萬(wàn)金娟，張國(guó)清，沈美芳*，林海，張美琴，邵俊杰

（1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；2. 江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211168）

在自然界和人工養(yǎng)殖條件下，水產(chǎn)動(dòng)物時(shí)常因季節(jié)變化、環(huán)境改變、投飼不均、食物短缺等因素影響，而受到饑餓脅迫。研究表明，饑餓脅迫，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)、形態(tài)學(xué)指標(biāo)、體組成、能量利用和腸道健康等方面，會(huì)產(chǎn)生顯著影響[1-4]。秋季是魚(yú)類生長(zhǎng)的高峰期，越冬期也將大量消耗魚(yú)類能量，因此秋季應(yīng)保證魚(yú)類攝取足夠多的能量，以滿足其越冬需求。由于部分養(yǎng)殖戶餌料投喂不足，導(dǎo)致魚(yú)體質(zhì)變差，甚至發(fā)生病害，這也是近年來(lái)淡水魚(yú)“越冬綜合征”暴發(fā)的主要原因之一[5]。

國(guó)內(nèi)外研究一直關(guān)注在饑餓狀態(tài)下水產(chǎn)動(dòng)物生理生化的變化，覃川杰等[6]發(fā)現(xiàn)，饑餓脅迫，可能會(huì)促進(jìn)瓦氏黃顙魚(yú)（Pelteobagrus vachelli）肝臟脂肪分解，降低脂肪的生物合成；Caruso 等[7]在歐洲舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）和黑斑鯛（Pagellus bogaraveo）的饑餓試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期饑餓，會(huì)降低魚(yú)體的免疫力；賴婷等[8]報(bào)道了克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）在面臨饑餓脅迫時(shí)，改變其能量物質(zhì)利用途徑，并產(chǎn)生強(qiáng)烈的腸道應(yīng)激反應(yīng)；冀東[9]也指出，饑餓20 d，顯著降低草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）的質(zhì)量增加率、肌肉粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的含量。近年來(lái)，饑餓對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物消化系統(tǒng)影響的研究，開(kāi)始由組織結(jié)構(gòu)和消化酶向腸道微生物群落結(jié)構(gòu)[10-14]轉(zhuǎn)變。腸道微生物存在于水產(chǎn)動(dòng)物胃腸道黏膜和內(nèi)容物中，在腸道健康中發(fā)揮著重要作用，影響著宿主的生長(zhǎng)發(fā)育、對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和免疫功能等[15-17]。因此，維持腸道菌群的平衡和穩(wěn)定，是保證魚(yú)類機(jī)體健康的關(guān)鍵。影響腸道菌群結(jié)構(gòu)的因素有很多，主要包括物種、宿主性別、養(yǎng)殖環(huán)境、生長(zhǎng)階段和餌料等[18-19]，其中餌料是影響腸道微生物群落的重要因素。

鳙（Aristichthys nobilis）屬硬骨魚(yú)綱（Osteichthyes），鯉形目（Cypriniformes），鯉科（Cyprinidae），鳙屬（Aristichthys），是我國(guó)主要淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一。近年來(lái)，其年產(chǎn)量維持約310 萬(wàn)t[20]，其產(chǎn)量在淡水魚(yú)中，僅次于青魚(yú)（Mylopharyngodonpiceus）、草魚(yú)（Ctenopharyngodonidellus）和鰱（Hypophthalmichthys molitrix）。鳙具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且肉質(zhì)鮮嫩，價(jià)格便宜，深受消費(fèi)者歡迎[21]。胡偉華等[22]研究了凈化時(shí)間對(duì)微流水系統(tǒng)中鳙品質(zhì)的影響。目前，關(guān)于饑餓脅迫對(duì)傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖環(huán)境下鳙的影響的研究未見(jiàn)報(bào)道?，F(xiàn)以鳙為研究對(duì)象，開(kāi)展了越冬前饑餓脅迫對(duì)鳙品質(zhì)和腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響試驗(yàn)，為進(jìn)一步探索鳙越冬前的養(yǎng)殖管理，提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

鳙幼魚(yú)（平均規(guī)格約為500 g/尾）來(lái)自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所浦口基地。挑選同一批次、規(guī)格整齊、健壯的鳙，于2021 年3 月14 日分別放入基地的2口池塘（均為2 668 m2）中，每667 m2放養(yǎng)100 尾。5 月5 日，開(kāi)始投喂市售淡水魚(yú)商品料（粗蛋白28%，粗脂肪4%），每日07：00 和18：00 分別投喂1 次，投喂量為魚(yú)體質(zhì)量的4%~5%。9 月1 日開(kāi)始饑餓脅迫試驗(yàn)，設(shè)置2 個(gè)試驗(yàn)組，其中一組為正常投喂組（對(duì)照組）；另一組不再投餌，為饑餓組。當(dāng)水溫自然下降到鳙停止攝食（水溫約15 ℃）時(shí)，試驗(yàn)結(jié)束（11 月18 日），采集樣品。試驗(yàn)期間，2 組魚(yú)均按照實(shí)際養(yǎng)殖管理模式，水溫15~29 ℃，pH 值6.7~7.9，ρ（溶解氧）4.1~5.9 mg/L，ρ（氨氮）＜0.48 mg/L。

1.2 樣品采集與分析

在2 口池塘分別采集6 尾魚(yú)，平均體質(zhì)量為（1.78±0.12）kg。在魚(yú)鮮活的狀態(tài)下，用采樣箱快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室（路程為1 h）。重?fù)趑~(yú)頭部致死，采其背部和腹部肌肉（每尾魚(yú)沿測(cè)線下方約采取50 g 腹部肌肉）。用解剖刀將背部肌肉制成1 cm×1 cm×1 cm 的小方塊，用于質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定；用研磨儀將腹部肌肉制成魚(yú)糜，用于肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分及氨基酸含量的測(cè)定。最后用乙醇擦拭魚(yú)體消毒，在無(wú)菌操作條件下，解剖取出腸道內(nèi)容物，并迅速置于液氮中冷凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，用于檢測(cè)腸道菌群。

1.2.1 肌肉質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[23]的質(zhì)構(gòu)剖面分析（TPA）方法，使用TA-XTplus 質(zhì)構(gòu)儀（英國(guó)Stable Micro System 公司），檢測(cè)硬度、彈性、內(nèi)聚力、咀嚼性和恢復(fù)性等肌肉質(zhì)構(gòu)參數(shù)。每尾魚(yú)測(cè)5 個(gè)平行。

1.2.2 肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定

分別根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》（GB 5009.3—2016）中直接干燥法、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5—2016）中凱氏定氮法、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》（GB 5009.6—2016）中索氏抽提法和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》（GB 5009.4—2016）中550 ℃馬弗爐灼燒法，測(cè)定肌肉中水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量[24]。每尾魚(yú)取1 個(gè)樣品。

1.2.3 肌肉氨基酸組成及含量的測(cè)定

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》（GB 5009.124—2016），使用LA8080 超高速全自動(dòng)氨基酸分析儀（日本HITACHI 公司），測(cè)定肌肉中氨基酸含量。每尾魚(yú)取1 個(gè)樣品。

1.2.4 腸道菌群16S rRNA 測(cè)序分析

每尾魚(yú)各取1 個(gè)腸道內(nèi)容物樣品，共計(jì)12 個(gè)樣品，送至上海凌恩生物科技有限公司，進(jìn)行DNA提取和測(cè)序分析。DNA 提取后，用細(xì)菌16S rRNA的V3-V4 區(qū)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為F:515F5’-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’,R:907R5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’。利用Illumina 公司的NovaSeq PE250 平臺(tái)，對(duì)菌群DNA 片段雙端（Paired-End）測(cè)序；對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，獲得Clean data；使用FLASH 軟件（version 1.2.7）進(jìn)行拼接；使用UPARSE 軟件（version 7.1），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類；采用RDP classifier（version 2.2），對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)（v138），基于注釋結(jié)果對(duì)樣品分析等[25-26]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用在線工具“Draw Venn Diagram”（http://bioinformatics.psb.ugent.be/web tools/Venn），繪制維恩圖，分析2 個(gè)試驗(yàn)組中重疊和獨(dú)特的OTU。肌肉各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019 軟件處理后，Alpha 多樣性[包括Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)（1-D）、coverage、Chao1 指數(shù)、Ace 指數(shù)等]通過(guò)Mothur v.1.21.1 軟件計(jì)算后，采用SPSS 23.0 軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（Independent samplest-test），進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05 表示差異顯著。結(jié)果均以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示。使用UniFrac 進(jìn)行Beta 多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 饑餓脅迫對(duì)鳙肌肉質(zhì)構(gòu)特性的影響

饑餓脅迫下鳙肌肉質(zhì)構(gòu)特性見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，饑餓組鳙肌肉的硬度、黏性、咀嚼性以及恢復(fù)性顯著高于正常投喂組（P<0.05）；2 組間魚(yú)肉的彈性差異不顯著（P>0.05）。

表1 饑餓脅迫下鳙肌肉質(zhì)構(gòu)特性①

2.2 饑餓脅迫對(duì)鳙肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響

饑餓脅迫下鳙肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量見(jiàn)表2。由表2 可見(jiàn)，2 組間鳙肌肉中水分、粗蛋白、粗脂肪含量均呈顯著性差異。其中，與正常投喂組相比，饑餓組的水分含量顯著提高；粗蛋白和粗脂肪含量顯著降低（P<0.05）。2 組間灰分含量的差異不顯著（P>0.05）。

表2 饑餓脅迫下鳙肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量（濕質(zhì)量基礎(chǔ)）①%

2.3 饑餓脅迫對(duì)鳙肌肉氨基酸組成的影響

饑餓脅迫下鳙肌肉氨基酸組成見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，饑餓組鳙肌肉中必需氨基酸、非必需氨基酸、鮮味氨基酸以及總氨基酸含量均顯著低于正常投喂組（P<0.05）；2 組間除蛋氨酸含量差異不顯著（P>0.05），其他氨基酸均為饑餓組含量顯著低于正常投喂組（P<0.05）。在氨基酸組成上，2 組間必需氨基酸、非必需氨基酸以及鮮味氨基酸總量占氨基酸總量的百分比差異不顯著（P>0.05），正常投喂組的必需氨基酸總量占非必需氨基酸總量的百分比（75.90%）顯著高于饑餓組（65.41%）（P<0.05）。

表3 饑餓脅迫下鳙肌肉氨基酸組成（濕質(zhì)量基礎(chǔ)）① %

2.4 饑餓脅迫對(duì)鳙腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

饑餓脅迫下鳙腸道微生物Beta 多樣性見(jiàn)圖1。由圖1 可見(jiàn)，PCoA 分析顯示，正常投喂組和饑餓組魚(yú)的腸道菌群組成存在明顯的差異。

圖1 饑餓脅迫下鳙腸道微生物Beta 多樣性（PCoA 分析）

饑餓脅迫下鳙腸道微生物Alpha 多樣性見(jiàn)表4。由表4 可見(jiàn)，與正常投喂組鳙腸道微生物多樣性相比，饑餓組魚(yú)腸道群落Shannon 指數(shù)顯著降低、Simpson 指數(shù)顯著提高，代表豐富度水平的Chao 1 指數(shù)在饑餓組顯著降低（P<0.05）；2 組間的Ace 指數(shù)差異不顯著（P>0.05）。

表4 饑餓脅迫下鳙腸道微生物Alpha 多樣性①

OTU venn 圖見(jiàn)圖2。由圖2 可見(jiàn)，正常投喂組和饑餓組，鳙腸道中獨(dú)有的OTU 分別為802 和215個(gè)，865 個(gè)OTU 為2 組共同擁有。

圖2 OTU venn 圖

在門水平上（圖3），正常投喂組鳙腸道中相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)門有變形菌門（Proteobacteria）（34.38%）、放線菌門（Actinobacteriota）（23.02%）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）（12.64%）和擬桿菌門（Bacteroidota）（6.95%）；饑餓組鳙腸道中相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)門有梭桿菌門（Fusobacteriota）（44.16%）、厚壁菌門（Firmicutes）（16.33%）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）（12.20%）、變形菌門（Proteobacteria）（7.84%）和放線菌門（Actinobacteriota）（8.62%）。與投喂組相比，饑餓組腸道變形菌門和放線菌門的豐度顯著降低，梭桿菌門和厚壁菌門的豐度顯著增加（P<0.05）。

圖3 各類群在門水平上的相對(duì)豐度

各類群在屬水平上的相對(duì)豐度見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，正常投喂組鳙腸道中，相對(duì)豐度較高（＞5%）的優(yōu)勢(shì)屬有Chloroplast_norank（9.63%）、PeM15_norank（7.70%）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）（6.39%）和羅河桿菌屬（Rhodanobacter）（6.04%）；饑餓組鳙腸道中，相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)屬有鯨桿菌屬（Cetobacterium）（44.14%）、迪爾瑪菌屬（Dielma）（8.70%）、藍(lán)細(xì)菌屬（Cyanobium PCC-6307）（6.12%）和PeM15_norank（5.80%）。與投喂組相比，饑餓組腸道鯨桿菌屬、迪爾瑪菌屬、藍(lán)細(xì)菌屬的豐度顯著增加（P<0.05）。

圖4 各類群在屬水平上的相對(duì)豐度

3 討論

魚(yú)類在生長(zhǎng)過(guò)程中，經(jīng)常面臨饑餓自然生理脅迫[27]。饑餓在改變魚(yú)體外觀形態(tài)和內(nèi)部器官的同時(shí)[2]，也會(huì)影響肌肉品質(zhì)。其中，以硬度、彈性、黏性、咀嚼性、恢復(fù)性等為代表的質(zhì)構(gòu)參數(shù)，可以直觀反映肌肉的品質(zhì)[28]。有研究[22，29]指出，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝會(huì)影響質(zhì)構(gòu)參數(shù)，其中肌肉硬度與脂肪代謝程度呈反比，即脂肪含量越低，肌肉硬度越大；也有研究表明，魚(yú)肉咀嚼性增加，會(huì)伴隨著肌肉中水分和脂肪的升高[30]。冀東[9]報(bào)道了草魚(yú)饑餓30 d后，其肌肉硬度、咀嚼性顯著提高。本試驗(yàn)也同樣發(fā)現(xiàn)，饑餓組鳙肌肉的硬度、黏性、咀嚼性和恢復(fù)性顯著提高，這與該組肌肉水分含量升高、脂肪含量下降有一定的關(guān)系。同時(shí)也有研究指出[22]，魚(yú)類在饑餓過(guò)程中，因?qū)ふ沂澄锒鰪?qiáng)運(yùn)動(dòng)活性，從而消耗脂肪，其肌肉硬度更接近于野生同類。

在饑餓狀態(tài)下，魚(yú)類不能直接從外界獲得必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，只能被迫動(dòng)用自身貯存的能量，來(lái)維持機(jī)體能量代謝平衡和生命活動(dòng)[31]，糖類、脂肪和蛋白質(zhì)作為機(jī)體的主要貯能物質(zhì)，在這個(gè)過(guò)程中，會(huì)被不同程度地分解利用[32-33]。在本試驗(yàn)中，長(zhǎng)期饑餓，導(dǎo)致鳙肌肉中粗蛋白、粗脂肪含量顯著降低，肌肉水分顯著升高。這與朱站英等[34]和武文一等[35]的研究結(jié)果一致。（Miichthys miiuy）幼魚(yú)經(jīng)不同程度的饑餓（0，3，6，9，12 和15 d）后，氨基酸含量顯著降低[36]；蘇蕙等[37]發(fā)現(xiàn)饑餓處理后，卵形鯧（Trachinotus ovatus）幼魚(yú)的氨基酸代謝途徑增強(qiáng)。本試驗(yàn)中，鳙在長(zhǎng)期饑餓脅迫后，肌肉氨基酸含量顯著降低。此外，饑餓組魚(yú)肌肉中鮮味氨基酸含量相對(duì)較低，可能是因?yàn)槠鋽z入營(yíng)養(yǎng)相較于投喂組更單一[38]。但是由于受品種、生長(zhǎng)發(fā)育階段、饑餓時(shí)間以及饑餓前魚(yú)類能量?jī)?chǔ)備的影響，魚(yú)類的能量代謝情況有所差異，導(dǎo)致對(duì)自身能量的利用也并不一致[22，39]；因此也有報(bào)道指出，饑餓對(duì)魚(yú)類體成分無(wú)顯著影響[6]。

魚(yú)類腸道微生物，在宿主營(yíng)養(yǎng)代謝和免疫調(diào)控進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[40-41]。腸道菌群的失衡，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，從而誘發(fā)疾病甚至死亡[42]。宿主營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的改變也能反作用于腸道菌群[43-44]。文獻(xiàn)[45]指出，在饑餓狀態(tài)下，機(jī)體也可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物種群的數(shù)量和組成結(jié)構(gòu)來(lái)適應(yīng)自身能量的需求。本試驗(yàn)中，鳙在遭受饑餓脅迫，其腸道微生物群落的多樣性和豐度顯著減低，表明饑餓處理，能顯著影響鳙腸道菌群的組成。圖2 結(jié)果也佐證了上述觀點(diǎn)。究其原因，可能是由于機(jī)體和腸道微生物，在機(jī)體饑餓狀態(tài)下同時(shí)面對(duì)能源危機(jī)，前者會(huì)傾向于縮小腸道“尺寸”[46-48]，從而導(dǎo)致后者相應(yīng)的發(fā)生菌群多樣性和相對(duì)豐度的改變。Semova 等[49]在斑馬魚(yú)（Danio rerio）饑餓試驗(yàn)中，同樣發(fā)現(xiàn)腸道微生物多樣性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。此外，本試驗(yàn)中，在正常投喂情況下，變形菌門、放線菌門、藍(lán)細(xì)菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌，饑餓脅迫可顯著影響其微生物結(jié)構(gòu)組成，其中差異最顯著的變形菌門在饑餓后下降，梭桿菌門在饑餓后增加。在菌群功能上，變形菌門作為許多水產(chǎn)動(dòng)物腸道中的常駐菌，是相對(duì)豐度最高的細(xì)菌門；變形菌門豐度的改變，通常會(huì)導(dǎo)致腸道微生物群落的失衡，因此其在腸道內(nèi)的比例，能夠反映腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，是腸道菌群失調(diào)的微生物標(biāo)志[50]。在人類潰瘍性結(jié)腸炎研究[51]中發(fā)現(xiàn)，梭桿菌門在腸炎患者腸道菌群中的豐度，相比于健康人群顯著增高，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。表明長(zhǎng)期饑餓，會(huì)提高鳙腸道梭桿菌門的豐度，導(dǎo)致腸炎的發(fā)生，但其中具體的影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在屬水平方面，饑餓組腸道鯨桿菌屬、迪爾瑪菌屬、藍(lán)細(xì)菌屬的豐度，相較于正常投喂組顯著增加。其中鯨桿菌，可通過(guò)激活魚(yú)的副交感神經(jīng)來(lái)改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)，并使胰島素表達(dá)增加[52]；此外，在未投喂餌料的情況下，浮游生物是鳙的主要食物；對(duì)浮游植物而言，鳙以濾食藍(lán)藻和綠藻為主[53]，因此饑餓組鳙腸道藍(lán)細(xì)菌屬水平，顯著高于正常投喂組。

4 結(jié)論

綜上所述，鳙在長(zhǎng)期面臨食物短缺時(shí)，會(huì)明顯改變其肌肉質(zhì)構(gòu)特性和營(yíng)養(yǎng)成分，具體表現(xiàn)為硬度、黏性、咀嚼性和恢復(fù)性顯著提高，粗蛋白和粗脂肪含量顯著降低；腸道優(yōu)勢(shì)菌群的組成結(jié)構(gòu)也隨之發(fā)生變化，菌群多樣性顯著降低，菌群失衡。因此，在鳙養(yǎng)殖過(guò)程中，越冬前應(yīng)保證合理的餌料投喂，以維持其肌肉品質(zhì)及腸道健康。