玉結珍，楊紅梅，趙清鴻，王柳乂，秘嘯然

1 廣西中醫(yī)藥大學 廣西南寧 530001

2 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院 廣西南寧 530011

支氣管擴張癥對應中醫(yī)診斷學“肺癰”“咳嗽”“咯血”等內容，中醫(yī)經典《諸病源候論·肺癰候》認為該病因寒邪侵襲肺，與血液相搏，結成了癰，再加上熱邪積聚，遂形成了膿。有學者認為本病以陰虛為本，邪熱為標，主張清肺化痰、清火養(yǎng)陰為主。廣西名中醫(yī)陳斯寧教授創(chuàng)立的科內協(xié)定處方清肺化痰湯，方藥組成及劑量如下：桑白皮、黃芩、瓜蔞殼、浙貝母、杏仁、蘇子、半夏、茯苓各10g，魚腥草20g，瓜蔞仁、甘草各6g，有止咳平喘、清肺化痰功效，方中主藥桑白皮、黃芩能起到清瀉肺熱作用；浙貝母、瓜蔞殼、魚腥草、瓜蔞仁化痰清熱，是不可或缺的輔藥；作為重要的佐藥杏仁、半夏、蘇子降氣化痰平喘，茯苓可以健脾滲濕，與甘草祛痰止咳。多項臨床研究發(fā)現(xiàn)清肺化痰湯可以降低慢阻肺痰熱壅肺證急性發(fā)作患者的C反應蛋白，改善肺通氣功能，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）以及各類血清炎癥因子等的表達受到抑制，使氣道炎癥得到控制，還能降低患者血清丙二醛（MDA）水平、升高超氧化物歧化酶（SOD）水平，達到提高抗氧化能力的作用[1-4]。

支氣管-肺組織感染以及支氣管的阻塞是支氣管擴張癥的重要病理因素，治療該病最主要是控制其炎癥反應[5]。網(wǎng)絡藥理學是通過多種數(shù)據(jù)庫搜索出方藥的多種有效成分、藥物與疾病的核心基因，構建網(wǎng)絡，最終剖析藥物作用于疾病的生物過程和作用通路，從而闡明藥物從多種途徑和多個靶點治療疾病的作用機制[6]。本文通過網(wǎng)絡藥理學，研究清肺化痰湯藥物中多個有效成分治療支擴的作用機理，尋找出清肺化痰湯治療慢性呼吸系統(tǒng)疾病的新靶點、新通絡。

研究方法

1 清肺化痰湯活性成分以及作用靶基因的選擇

清肺化痰湯活性成分通過中藥數(shù)據(jù)庫平臺TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）獲取，選出生物口服利用度OB≥30%并且類藥性分析DL≥0.18的活性成分，為得到藥物活性成分靶基因，翻閱相關資料，去掉沒有相應靶點的活性成分，最后獲得的基因在UniProt進行標準化，為下一步構建藥物與疾病網(wǎng)絡做準備。

2 清肺化痰湯活性成分和靶基因網(wǎng)絡的構建

利用得到的清肺化痰湯有效成分及標準化后的靶基因，制作Network和Type表格，導入Cytoscape3.7.2軟件上，構建藥物活性成分-靶基因網(wǎng)絡，設置Degree值，遴選出重要活性成分。

3 獲取支氣管擴張癥相關基因，得到支氣管擴張癥-清肺化痰湯疾病共同基因

為獲取支氣管擴張癥有關的基因，利用OMIM（https：//www.omim.org）、GeneCards（https：//www.genecards.org）兩個疾病數(shù)據(jù)庫，以“Bronchiectasis syndrome”為關鍵詞進行搜索，疾病-藥物共同基因需要取兩個數(shù)據(jù)庫得到的交集，刪除清肺化痰湯重復靶基因，韋恩圖利用疾病與藥物靶基因在Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ve）在線平臺上繪制。

4 制作PPI蛋白互作網(wǎng)絡，藥物-疾病核心基因需要將藥物疾病交集基因導入Cytoscape3.

7.2軟件上進行網(wǎng)絡拓撲分析后獲取STRING（https：//string-db.org/）網(wǎng)絡在線平臺可獲取藥物-疾病交集基因，即將藥物靶基因和疾病靶基因導到該平臺，選擇最低相互作用的閾值“Medium Confidence”為 0.4，蛋白屬種為“Homo Sapiens”，其他參數(shù)不變，將下載的TSV文件導入Cytoscape3.7.2軟件，利用CytoNCA插件進行網(wǎng)絡拓撲分析，選擇中度中心性DC、局部邊連通性LAC、接近中心性CC和特征向量中心性EC數(shù)值中位值，介度中心性BC值2倍的中位值進行設置，最后獲得相應的核心基因。

5 核心基因的GO功能注射以及KEGG通路分析在微生信網(wǎng)站平臺上進行

利 用 微生 信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）網(wǎng)站平臺，將清肺化痰湯-支氣管擴張癥核心基因導入到網(wǎng)站平臺中，對生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）分別進行注釋，設置P-value值＜0.05，并且基因富集個數(shù)BP大于個，CC大于3個，MF大于3個，得到最終502個生物過程，分別選取3個生物過程中的前10個，繪制柱狀圖。設置P-value值＜0.05，基因富集數(shù)大于4個，進行KEGG富集通路的分析，最終獲得99條通路。根據(jù)結果選取前40個KEGG通路制作富集氣泡圖。

研究結果

1 篩選清肺化痰湯活性成分

通過TCMSP平臺搜索清肺化痰湯各個藥物，查閱文獻，去除無相關靶點信息的活性成分，獲得活性成分247個，根據(jù)MOID搜索獲得靶基因共274個。有效成分統(tǒng)計半夏13個，茯苓15個，栝樓11個，黃芩36 個，苦杏仁18個，桑白皮32個，魚腥草7個，浙貝母7個，紫蘇子16個，甘草92個?？芍宸位禍ㄟ^多靶點、多成分發(fā)揮其作用。

2 構建清肺化痰湯有效成分和靶蛋白基因的網(wǎng)絡圖

將藥物有效成分和靶蛋白基因制作屬性文件，導入Cytoscape3.7.2軟件中，設置參數(shù)值獲得相應的網(wǎng)絡圖，見圖1（四邊形代表清肺化痰湯藥物，菱形四邊形代表預測靶點，菱形六邊形代表化合物，A1、B1、C1代表清肺化痰湯中藥物共有成分），根據(jù)網(wǎng)絡，設置degree值大小，該值與預測靶點之間的關系呈正相關，值越大關系越密切。最后根據(jù)Degree的值（50～153）選取清肺化痰湯關鍵成分，見表1。

表1 清肺化痰湯關鍵成分信息

圖1 清肺化痰湯藥物-成分-靶點網(wǎng)絡結果

3 支氣管擴張癥疾病基因靶點分析，獲取藥物與疾病共同基因

支氣管擴張癥疾病基因通過OMIM、GeneCards兩個疾病數(shù)據(jù)庫獲得，將所獲得的疾病基因全部導入表格，通過刪除重復值功能最終得到1289個疾病基因，清肺化痰湯藥物與支氣管擴張癥交集基因利用Venny2.1網(wǎng)絡在線平臺獲取，共獲得共同基因77個。如圖2所示。

圖2 清肺化痰湯藥物與支氣管擴張癥共同靶基因

4 藥物與疾病蛋白網(wǎng)絡構建結果分析，獲取藥物-疾病核心基因

藥物與疾病蛋白網(wǎng)絡在STRING網(wǎng)絡在線平臺上獲取，如圖3所示。將得到的TSV軟件導入Cytoscape3.7.2軟件中，核心基因藥物-疾病核心基因通過CytoNCA網(wǎng)絡插件獲得，設置相應的參數(shù)值，得到JUN（AP-1 轉錄因子亞單位）、MMP-9（基質金屬蛋白酶-9）、AKT1（AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶 1）、IL6（白細胞介素6受體）、CXCL8（白細胞介素8受體）IL10（白細胞介素10受體）、TNF（腫瘤壞死因子）、TP53（腫瘤蛋白 P53）等核心基因，可知清肺化痰湯通過上述核心基因發(fā)揮其作用。

圖3 藥物與疾病共同基因PPI蛋白網(wǎng)絡分析

5 GO 功能注釋結果分析

清肺化痰湯-支氣管擴張癥核心基因導入微生信在線網(wǎng)站平臺，分別進行分子功能、生物過程、細胞組分GO功能注釋，設置相應的參數(shù)，得到502個生物過程。涉及細胞對生長因子刺激的反應、RNA聚合酶II轉錄調控復合物、細胞因子、質膜蛋白復合物、蛋白磷酸酶結合等生物過程，如圖4，見表2。

表2 GO功能注釋和KEGG通路富集分析結果

圖4 GO 功能注釋分析

6 KEGG 通路富集結果分析

根據(jù)KEGG通路富集結果分析得出清肺化痰湯-支氣管擴張癥主要富集在toll樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、白介素-17信號通路、以及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAG信號通路、MAPK信號通路等通路。其中TNF信號通路參與的基因有AKT1，IL1B，IL6，JUN，MMP9，MAPK3，PTGS2，CCL2，CASP3，TNF。toll樣受體信號通路有 AKT1，IL1B，IL6，CXCL8，JUN，MAPK3，TNF基因參與等。如圖5所示，見表2。

圖5 KEGG 通路富集分析

討 論

1 支氣管擴張癥相關發(fā)病機制

惡性循環(huán)假說論述了支氣管擴張癥發(fā)病過程，強調了感染、炎癥和酶作用三個重要環(huán)節(jié)[7]。氣道炎癥是支氣管擴張癥發(fā)生和發(fā)展的核心。相關研究表明，中性粒細胞炎癥作為支氣管擴張癥患者氣道炎癥的重要環(huán)節(jié)，主要通過生成趨化因子和細胞因子，促進蛋白酶和微生物肽的釋放，導致機體發(fā)生炎癥反應[8-9]。而對于氣道炎癥，西醫(yī)多采用抗生素抗感染治療，但長期盲目使用抗生素控制感染容易出現(xiàn)細菌多重耐藥情況，以及藥物不良反應的發(fā)生[10]。因此有關酶作用和氣道炎癥的研究對研發(fā)新藥物治療支氣管擴張癥有顯著意義。

2 清肺化痰湯活性成分的作用機制

在藥物-成分-靶蛋白基因網(wǎng)絡中分析得出山萘酚、芒柄花黃素、槲皮素、豆甾醇、桑辛素F、以及黃芩素、β-谷固醇等關鍵成分。研究表明不僅促炎酶活性，受山奈酚的調控，還有相關炎癥基因的表達也受到山奈酚的調控，其發(fā)揮抗炎作用主要與抑制轉錄因子、基質金屬蛋白酶等有關[11]。山奈酚可以降低白細胞介素-8 和干擾素誘導蛋白-10、等炎癥因子釋放，來發(fā)揮抗炎作用，過程與PI3K、MAPK和Janus 激酶/信號轉導以及轉錄激活通路相關[12]。研究表明豆甾醇起到抗炎作用，與抑制環(huán)氧化酶-2的表達，促進一氧化氮合酶的表達密切相關[13]。有研究證明黃芩素具有抗氧化應激、抗炎、保護肝臟、神經元和心腦血管等生物學的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素有抗炎、抗病毒作用[15]。由此可知上述清肺化痰湯關鍵成分在治療支氣管擴張癥中發(fā)揮重要的抗炎作用。

3 清肺化痰湯治療支擴的靶點預測

由PPI蛋白互作網(wǎng)絡結果，得出清肺化痰湯與支氣管擴張癥共同基因，然后通過CytoNCA進行網(wǎng)絡拓撲分析，最終獲得清肺化痰湯作用于支氣管擴張癥的核心基因可能為JUN（AP-1 轉錄因子亞單位）、AKT1（AKT 絲氨酸 /蘇氨酸激酶 1）、MMP-9（基質金屬蛋白酶-9）、IL6（白細胞介素6受體）、IL10（白細胞介素10受體）、VEGFA（血管內皮生長因子A）、MAPK3（絲裂原活化蛋白激酶3）、TNF（腫瘤壞死因子）等。相關文獻發(fā)現(xiàn)支氣管擴張癥中基質金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶好及半胱氨酸蛋白酶失衡，會出現(xiàn)一定的肺功能障礙等[16-18]。絲氨酸蛋白酶可以通過蛋白水解來激活生長因子，不僅可以切割粘附分子，還有助于淋巴細胞的活化[19]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-8活性受MMP-9激活調控[20]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-6能夠引起炎癥反應，作用機理是加速B細胞增生分化，生成抗體[21]。CXCL8和TP53與腫瘤、癌癥相關，可以影響細胞的增殖、生長、侵襲和遷移[22-23]，通過抑制TP53減輕上皮細胞的凋亡和肺部炎癥[24]。

4 清肺化痰湯作用的生物過程和信號通路

通過GO功能注釋分析結果獲得核心基因主要富集于細胞對生長因子刺激的反應、RNA聚合酶II轉錄調控復合物、質膜蛋白復合物、蛋白磷酸酶結合等生物過程是對核心基因進行GO功能注釋的結果。多個生物學進程涉及了 AKT1、IL6、CXCL8、IL10、VEGFA、MAPK3、PTGS2、TNF、TP53等核心靶點。蛋白酶作為支氣管擴張癥多種作用機制中的分子，在調節(jié)炎癥、對抗感染以及參與肺組織重塑中發(fā)揮著重要作用[25]。通過 KEGG 通路結果分析，清肺化痰湯-支氣管擴張癥核心基因主要富集在腫瘤壞死因子通路、IL-17信號通路、MAPK 信號通路、toll樣受體信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路中。有研究表明可以通過抑制 MAPK 信號，從而抑制炎性反應，抑制細胞的凋亡[26]。toll樣受體信號通路需要Toll-IL 1受體（TIR）含結構域的適配器蛋白（TIRAP），蛋白激酶以及轉錄因子來傳遞信號，通過激活MAPK（絲裂原激活的蛋白激酶）和NF-κB來抑制炎癥反應。研究已證明p38 MAPK信號通路可以通過腫瘤侵襲、炎癥反應等途徑發(fā)揮在肺部疾病中的重要作用[27]。有研究發(fā)現(xiàn)抑制 p38 MAPK活化可以緩解平滑肌細胞增生從而改善氣道的重塑[28]。

根據(jù)以上結果分析，網(wǎng)絡藥理學研究得出清肺化痰湯中多種藥物含有β-谷固醇、桑辛素F、山萘酚、槲皮素、豆甾醇等成分，參與調控細胞對生長因子刺激的反應、RNA聚合酶II轉錄調控復合物、細胞因子、質膜蛋白復合物、蛋白磷酸酶結合等生物過程，主要核心基因有 MMP-9、TP53、IL10、MAPK1等，TNF信號通路、IL-17 信號通路、TLR信號通路是主要通路，還涉及的通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAG信號通路、MAPK信號通路，干預炎癥反應和酶的作用及細胞因子活性等過程，發(fā)揮抑制炎癥反應和減輕氣管損傷和氣道重塑的作用，其結果為臨床應用及后續(xù)實驗設計的優(yōu)化等提供了重要的理論依據(jù)。