(duì)細(xì)胞干預(yù)12 h，建立膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型［15］，再用PCT 進(jìn)行干預(yù)12 h。實(shí)驗(yàn)分為兩部分：（1）正常對(duì)照組、LPS組（濃度1 μg/mL）、PCT 組（濃度10 ng/mL）及LPS+PCT 組（LPS干預(yù)后再用10 ng/mL PCT 處理）；（2）正常對(duì)照組、LPS 組、LPS+PCT 不同濃度組（PCT 0.1 ng/mL 組、PCT 1 ng/mL 組、PCT 10 ng/mL組、PCT 100 ng/mL組）。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)mRNA表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞，按RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的濃度和純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)試劑盒（KOD SYBR qPCR Mix）說明書，取1 μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，60℃退火10 s，68℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。引物由湖南擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

表1 NLRP3、caspase-1和GAPDH基因引物序列

1.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白煮沸變性，根據(jù)SDS制膠試劑盒說明書制膠，蛋白凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%的脫脂牛奶封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的兔抗人NLRP3、兔抗人caspase-1、兔抗人β-actin一抗4℃振蕩孵育過夜。PBST漂洗3次，加入1∶5 000 稀釋的羊抗兔二抗室溫振蕩孵育2 h，PBST 漂洗3 次，ECL 化學(xué)發(fā)光顯色。使用Image J 8.0 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCT干預(yù)對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs中NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，LPS 組、PCT 組及LPS+PCT組NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+PCT 組NLRP3、caspase-1 mRNA 及蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；LPS+PCT組與PCT組各指標(biāo)的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖1。

圖1 Western blot法檢測(cè)各組NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)電泳圖

表2 各組細(xì)胞NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平 （± s，n=3）

表2 各組細(xì)胞NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平 （± s，n=3）

注：［LPS］脂多糖；［PCT］降鈣素原；［NLRP3］核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；［caspase-1］半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1。a示與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；b示與LPS組比較，P＜0.05。

mRNA組別正常對(duì)照組LPS組PCT組LPS+PCT組F值P值蛋白NLRP3 1.00±0.00 1.85±0.13a 1.38±0.03a 1.46±0.05a,b 14.87＜0.01 caspase-1 0.03±0.01 0.31±0.03a 0.12±0.01a 0.25±0.02a,b 22.74 0.01 caspase-1 1.00±0.00 1.51±0.04a 1.18±0.03a 1.28±0.07a,b 15.00＜0.01 NLRP3 0.14±0.02 0.39±0.03a 0.22±0.03a 0.27±0.01a,b 13.56 0.02

2.2 不同濃度PCT 干預(yù)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HUVECs中NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，LPS組及PCT不同濃度組NLRP3、 caspase-1 mRNA 及蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05）；與LPS 組 比 較，PCT 不 同 濃 度 組NLRP3、 caspase-1 mRNA 及蛋白表達(dá)均下調(diào)（P＜0.05），隨著PCT 濃度增加，NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)，不同濃度的PCT各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖2。

圖2 Western blot法檢測(cè)各組NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)電泳圖

表3 各組細(xì)胞NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平 （± s，n=3）

表3 各組細(xì)胞NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平 （± s，n=3）

注：［LPS］脂多糖；［PCT］降鈣素原；［NLRP3］核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；［caspase-1］半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1。a 示與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；b 示與LPS 組比較，P＜0.05；c 示與PCT 0.1 ng/mL 組比較，P＜0.05；d 示與PCT 1 ng/mL 組比較，P＜0.05；e示與PCT 10 ng/mL組比較，P＜0.05。

mRNA組別正常對(duì)照組LPS組PCT 0.1 ng/mL組PCT 1 ng/mL組PCT 10 ng/mL組PCT 100 ng/mL組F值P值蛋白caspase-1 0.07±0.02 0.51±0.02a 0.47±0.03a,b 0.41±0.02a,b,c 0.37±0.03a,b,c,d 0.22±0.01a,b,c,d,e 22.05＜0.01 caspase-1 1.00±0.00 1.41±0.03a 1.25±0.02a,b 1.17±0.02a,b,c 1.10±0.02a,b,c,d 1.04±0.01a,b,c,d,e 27.06＜0.01 NLRP3 1.00±0.00 2.31±0.07a 1.91±0.04a,b 1.61±0.03a,b,c 1.52±0.03a,b,c,d 1.44±0.04a,b,c,d,e 21.69＜0.01 NLRP3 0.11±0.01 0.35±0.01a 0.29±0.03a,b 0.24±0.02a,b,c 0.21±0.01a,b,c,d 0.13±0.02a,b,c,d,e 25.18＜0.01

3 討論

在膿毒癥事件中，血管內(nèi)皮細(xì)胞是該過程的主要靶細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞與炎性介質(zhì)、先天性免疫成分及凝血系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)來協(xié)調(diào)宿主的反應(yīng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、功能障礙在膿毒癥的一系列不良后果中發(fā)揮著重要作用［16-17］。焦亡是依賴于caspase 激活的另一種細(xì)胞程序性死亡的方式，是依賴NLRP3 炎性小體、caspase-1 及Gasdermin D （GSDMD） 蛋白活化后促進(jìn)IL-1β、IL-18等促炎性物質(zhì)成熟及釋放的促炎過程［10，18-19］。細(xì)胞焦亡破壞體內(nèi)受感染的細(xì)胞，促使感染細(xì)胞內(nèi)病原體釋放，同時(shí)釋放一系列炎性因子，從而被免疫細(xì)胞識(shí)別、吞噬及殺滅，在機(jī)體內(nèi)起到抗原提呈及清除細(xì)胞內(nèi)病原體的作用［20-21］。因此，適度的細(xì)胞焦亡是保護(hù)機(jī)體抵御病原微生物感染的重要方式，但是過度的細(xì)胞焦亡激活可能會(huì)加重膿毒性休克和膿毒癥器官損害。血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷是膿毒癥病理過程中的關(guān)鍵，而細(xì)胞焦亡是感染性疾病中的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。在膿毒癥急性肺損傷機(jī)制的研究中表明，GSDMD 蛋白由LPS刺激的單核細(xì)胞釋放，與NLRP3炎性小體活化后的caspase-1 結(jié)合形成微粒，GSDMD 蛋白被caspase-1 切割后活化，活化后的GSDMD 蛋白在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞上打孔，破壞細(xì)胞膜的完整性，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損傷［22］。這提示血管內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡可能是膿毒癥疾病過程重要病理機(jī)制之一。PCT的血清濃度被認(rèn)為是全身感染性疾病的嚴(yán)重程度及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。而目前研究發(fā)現(xiàn)，PCT本身存在細(xì)胞毒性，且有研究表明在膿毒癥肝衰竭的過程中其可能擔(dān)任了炎性介質(zhì)的重要角色［23-24］。細(xì)胞焦亡的本質(zhì)是促炎過程，而膿毒癥的發(fā)生發(fā)展也是一個(gè)炎癥放大的過程，PCT作為膿毒癥過程中的重要生物學(xué)標(biāo)志物，在膿毒癥細(xì)胞焦亡機(jī)制中是促炎因子或保護(hù)因子，目前尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷模型中，與正常對(duì)照組比較，LPS組焦亡相關(guān)蛋白NLRP3 及caspase-1 mRNA、蛋白表達(dá)均上調(diào)，說明LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡參與了膿毒癥發(fā)病機(jī)制。有研究表明，在盲腸結(jié)扎穿刺誘導(dǎo)的膿毒癥心肌功能障礙的小鼠模型中，小鼠心肌細(xì)胞勻漿中的NLRP3 及caspase-1 mRNA 表達(dá)水平增高，同樣在體外試驗(yàn)中證實(shí)，將小鼠心肌細(xì)胞暴露在LPS中，NLRP3 及caspase-1 mRNA 表達(dá)水平也增高，本研究結(jié)果與之一致。而隨著NLRP3 炎性小體的激活，IL-1β 及IL-18 等炎癥因子也隨即增高［25］。以上結(jié)果提示，膿毒癥時(shí)細(xì)菌或細(xì)菌產(chǎn)物的刺激激活了NLRP3 炎性小體，從而進(jìn)一步介導(dǎo)了炎性反應(yīng)。在心肌缺血-再灌注損傷引起的無菌性炎癥的研究中發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死早期NLRP3 炎性小體激活，進(jìn)一步激活caspase-1，募集循環(huán)中的白細(xì)胞對(duì)損傷細(xì)胞進(jìn)行吞噬，最后對(duì)心肌細(xì)胞的缺血損傷起到了一定的修復(fù)作用［26］。因此，細(xì)胞焦亡在某些炎癥過程中起到了一定的保護(hù)作用，但過度的炎性物質(zhì)釋放可加重組織損傷。

本研究用不同濃度的PCT （0.1、1、10、100 ng/mL）對(duì)LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥HUVECs 模型干預(yù)12 h，發(fā) 現(xiàn)PCT 使 正 常HUVECs 中NLRP3、caspase-1 表達(dá)上調(diào)，而對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HUVECs 中NLRP3、caspase-1表達(dá)有抑制作用，提示PCT對(duì)正常細(xì)胞焦亡和膿毒癥模型細(xì)胞焦亡有不同作用機(jī)制。Sauer 等［23］在膿毒癥肝衰竭的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將人肝癌細(xì)胞暴露在濃度為0.01～50 ng/mL 的PCT中會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，并降低代謝活性、細(xì)胞完整性、合成和解毒能力，而同時(shí)使用L929 成纖維細(xì)胞獲得同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在危重患者研究中發(fā)現(xiàn)，PCT的升高促使了線粒體功能的障礙，使細(xì)胞代謝發(fā)生改變，同時(shí)促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞上促炎介質(zhì)的釋放，激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能產(chǎn)生損害［27］。以上結(jié)果提示，PCT通過啟動(dòng)細(xì)胞焦亡、壞死或直接對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，存在一定細(xì)胞毒性，在炎癥介導(dǎo)的過程中起促進(jìn)作用。PCT對(duì)LPS干預(yù)后HUVECs中NLRP3 及caspase-1 表達(dá)又有一定抑制作用，并呈濃度依賴性，提示PCT 在膿毒癥細(xì)胞模型中對(duì)細(xì)胞焦亡又有抑制作用。Hoffmann 等［28］發(fā)現(xiàn)膿毒癥休克的血管平滑肌細(xì)胞模型中，PCT在轉(zhuǎn)錄水平上抑制LPS 介導(dǎo)的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）合成。將人全血細(xì)胞與LPS 和PCT同時(shí)孵育可抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生［29］。以上結(jié)果表明PCT 在一定程度上通過抑制焦亡或通過減少TNF-α產(chǎn)生抑制炎癥過程，PCT作為一種炎癥調(diào)節(jié)劑，在LPS、TNF-α 和干擾素γ 等激動(dòng)劑引發(fā)的炎癥反應(yīng)過程中起重要作用［30］。因此，PCT可使正常HUVECs 中NLRP3、caspase-1 表達(dá)上調(diào)，而使LPS誘導(dǎo)的HUVECs中NLRP3、caspase-1表達(dá)下調(diào)，提示PCT 可能通過細(xì)胞焦亡參與膿毒癥發(fā)病機(jī)制，對(duì)正常和病理HUVECs 的NLRP3、caspase-1 表達(dá)調(diào)控機(jī)制可能存在差異，在膿毒癥中PCT 可能具有致炎和抗炎雙重作用，其作用機(jī)制及介導(dǎo)的通路，需進(jìn)一步探討。