陶慶雪，施衛(wèi)兵，常碩，郭錦晨，許文彬

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 安徽合肥 230012

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

3 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安徽合肥 230038

慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是我國現(xiàn)階段流行廣泛、危害嚴(yán)重的傳染病之一，每年由乙肝導(dǎo)致死亡人數(shù)高達(dá)90萬，我國CHB相關(guān)的肝硬化和肝癌患者占比約60%和80%[1-2]。現(xiàn)大量研究證實(shí)中醫(yī)藥在保肝降酶、抗纖維化及改善CHB患者的焦慮、抑郁狀態(tài)等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，能效彌補(bǔ)單一核苷（酸）類似物和干擾素抗病毒治療的不足，中醫(yī)辨證聯(lián)合抗病毒已成為我國治療慢乙肝的主要方式[3]。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為正氣不足加之濕熱毒邪乘襲，復(fù)因情志失調(diào)、飲食失節(jié)、勞倦失度可誘發(fā)慢乙肝。病久毒邪深入血分，濕熱盤踞中焦，易耗傷肝腎之陰，陰血既虧，無以涵養(yǎng)肝木，常致肝郁不疏，橫犯脾土，終以肝郁脾虛為核心矛盾。肝樂顆粒是安徽省中醫(yī)院感染科以逍遙散為底方化裁研制的臨床效方，由柴胡、黃芪、白芍、白術(shù)、茵陳、板藍(lán)根、澤蘭、薏苡仁等11味中藥組成，具有調(diào)肝理脾、清熱祛濕、活血解毒之功，恰合慢乙肝標(biāo)實(shí)本虛之機(jī)，前期研究證實(shí)肝樂顆粒聯(lián)合抗病毒治療不僅能強(qiáng)化對慢乙肝患者乏力、納差、肝區(qū)不適等臨床癥狀的改善，并能有效降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平，減輕肝損傷[4]。但其分子生物學(xué)機(jī)理尚不明確，現(xiàn)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究肝樂顆粒治療CHB作用機(jī)制，將為臨床推廣應(yīng)用本方提供新的視角與思路，為中醫(yī)藥調(diào)治CHB提供更多科學(xué)依據(jù)。

工具與方法

1 數(shù)據(jù)庫與軟件

見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫與軟件信息

2 肝樂顆粒活性成分的篩選與靶點(diǎn)收集

在TCMSP平臺，設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，結(jié)合中國知網(wǎng)、Pubmed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)以補(bǔ)充，最后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取Gene symbol集。

3 “藥物—活性成分—靶基因”互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明確藥物與藥物及藥物與靶蛋白的相互作用，將1.1項(xiàng)所得數(shù)據(jù)分別建立網(wǎng)絡(luò)文件和屬性文件后導(dǎo)入Cytoscape3.7.0軟件進(jìn)行可視化分析。

4 CHB相關(guān)靶蛋白匯總

分 別 以“chronic hepatitis B infection”、“chronic type B viral hepatitis”、“chronic hepatitis B”為關(guān)鍵詞，依次檢索Gene Cards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫，將各數(shù)據(jù)庫信息合并，即為CHB疾病靶點(diǎn)集。

5 “藥物—疾病”共同靶點(diǎn)獲取與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.1和1.2項(xiàng)數(shù)據(jù)導(dǎo)入在線繪圖與數(shù)據(jù)分析工具，生成韋恩（venny）圖。將交集數(shù)據(jù)上傳至STRING11.5數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白-蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并保存tsv文件。將文件導(dǎo)入CytoScape進(jìn)行可視化與屬性分析。

6 “肝樂顆粒成分—慢乙肝靶點(diǎn)”的GO與KEGG分析

將核心靶蛋白上傳至DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫，設(shè)置PValue＜0.05，按降序分別篩選基因本體分析GO的前10與KEGG通路富集分析的前20，并作圖展示。

7 構(gòu)建“肝樂復(fù)方-成分-靶點(diǎn)-通路-CHB”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

匯總并建立復(fù)方活性成分、富集通路及通路差異表達(dá)的靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)屬性文件后導(dǎo)入Cytoscape可視化，進(jìn)一步明確發(fā)揮療效的主要活性成分與靶點(diǎn)。

8 分子對接驗(yàn)證

在PubChem數(shù)據(jù)庫下載活性成分2D.sdf文件，利用Chem3D進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載靶蛋白3D.pdb文件，通過PyMOL2.4.0及Autodock-Tools1.5.7對配體和受體進(jìn)行預(yù)處理后保存為pdbqt文件，設(shè)置活性口袋后采用Autodockvina1.1.2進(jìn)行對接。

結(jié) 果

1 肝樂顆粒活性成分篩選與靶點(diǎn)收集

據(jù)ADME條件篩選獲得總化合物161個(gè)，柴胡皂苷及黃芪甲苷等成分雖不滿足篩選條件，但綜合《中藥藥理學(xué)》（全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材（第十版）·中國中醫(yī)藥出版社）及文獻(xiàn)研究已證實(shí)為中藥主要活性成分，故仍納入本研究。去重后共130個(gè)有效活性，其中共有成分13個(gè)，相應(yīng)靶點(diǎn)1809個(gè)，刪除重復(fù)值后245個(gè)，見表2，表3。

表2 肝樂顆?；钚猿煞峙c靶點(diǎn)預(yù)測信息

表3 肝樂顆粒藥物共有成分信息

2 構(gòu)建肝樂顆?！皾撛诨钚猿煞?靶基因”網(wǎng)絡(luò)圖

圖中橙色圓形為藥物成分，橙色箭頭形狀為藥物共有成分，藍(lán)色圓形為各中藥，綠色菱形為藥物靶點(diǎn)，

依據(jù)degree呈現(xiàn)節(jié)點(diǎn)面積及字體大小，面積越大說明該成分及靶點(diǎn)基因越重要。

網(wǎng)絡(luò)中共352個(gè)節(jié)點(diǎn)，1916條邊，其中藥物共有成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等對應(yīng)的靶點(diǎn)數(shù)目最多，這也反映了它們可能是肝樂顆粒發(fā)揮作用的核心，且不同藥物成分能夠作用于同一靶點(diǎn)或不同靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮功效，見圖1。

圖1 肝樂顆粒的“藥物—活性成分—靶點(diǎn)基因”網(wǎng)絡(luò)圖

3 CHB相關(guān)靶點(diǎn)篩選收集

依次檢索關(guān)鍵詞獲取CHB相關(guān)靶點(diǎn)，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選≥Score中位數(shù)靶點(diǎn)750個(gè)，最終獲得1729個(gè)CHB相關(guān)靶點(diǎn)，見圖2。

圖2 慢乙肝相關(guān)靶點(diǎn)

4 “肝樂顆粒—CHB”重合靶點(diǎn)與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

獲得交集靶點(diǎn)122個(gè)，見圖3。在String數(shù)據(jù)庫，設(shè)定“highest confidence”（＞0.9），余為默認(rèn)設(shè)置，隱藏EIF6、PYGM、PLB1等9個(gè)無關(guān)聯(lián)的游離節(jié)點(diǎn)后得到 PPI網(wǎng)絡(luò)，通過CytoScape內(nèi)置插件分析靶點(diǎn)拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)屬性值，以下靶基因可能是參與肝樂顆粒調(diào)治CHB的主要靶點(diǎn)，見圖4及表4。

圖3 肝樂顆粒與CHB交集圖

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?/p>

表4 兩種算法得到的交集靶點(diǎn)

5 GO與KEGG富集分析

GO分析共495個(gè)條目過程，BP分析可知核心靶點(diǎn)與病毒基因的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)，肝樂顆粒主要參與RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正、負(fù)調(diào)控、細(xì)胞凋亡與基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控、炎癥反應(yīng)、肝再生、細(xì)胞對病毒的反應(yīng)等295條生物過程。重合靶點(diǎn)的主要分子功能（MF）包括酶結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。此外，細(xì)胞組分富集顯示，胞漿（GO：0005829）、核（GO：0005634）、線粒體（GO：0005739）及膜筏（GO：0016020）被認(rèn)為是核靶的主要組成，見圖5。

圖5 GO富集分析

KEGG分析是將靶點(diǎn)富集到相應(yīng)生物學(xué)通路上，借以預(yù)測與疾病的聯(lián)系。本次富集177 條信號通路，其中癌癥通路、乙肝病毒、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶（AKT）通路富集最顯著，主要參與炎癥反應(yīng)與免疫調(diào)控作用。剔除卡波西肉瘤疹病毒感染、前列腺癌等無關(guān)通路，匯總納入后續(xù)差異富集度較高的JAK-STAT信號通路、NF-κ B信號通路、細(xì)胞因子及其受體相互作用信號通路、Th1 and Th2 細(xì)胞分化等信號通路，主要涉及細(xì)胞分化、凋亡及氧化應(yīng)激等的信號通路，見圖6。

圖6 KEGG富集分析

6 構(gòu)建“肝樂復(fù)方-成分-靶點(diǎn)-通路-CHB”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

基于KEGG富集分析與基因差異表達(dá)的相互映射，建立肝樂顆粒調(diào)治慢乙肝的系統(tǒng)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，見圖7。由圖1、表1與圖7的交合可以推測柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃芪甲苷（Ⅳ）、槲皮素、杧柄花素等是肝樂顆粒發(fā)揮療效的的必要成分，見表5。

表5 肝樂顆粒部分主要活性成分

圖中橙色箭頭代表與慢乙肝密切相關(guān)的前20條通路；通路富集差異基因487個(gè)，去重后共92個(gè)，其 中 IL-6、IL-1β、TNF-α、JNK、RELA、MAPK3、MAPK8等靶點(diǎn)在多條通路上均顯著富集。結(jié)合圖1，基于靶點(diǎn)-藥物成分相互映射，獲得藥物成分69種，以藥物共有成分的槲皮素、山奈酚、杧花柄素等為代表。

7 分子對接驗(yàn)證

選取表3中排名前10種活性成分和柴胡皂苷a、柴胡皂苷d及黃芪甲苷（Ⅳ）與核心靶蛋白進(jìn)行分子模擬對接，對接結(jié)合能均≤-6.1kcal/mol，其中對接最穩(wěn)定的是川陳皮素與MYC的結(jié)合（-10.2 kcal/mol），其次是柚皮素與RELA的結(jié)合（-10 kcal/mol），即本研究的活性成分均能與相應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)治慢乙肝的作用，見圖8。選取6對結(jié)合體進(jìn)行可視化展示，見圖9。

圖8 活性成分-靶蛋白對接熱圖

圖9 活性成分-核心靶點(diǎn)對接模式展示

討 論

肝樂顆粒主要是針對急、慢性肝炎及肝纖維化患者的特色院內(nèi)制劑，方中柴胡入肝膽經(jīng)，乃厥陰之報(bào)使，升發(fā)肝膽之氣，疏肝解郁；黃芪味甘，微溫，入脾經(jīng)而善補(bǔ)中氣，兩者相合，旨在肝脾同調(diào)；白芍養(yǎng)血柔肝，白術(shù)健脾復(fù)運(yùn)，輔以茯苓、豬苓、薏苡仁，滲濕利水兼補(bǔ)脾，標(biāo)本同治祛邪實(shí)，三者與芪術(shù)相伍又能“助土德以升木”；澤蘭活血利水，枳殼行氣寬中，茵陳利膽退黃清濕熱，板藍(lán)根涼血解毒清實(shí)熱，此四味乃契合慢乙肝“邪毒深伏血分，濕熱盤踞中焦，致肝郁不舒，脾虛濕盛”基本病機(jī)之妙用，使氣動血行濕亦化，毒解熱清臟腑調(diào)。

綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)肝樂顆粒參與調(diào)治CHB的化合物有130種，發(fā)揮核心功效的高達(dá)69種，其中以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃芪甲苷（Ⅳ）及黃酮類化合物（如槲皮素、杧花柄素）為代表。研究表明，黃芪甲苷（Ⅳ）能夠介導(dǎo)多條炎癥轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)及肝組織JNK、p38MAPK及NF-κB的磷酸化，發(fā)揮抗炎、抗纖維化的功效[5-6]。而黃酮醇類化合物槲皮素被稱為保肝劑，亦能有效改善肝纖維化及肝硬化[7]。柴胡皂苷a和柴胡皂苷d作為評定柴胡質(zhì)量的主要標(biāo)記化合物，已被證實(shí)具有抗炎、抗病毒、抗肝纖維化及免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[8-9]。據(jù)報(bào)道，慢乙肝患者比常人更易產(chǎn)生焦慮、抑郁等不良情緒[10]，杧花柄素則能通過NF-κB p65通路的介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)基底外側(cè)杏仁核（BLA）中NMDA、GluA1、GABAA受體及PSD95的上調(diào)性表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗焦慮、抑郁的作用[11]。

基于PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯▓D4與表5）及富集通路基因的差異表達(dá)，推測IL-6、 TNF-α及JNK可能是肝樂顆粒調(diào)治CHB的核心靶點(diǎn)。臨床研究表明CHB感染是多種免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子復(fù)制的過程，而炎癥反復(fù)存在是CHB進(jìn)展為肝硬化甚至HCC的重要因素。白細(xì)胞介素（IL）作為重要的免疫調(diào)節(jié)因子和炎癥介質(zhì)，在HBV持續(xù)感染復(fù)制并損害CD8+T細(xì)胞功能時(shí)，被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)并產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)[12]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的TNF-α可正反饋IL-6分泌與肝星狀細(xì)胞增殖，進(jìn)一步加重肝損傷及肝纖維化程度[13]。另有報(bào)道指出適當(dāng)水平的TNF-α可以激活內(nèi)源性抗病毒APOBEC蛋白并加強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的抗病毒活性，進(jìn)而誘導(dǎo)HBV的cccDNA降解和細(xì)胞凋亡[14]。JNK則是MAPK途徑中重要的信號通路，已有研究證實(shí)JNK在多種癌細(xì)胞中高度表達(dá)，并可能參與肝細(xì)胞癌的增殖與分化[15-16]。綜上研究可以明確IL-6、TNF-α、JNK等靶點(diǎn)可能在防治慢乙肝疾病進(jìn)展、惡化中有關(guān)鍵作用。

KEGG富集顯示肝樂顆粒主要介導(dǎo)乙肝病毒、癌癥、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等信號通路，其中乙肝病毒、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、癌癥通路、MAPK和PI3K-Akt信號通路富集程度最高。相關(guān)研究已證實(shí)MAPK和PI3K-Akt信號通路與肝纖維化、肝癌等肝損傷密切相關(guān)[18-19]。P13K/AKT通路是細(xì)胞分化、增殖和代謝及蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)中心，當(dāng)細(xì)胞被HBV感染后，可激活該通路并降低糖原合成激酶3-β（GSK3β）的表達(dá)，促使病毒細(xì)胞存活與增殖[20]。亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號通路上PI3K、AKT、mTOR等關(guān)鍵靶蛋白的表達(dá)，能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移并促進(jìn)其凋亡[21]。姜輝[22]等已證實(shí)肝樂顆粒能夠抑制PI3K通路的下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)，從而改善大鼠肝纖維化。常用抗病毒藥TDF（替諾福韋酯）抗纖維化作用的發(fā)揮，亦與抑制PI3K/Akt/mTOR通路因子的磷酸化，誘導(dǎo)HSC（肝星狀細(xì)胞）凋亡密切相關(guān)[23]。MAPK 作為傳遞細(xì)胞信號的使者，在調(diào)控細(xì)胞生長發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作，并與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等生理病理過程有關(guān)[24-25]。研究表明，通過下調(diào)肝組織中JNK、ERK和p38MAPK的表達(dá)，抑制MAPK的異常激活，能夠有效防治急性肝損傷[26]。以上研究從不同角度證實(shí)了肝樂顆粒通過PI3K-Akt和MAPK信號途徑的介導(dǎo)，具有降低肝損傷、改善纖維化、調(diào)節(jié)肝癌進(jìn)展的確切療效機(jī)制。

將對接結(jié)果經(jīng)PyMOL程序可視化后，發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃芪甲苷及槲皮素等均能與氨基酸殘基形成氫鍵和疏水作用，進(jìn)而緊密地結(jié)合在蛋白的口袋囊腔中，進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究對肝樂顆粒有效成分及核心靶點(diǎn)預(yù)測的可靠性。

通過客觀地分析肝樂顆粒與慢乙肝交集靶點(diǎn)映射構(gòu)建的核心關(guān)系網(wǎng)絡(luò)及成分、靶點(diǎn)的拓?fù)鋵傩?，初步明確了肝樂顆粒可能通過參與基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)、細(xì)胞的凋亡及其對病毒的反應(yīng)、氧化應(yīng)激和肝再生等生物學(xué)過程，調(diào)控乙肝病毒、癌癥通路、免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)等信號通路，進(jìn)而發(fā)揮治療慢乙肝的藥理作用。從基因、蛋白、信號通路等不同組學(xué)層面挖掘分析藥物活性成分與疾病的內(nèi)在聯(lián)系，有助于理解肝樂顆粒調(diào)治CHB多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜整體性，進(jìn)而明確傳統(tǒng)中醫(yī)藥療效的科學(xué)內(nèi)涵，為肝樂顆粒的開發(fā)應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，針對肝樂顆粒在體內(nèi)的具體作用機(jī)制，本課題組將進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。