王紫艷，時健，姚小磊，彭清華

1 湖南中醫(yī)藥大學 湖南長沙 410208

2 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 湖南長沙 410021

丹梔逍遙散是逍遙散加上梔子、牡丹皮組成，在《內(nèi)科摘要》中首次記載，主治肝郁脾虛血熱之證，是調(diào)節(jié)異常情志的經(jīng)典名方，具有健脾養(yǎng)血、清熱疏肝等作用，以柴胡為君，白芍、當歸為臣，三藥合用使郁結(jié)之肝氣調(diào)暢，佐以益氣健脾之白術(shù)、生姜、甘草及茯苓，配合丹皮、梔子清郁結(jié)日久所化之火，少許薄荷辛透肝熱，諸藥合用，達到“疏肝、健脾、清血熱”之效[1]。對肝郁化脾虛兼有熱尤為適合，可治療肝郁引起的多種病癥[2]。

對于丹梔逍遙散的使用，國醫(yī)大師伍炳彩靈活運用丹梔逍遙散治療血小板減少癥、更年期綜合征、指甲異常等疾病，充分體現(xiàn)其異病同治的精妙[3]。在干眼和抑郁的治療上也充分體現(xiàn)“異病同治”。在《中醫(yī)眼科學》中對于白澀癥—“干眼”肝經(jīng)郁熱證的患者采用丹梔逍遙散進行治療，現(xiàn)代醫(yī)家臨床應用丹梔逍遙散治療肝經(jīng)郁熱證的干眼患者療效顯著[4]?；厥姥蟮萚1]通過觀察丹梔逍遙散加減聯(lián)合人工淚液對比單純?nèi)斯I液治療肝經(jīng)郁熱證的干眼患者，發(fā)現(xiàn)加用丹梔逍遙散的患者全身癥狀改善，且淚液分泌量、BUT以及CFS等理化指標明顯改善。對于抑郁的治療也同樣取得了顯著的療效，徐婷通過觀察丹梔逍遙散聯(lián)合鹽酸氟西汀膠囊對比單純鹽酸氟西汀膠囊治療抑郁癥患者，發(fā)現(xiàn)丹梔逍遙散能夠控制患者的臨床癥狀，改善患者的認知功能，并對神經(jīng)營養(yǎng)因子進行調(diào)控，改善患者的預后以及減少不良反應的發(fā)生[5]。

干眼與抑郁關(guān)系密切，但是證據(jù)稀少，且對于其潛在的發(fā)病機制知之甚少，有學者認為干眼患者局部炎癥因子增加，與抑郁患者血液中的同樣增加的炎癥因子相似[6]，可能會導致相似的病理生理過程，從而出現(xiàn)上述現(xiàn)象，進而對其治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。丹梔逍遙散作為中藥復方，本身化學成分復雜，其臨床療效也是通過多種藥物多靶點、多途徑作用于疾病，丹梔逍遙散以疏肝泄熱、養(yǎng)血健脾功效為核心治療干眼和抑郁，其成分-靶點-通路-疾病間相互作用的網(wǎng)絡(luò)不清晰，使得該方的現(xiàn)代應用受到一定的局限，也是現(xiàn)在急需解決的問題。故此次研究的目的在于使用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接的方法分析干眼與抑郁之間的共有的基因蛋白以及可能相關(guān)的生物過程，并挖掘丹梔逍遙散“異病同治”干眼和抑郁的潛在的機制。

資料與方法

1 丹梔逍遙散的藥物活性成分及對應的靶點檢索

丹梔逍遙散的藥物組成成分有牡丹皮、梔子、當歸、白芍、柴胡、茯苓、白術(shù)、薄荷、生姜、甘草，在TCMSP平臺上檢索各藥物，將口服生物利用度設(shè)定為≥30%，藥物相似性設(shè)定為≥0.18，篩選得到藥物的有效成分；以此有效成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到藥物的作用靶點，將其與結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫一起導入perl軟件中，剔除無法匹配基因的靶點，其余靶點蛋白轉(zhuǎn)換為genensymbol。

2 干眼和抑郁疾病相關(guān)靶點檢索及交集靶點的可視化

在 DrugBank、TTD、OMIM、PharmGkb、GeneCards數(shù)據(jù)庫以"DryEye"為關(guān)鍵詞搜索得到干眼的相關(guān)靶點，以“depression”為關(guān)鍵詞搜索得到抑郁的相關(guān)靶點，將丹梔逍遙散有效成分作用靶點、干眼疾病靶點以及抑郁疾病靶點取交集作為藥物作用于疾病的潛在靶點，繪制藥物-疾病靶點的Venn圖。

3 構(gòu)建丹梔逍遙散-干眼-抑郁靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

將交集靶點導入String網(wǎng)絡(luò)平臺，蛋白物種設(shè)置為“Homosapiens”，置信度設(shè)定為＞0.9，篩除游離的靶點，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。圖中的節(jié)點代表蛋白靶點，邊代表靶點之間的關(guān)系。將節(jié)點關(guān)系信息導入到Cytoscape 3.9構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，并通過degree值明確丹梔逍遙散治療干眼與抑郁的共同核心靶點。

4 GO分析與KEGG

將藥物與疾病的共同靶點導入R x64 4.11軟件中，進行生物學過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及細胞成分（cellular component，CC）的 GO 功能富集分析以及KEGG富集分析，以明確丹梔逍遙散治療干眼與抑郁的調(diào)控通路。

結(jié) 果

1 丹梔逍遙散成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫的結(jié)果，共得到藥物活性成分187種，包括牡丹皮11種、梔子15種、當歸2種、白芍13種、柴胡17種、茯苓15種、白術(shù)7種、甘草92種、生姜5種、薄荷10種，得到藥物作用靶點共計個，其中牡丹皮237個，梔子363個，當歸69個，白芍123個，柴胡348個，茯苓30個，白術(shù)23個，甘草1769個，生姜75個，薄荷181個，將得到的數(shù)據(jù)導入perl軟件中，得到藥物有效靶點3095個。最后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白轉(zhuǎn)換為gene symbol，并進行篩重，共得到對應藥物基因2727個。

2 干眼和抑郁的疾病交集靶點-藥物靶點網(wǎng)絡(luò)

在 DrugBank、TTD、OMIM、PharmGkb、GeneCards數(shù)據(jù)庫分別以“depression”為關(guān)鍵詞，搜索抑郁癥的疾病靶點，以“dry eye”為關(guān)鍵詞，搜索干眼的疾病靶點，共計得到抑郁癥疾病靶點3663個，干眼的疾病靶點3020個，將藥物靶點及疾病靶點導入Draw Venn Diagram中，并繪制venn圖（圖1）。從圖中可以看出，丹梔逍遙散治療抑郁的作用靶點161個，治療干眼的作用靶點162個，共同靶點132個，另可看出抑郁與干眼的靶點具有較高的重合度，說明抑郁和干眼極有可能有相似的作用機制，132個共同靶點說明丹梔逍遙散在治療這兩種疾病的過程中起到重要作用。

圖1

3 丹梔逍遙散不同藥物成分與藥物靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

將丹梔逍遙散不同的藥物成分與藥物靶基因想互作用信息導入Cytoscape 3.9 軟件中，利用132個藥物靶點反向篩選得到122個活性成分，如圖2，其中深紫色代表柴胡，灰色代表生姜，青色代表甘草，黃色代表白術(shù)，藍色代表白芍，橙色代表牡丹皮，粉色代表梔子，綠色代表當歸，紫色代表薄荷，紅色代表茯苓。

圖2

4 丹梔逍遙散治療干眼-抑郁的PPI網(wǎng)絡(luò)與核心蛋白

使用STRING數(shù)據(jù)庫，篩選出置信度＞0.9的蛋白關(guān)系，構(gòu)建丹梔逍遙散治療干眼-抑郁的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果包括132個節(jié)點，436條邊，平均節(jié)點度值6.61，以節(jié)點度值表示靶點連線的邊數(shù)。度值大說明其可能是關(guān)鍵的有效活性成分靶點，和疾病靶點相互作用關(guān)系密切，在網(wǎng)絡(luò)中起到重要的作用（圖3）。

圖3

將靶點蛋白相互作用信息導入Cytoscape 3.9 軟件中，利用“CytoNCA”計算出各節(jié)點的介數(shù)中心性（Betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（Eigenvenctor centrality，EC）、基于局部平均連通性的方法中心性（Local Average Connectivity-based method centrality，LAC）和網(wǎng)絡(luò)中心性（Network centrality，NC），大于等于以上6組數(shù)據(jù)的中位值則符合標準，其中DC的中位數(shù)為5.5，BC的中位數(shù)為50.81490078，CC的中位數(shù)為0.1018149825，EC的中位數(shù)為0.0412268005，LAC的中位數(shù)為1.666666667，NC的中位數(shù)為2.5，篩選出大于等于中位數(shù)的靶點蛋白有32個，再利用“CytoNCA”計算32個靶蛋白的以上6組數(shù)據(jù)的中位值，其中DC的中位數(shù)為9.5，BC的中位數(shù)為10.2623952355，CC的中位數(shù)為0.574074074，EC的中位數(shù)為0.1417232755，LAC的中位數(shù)為4.8194444445，NC的中位數(shù)為6.100883838，篩選出大于等于中位數(shù)的靶點蛋白有14個，如圖4，從圖中可以看出 MYC、HIF1A、ESR1、EGFR、CDKN1A、TP53、FOS、STAT3、MAPK3、STAT1、MAPK14、AKT1、MAPK1、CASP3等靶點蛋白可能是丹梔逍遙散治療干眼-抑郁的關(guān)鍵靶點。

圖4

5 GO基因富集分析

使用R x64 4.1.1軟件對上述丹梔逍遙散與干眼-抑郁交集基因進行GO功能富集分析，根據(jù)P≤0.05，共篩選出2467個GO條目。包括75條細胞組成（cellularcomponent，CC）、178條分子功能（molecularfunction，MF）和 2214條生物過程（biologicalprocess，BP），根據(jù)P值將所有條目排序，分別取顯著性較高的前10種繪制氣泡圖（圖5），可以看出從生物過程分析，丹梔逍遙散治療干眼-抑郁主要與脂多糖反應、對氧化應激的反應、對異種生物刺激的反應、對金屬離子及輻射的反應等相關(guān)。從分子功能分析，治療主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合等。細胞成分主要涉及膜筏、膜微域、囊泡腔、質(zhì)膜外側(cè)等。

圖5

6 KEGG通路富集分析

使用R x64 4.1.1軟件對上述丹梔逍遙散與干眼-抑郁交集基因進行KEGG通路富集分析，根據(jù)P≤0.05，得到顯著富集的相關(guān)通路176條，按富集顯著度排列，選取30條KEGG通路（圖6）。

圖6

通過文獻查閱，發(fā)現(xiàn)與丹梔逍遙散治療干眼-抑郁較密切的通路有：脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路等信號通路，結(jié)合丹梔逍遙散治療干眼與抑郁的共同疾病靶點，繪制以下通路圖（圖7-9）。

圖7 脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路

圖8 HIF-1信號通路

圖9 MAPK信號通路圖

討 論

“異病同治”理論是《黃帝內(nèi)經(jīng)》治病必求于本的體現(xiàn)，充分體現(xiàn)了辨證論治理論特點，其是指對于不同的疾病，如存在相同的病因、病機或病位，可采用相同的治療法則，而著其中最關(guān)鍵的是不同的疾病在某一階段表現(xiàn)出來的相同的證及其所包含的病機。張仲景《傷寒論》中也提到“觀其脈證，知犯何逆，隨證治之”，這“證”正是“異病同治”理論的核心。

中醫(yī)認為肝郁化火可導致干眼和抑郁，中醫(yī)稱干眼為“白澀癥”或“神水將枯”，《黃帝內(nèi)經(jīng)》云：“五臟化液……肝為液。”淚液的生成、運行有賴于肝之條達，如若肝失條達，肝氣郁結(jié)而化火，則淚液虧少，眼失滋潤濡養(yǎng)，發(fā)為干眼[7]。抑郁屬于中醫(yī)“郁證”的范疇，抑郁患者或受外界情志刺激、或臟腑功能失常、或氣血陰陽失調(diào)，出現(xiàn)氣機紊亂、情志不暢，可使肝氣郁結(jié)、肝失疏泄，病變?nèi)站?，肝氣有余，壯火由生，火與郁相合，陽氣郁遏于體內(nèi)，火郁而生，且抑郁患者在長期服用抗抑郁藥物后，藥物助熱傷津，火郁進一步加重，在此基礎(chǔ)上祁明明等提出“火郁”是抑郁患者病情由輕轉(zhuǎn)重的重要病機[8]。

干眼是由于多種病因引起淚膜的質(zhì)、淚膜的量以及淚液動力學異常，從而導致淚膜不穩(wěn)定，或可合并眼表損害，從而出現(xiàn)眼部不適和（或）視功能障礙的疾病。因地域和環(huán)境的不同，干眼的患病率存在一定的差異，我國干眼的患病率分布在6.1%～59.1%[9]。且在導致抑郁的眼部疾病中，干眼占比最高[10]。其主要原因在于多數(shù)干眼患者需要反復就診治療，對干眼降低了生活質(zhì)量產(chǎn)生抱怨甚至悲觀的想法，最終導致抑郁的發(fā)生。抑郁主要特征表現(xiàn)為與其環(huán)境不相符合的顯著而持續(xù)的情緒低落，是由人們主觀產(chǎn)生的。多項研究表明較正常人而言，干眼患者抑郁陽性的幾率更高，且患者自覺干眼越嚴重，患抑郁的可能性越大且嚴重程度更大[11]。另有多項研究表明炎癥反應、免疫反應、線粒體能量代謝異常、氧化應激、HPA功能失調(diào)等在抑郁癥發(fā)病機制中起到重要作用[12]。干眼的發(fā)病機制主要與炎癥反應、細胞凋亡、性激素失調(diào)、神經(jīng)調(diào)節(jié)異常等有關(guān)[13]。

從西醫(yī)與中醫(yī)的角度均可看出干眼與抑郁可能存在相似的病理機制。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法研究干眼與抑郁之間的蛋白、有效成分、基因和相關(guān)的生物過程，以闡明丹梔逍遙散“異病同治”干眼與抑郁潛在的機制。

1 丹梔逍遙散治療干眼與抑郁的活性成分

通過對丹梔逍遙散成分—靶點網(wǎng)絡(luò)，以及相關(guān)文獻查閱，發(fā)現(xiàn)丹梔逍遙散治療干眼-抑郁的關(guān)鍵成分是槲皮素（quercetin）、柚皮素（naringenin）、木犀草素（luteolin）、蘆薈大黃素（aloe-emodin）、金合歡素（acacetin）、甘草查爾酮 A（licochalcone a）、山奈酚（kaempferol）等。槲皮素、山奈酚、木犀草素、金合歡素、甘草查爾酮A都是黃酮類化合物，大量研究表明黃酮類化合物具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗炎、抗血管生成、促凋亡和神經(jīng)保護等多種藥理活性[14]。

干眼與抑郁的發(fā)生伴隨著細胞內(nèi)的氧化應激的發(fā)生，而神經(jīng)元對脂質(zhì)（LD）毒性特別敏感，不能及時去除的LD的積累導致神經(jīng)元過氧化加速，并引起神經(jīng)變性，槲皮素、柚皮素與山奈酚均可減少過氧化的脂質(zhì)在細胞內(nèi)的沉積，進而抑制氧化應激[15，16]或減少細胞鐵凋亡[17]，從而保護細胞。

干眼與抑郁的發(fā)生發(fā)展在一定程度上與機體內(nèi)性激素水平相關(guān)，槲皮素、甘草查爾酮可調(diào)節(jié)雌激素受體活性[15，18]，山奈酚表現(xiàn)出雄激素樣活性，能與雄激素受體的ASN705和TNR877殘基結(jié)合，調(diào)節(jié)雄激素活性[19]，且其對細胞自噬有雙向調(diào)節(jié)作用[20]。

炎癥反應也是兩者的共同發(fā)病機制，槲皮素與柚皮素均可阻斷NK-kβ炎癥通路，進而減輕炎癥反應[15-16]，木犀草素可改變巨噬細胞M1（Inos，IL-1β，IL-6）/M2（Arg1，CD206，CD163，IL-10 和 IL-13）極化，通過p-STAT3的下調(diào)和p-STAT6的上調(diào)發(fā)揮抗炎作用[21]。全基因組轉(zhuǎn)錄組學分析表明，其可上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子、多巴胺能、河馬、和Wnt信號通路相關(guān)基因的表達，并下調(diào)p53、TNF、FOXO和Notch信號通路中的涉及的因子。并通過降低IL-6等炎癥因子的水平進而減弱炎癥反應，且可顯著增加LPS誘導的抑郁小鼠下丘腦中的成熟BDNF，多巴胺和去甲腎上腺素[22]。甘草查爾酮A可通過抑制TLR4-MAPK和Txnip-NLRP3信號通路有效地緩解脂多糖誘導的炎癥反應[23]。

蘆薈大黃素是一種天然的蒽醌衍生物，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗寄生蟲、神經(jīng)保護、肝保護活性[24]，金合歡素是天然黃酮類的一種，其抗氧化損傷作用明顯強于槲皮素、木犀草素等黃酮類化合物，其對視網(wǎng)膜急性損傷有明顯保護作用[25]。

2 丹梔逍遙散治療干眼與抑郁的作用機制

PPI網(wǎng)絡(luò)分析中得到丹梔逍遙散治療干眼-抑郁的主要靶點是 HIF1A、ESR1、EGFR、TP53、FOS、STAT3、MAPK3、STAT1、MAPK14、AKT1、MAPK1、CASP3等。HIF-1A是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可迅速適應低氧環(huán)境，從而觸發(fā)自噬，且在中樞及炎癥細胞浸潤區(qū)域同樣會出現(xiàn)高表達，調(diào)節(jié)炎癥、細胞凋亡、血管形成及誘導控制葡萄糖代謝[26]，研究表明在小鼠應激狀態(tài)下，HIF-1A與TET1之間存在特異性相互作用，其化合物在Ddit4基因（抑郁相關(guān)基因）的表達發(fā)揮重要作用，HIF-1A與Ddit基因啟動子區(qū)域的結(jié)合明顯增多，Tet1介導的表觀遺傳調(diào)節(jié)可能有助于重度抑郁癥連鎖基因的調(diào)控[27]，STAT1和STAT3都是STAT蛋白成員，可通過JAK-STAT信號通路，在免疫、細胞分裂、細胞死亡等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Ga?ecka M等研究發(fā)現(xiàn)在抑郁患者中JAK3表達增加，STAT1表達降低，但是對于本通路的調(diào)節(jié)是否參與抑郁癥的治療還需要進一步確定[28]。STAT3被抑制后能夠降低基質(zhì)金屬蛋白酶-3/9的表達，抑制角膜和結(jié)膜上皮細胞的凋亡，降低炎癥因子如IL-1β、IL-6、IL-17A和IFN-γ的水平，進而減緩干眼的眼表損傷[29]，同時，其可調(diào)節(jié)重要信號通路如AKT/PI3K/mTOR和Ⅰ型干擾素通路等，進而改善神經(jīng)炎癥[30]，另有研究表示其抑制在神經(jīng)系統(tǒng)損傷或神經(jīng)變性后可起到保護或有害作用，機制尚不清晰，以治療抑郁癥[31]。王嬌嬌等通過針刺干眼模型兔發(fā)現(xiàn)淚腺中STAT3、JAK2 mRNA表達增加，且淚腺中炎癥因子減少，表明JAK2/STAT3信號通路激活后的抗炎作用可能是治療干眼關(guān)鍵通路之一[32]。

FOS是中樞神經(jīng)元的代表物質(zhì)，主要分布在下丘腦、海馬體和丘腦，可能通過激活小膠質(zhì)細胞進而導致抑郁癥的發(fā)生及進展[33]；有研究表明慢性干眼引起的眼痛，中樞炎癥反應可能發(fā)揮重要作用，F(xiàn)OS的mRNA水平較高[34]。

MAPK1、MAPK3、MAPK14可能是另一組關(guān)鍵蛋白，通過p38-MAPK信號通路或ERK信號通路作用參與機體神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、激素的水平及炎癥反應，進而影響干眼及抑郁進展[35]。海馬體中磷酸化的p38 MAPK和裂解的CASP水平升高可能通過抑制細胞外信號相關(guān)激酶1/2的磷酸化，從而導致抑郁，且抑郁樣行為與磷酸化的p38MAPK、裂解的CASP3呈正相關(guān)[36]。進而調(diào)控細胞凋亡。

GO富集分析發(fā)現(xiàn)丹梔逍遙散治療干眼-抑郁主要與脂多糖反應、對氧化應激的反應、對異種生物刺激的反應、對金屬離子及輻射的反應等生物過程相關(guān)；富集結(jié)果顯示丹梔逍遙散可能通過多個生物過程來治療干眼與抑郁，達到“異病同治”的效果。結(jié)合KEGG富集分析數(shù)據(jù)可以看出，丹梔逍遙散治療干眼與抑郁主要涉及 TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路以及MAPK信號通路等信號通路；相關(guān)研究表明在抗抑郁治療開始早期，TNF信號通路通過上調(diào)TNF/TNF受體超家族含量，發(fā)揮組織再生和神經(jīng)發(fā)生減少，或可加速促炎進而治療抑郁[37]；另有研究表明TNF下調(diào)可改善干眼患者的炎癥[38]。與IL-17信號通路、HIF-1信號通路以及MAPK信號通路相應的各種關(guān)鍵蛋白中可以看出，三條信號通路主要參與機體內(nèi)炎癥反應、細胞凋亡及激素水平調(diào)控，進而治療干眼與抑郁。

綜上所訴，丹梔逍遙散的藥物成分能夠通過相同的通路作用于多個靶點，進而在其中發(fā)揮作用，如調(diào)控炎癥反應、細胞凋亡、激素水平，甚至是參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放并保護神經(jīng)，進而達到治療目的，這也進一步說明干眼患者可能同樣存在著神經(jīng)損傷，抑郁患者可能同時存在干眼，或伴有更嚴重的干眼癥狀，同時本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學對丹梔逍遙散治療干眼、抑郁的有效成分、核心靶點、關(guān)鍵蛋白、信號通路和作用機制進行了論述，為丹梔逍遙散的后續(xù)臨床研究提供了可靠的參考。