陳書秀，史良，趙楠，李霞，孫娟，李曉捷

（山東東方海洋科技股份有限公司，國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻與海參技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264003）

多肋藻（Costaria costata）是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一年生大型褐藻，在亞洲主要分布于日本北海道、朝鮮半島等海域，在我國(guó)無自然分布。其富含碘以及多種人體必需的微量元素，可以作為海參、鮑魚等海洋無脊椎動(dòng)物的餌料，也是海藻工業(yè)的重要原材料，具備提取褐藻膠、甘露醇、鉀等化工原料以及制備褐藻淀粉的應(yīng)用潛力[1-2]。目前，我國(guó)多肋藻養(yǎng)殖技術(shù)有了較大突破，已在山東榮成等地實(shí)現(xiàn)了人工養(yǎng)殖[3-4]。

多肋藻生長(zhǎng)期較短，1—4 月份生長(zhǎng)最為旺盛，5—6 月份產(chǎn)生孢子組織，6—7 月份藻體成熟。由于孢子體自然成熟時(shí)間晚，難以與人工育苗時(shí)間契合，配子體育苗是目前實(shí)現(xiàn)人工苗種適時(shí)培育最主要的手段。配子體育苗是通過控制光照、溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽成分等進(jìn)行配子體擴(kuò)增培養(yǎng)，然后對(duì)配子體進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)育、附苗和幼苗的培育過程。雖然多種常見海帶屬藻類的配子體發(fā)育模式已經(jīng)建立，但是關(guān)于多肋藻屬配子體發(fā)育方面的研究，在國(guó)內(nèi)外尚未見系統(tǒng)報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在多肋藻生態(tài)資源調(diào)查、分類學(xué)以及利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行種群分析等方面[5-7]，以及對(duì)多肋藻配子體世代的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律進(jìn)行觀察研究[8-9]。從發(fā)現(xiàn)了海帶屬藻類的異形世代交替現(xiàn)象開始，大量關(guān)于環(huán)境因子對(duì)海帶屬藻類配子體生長(zhǎng)發(fā)育的研究先后開展[10-14]，并且獲得了豐富的理論研究成果，這些成果為本研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。

現(xiàn)于2022 年9 月，在實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱中，開展了不同光照強(qiáng)度、光照周期對(duì)多肋藻配子體發(fā)育影響的試驗(yàn)，擬為進(jìn)一步加快多肋藻配子體細(xì)胞由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖發(fā)育階段轉(zhuǎn)變提供理論依據(jù)，進(jìn)而用較短的時(shí)間培育出更大規(guī)格的苗種，降低人工育苗成本，為海上養(yǎng)殖提供更加優(yōu)質(zhì)苗種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取適量的多肋藻雌雄配子體，經(jīng)循環(huán)泵處理，用孔徑為48 μm 的篩絹過濾，獲得含2~5 個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞段懸濁液，然后按照質(zhì)量比2∶1 混合，均勻攪拌成懸濁液。取一定量的懸濁液加入直徑12 cm 的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為添加硝酸鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸鐵的滅菌海水，海水中有效氮10 mg/L、有效磷1 mg/L、有效鐵0.5 mg/L，溫度10 ℃，藍(lán)光（波長(zhǎng)465~470 nm），于不同的光照強(qiáng)度、光照周期條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.1 光照強(qiáng)度試驗(yàn)

共設(shè)置7 個(gè)光照強(qiáng)度組，分別為10，20，40，60，80，120 和160 μmol/（m2·s）。各組培養(yǎng)條件相同，光照周期均為10L∶14D（L：光照時(shí)間；D：黑暗時(shí)間）。每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)平行。

1.1.2 光照周期試驗(yàn)

共設(shè)置5 個(gè)光照周期組，分別為6L∶18D，10L∶14D，12L∶12D，16L∶8D 和20L∶4D。各組培養(yǎng)條件相同，光照強(qiáng)度均為30 μmol/（m2·s）。每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2 指標(biāo)測(cè)定

在顯微鏡下觀察配子體的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，每3 d拍照1 次，試驗(yàn)周期30 d。

配子體發(fā)育率的計(jì)算：每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)觀察10個(gè)100×視野，分別統(tǒng)計(jì)卵囊形成、排卵、幼孢子體和總細(xì)胞數(shù)，按卵囊形成數(shù)、排卵數(shù)和孢子體數(shù)之和占總細(xì)胞數(shù)的百分比，計(jì)算發(fā)育率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS19.0 軟件對(duì)發(fā)育率進(jìn)行單變量方差分析和多重比較（P<0.05 表示差異顯著）。用Excel 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照強(qiáng)度、培養(yǎng)天數(shù)多肋藻配子體發(fā)育狀況

光照強(qiáng)度（P<0.001）、培養(yǎng)天數(shù)（P<0.001）及兩者交互作用（P<0.001）對(duì)多肋藻配子體的發(fā)育均有極顯著的影響（表1）。由表1 可見，第一行校正模型中的F=17.811，P<0.001，表明所用模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。效果量（Eta2）培養(yǎng)天數(shù)（0.835）大于Eta2光照強(qiáng)度（0.698）大于Eta2（光照強(qiáng)度×培養(yǎng)天數(shù)）（0.560），表明這3 個(gè)因素對(duì)多肋藻配子體發(fā)育的影響效應(yīng)為：培養(yǎng)天數(shù)大于光照強(qiáng)度大于（光照強(qiáng)度×培養(yǎng)天數(shù)）。

表1 不同光照強(qiáng)度、培養(yǎng)天數(shù)多肋藻配子體發(fā)育率方差分析①

不同光照強(qiáng)度條件下多肋藻配子體發(fā)育25 d后的光學(xué)顯微圖見圖1（a）（b）（c）（d）（e）（f）（g）。由圖1 可見，多肋藻配子體在7 種不同的光強(qiáng)條件下培養(yǎng)25 d 后，均有一定數(shù)量的配子體正常發(fā)育成孢子體，較低光強(qiáng)[0~60 μmol/（m2·s）]條件下仍有大量配子體細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)，發(fā)育率為40%~80%。當(dāng)光強(qiáng)≥80 μmol/（m2·s）時(shí)，僅有少量孢子體存活，無處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的配子體細(xì)胞，最終發(fā)育率＜20%。

圖1 不同光照強(qiáng)度多肋藻配子體發(fā)育25 d 后的光學(xué)顯微圖（10×10 倍）

不同光照強(qiáng)度多肋藻配子體發(fā)育率見表2。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，配子體發(fā)育率不同程度的增加，120 μmol/（m2·s）時(shí)，在第22 天達(dá)到最大值，第25 天稍有下降，其他試驗(yàn)組發(fā)育率均在第25 d 達(dá)到最大值。但相同光照強(qiáng)度下，第22 天與第25 天的發(fā)育率相比，無顯著差異。培養(yǎng)天數(shù)相同時(shí)，40 μmol/（m2·s）光照強(qiáng)度條件下的發(fā)育率最高，顯著高于10，80，120 和160 μmol/（m2·s）條件下的發(fā)育率（P<0.05），但與20 和60 μmol/（m2·s）條件下的發(fā)育率差異不顯著（P>0.05）。

表2 不同光照強(qiáng)度多肋藻配子體發(fā)育率①%

綜上所述，多肋藻配子體育苗時(shí)，若采用的光照周期為10L∶14D，在配子體發(fā)育成孢子體階段，光照強(qiáng)度建議保持在40 μmol/（m2·s），既有利于配子體快速由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化為生殖生長(zhǎng)，又可提高最終的孢子體密度。

2.2 不同光照周期多肋藻配子體發(fā)育狀況

光照周期（P<0.001）、培養(yǎng)天數(shù)（P<0.001）及兩者交互作用（P<0.001）對(duì)多肋藻配子體的發(fā)育均有極顯著的影響（表3）。由表3 可見，第一行校正模型中的F=19.044，P<0.001，表明所用模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Eta2光照周期（0.801）大于Eta2培養(yǎng)天數(shù)（0.787）大于Eta2（光照周期×培養(yǎng)天數(shù)）（0.586），表明這3 個(gè)因素對(duì)多肋藻配子體發(fā)育的影響效應(yīng)為：光照周期大于培養(yǎng)天數(shù)大于（光照周期×培養(yǎng)天數(shù)）。

表3 不同光照周期、培養(yǎng)天數(shù)對(duì)多肋藻配子體發(fā)育的方差分析結(jié)果①

不同光照周期條件下，多肋藻配子體發(fā)育25 d后的光學(xué)顯微圖見圖2（a）（b）（c）（d）（e）。由圖2可見，多肋藻配子體在5 個(gè)不同光照周期條件下培養(yǎng)25 d 后，均有部分配子體可正常發(fā)育成孢子體。在光周期6L∶18D 和20L∶4D 條件下，約有70%配子體仍處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)，僅有少量進(jìn)入生殖生長(zhǎng)（16%~30%），且孢子體長(zhǎng)度明顯小于其他3 組。

圖2 不同光照周期條件下，多肋藻配子體發(fā)育25 d 后的光學(xué)顯微圖（10×10 倍）

不同光照周期配子體發(fā)育率見表4。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，配子體發(fā)育率不同程度的增加，均在第25 d 達(dá)到最大值。相同的培養(yǎng)時(shí)間條件下，光照周期12L∶12D 時(shí)配子體發(fā)育率最高，但與10L∶14D的發(fā)育率差異不顯著（P>0.05），兩者的發(fā)育率均顯著高于其他3 組（P<0.05）。

表4 不同光照周期多肋藻配子體發(fā)育率①%

綜上所述，多肋藻配子體育苗時(shí)，若采用的光照強(qiáng)度為30 μmol/（m2·s），在配子體發(fā)育成孢子體階段，光照周期建議使用12L∶12D，有利于配子體快速同步發(fā)育。

3 討論

光照強(qiáng)度、光照周期對(duì)多肋藻配子體發(fā)育存在極顯著的影響（P<0.001）。經(jīng)Duncan 多重檢測(cè)法比較后，40 μmol/（m2·s）的光照強(qiáng)度和10L∶14D 的光照周期或30 μmol/（m2·s）的光照強(qiáng)度和12L∶12D的光照周期，對(duì)多肋藻配子體發(fā)育具有顯著的促進(jìn)作用。

3.1 光照強(qiáng)度對(duì)多肋藻配子體發(fā)育的影響

海帶配子體發(fā)育模式受光照和溫度等外界環(huán)境因子的影響而不同，主要表現(xiàn)在當(dāng)配子體初始細(xì)胞經(jīng)過一段時(shí)間的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)之后，如果外界環(huán)境因子適宜，配子體則進(jìn)入繁殖生長(zhǎng)階段，否則繼續(xù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)形成絲狀配子體。Borlongan 等[5]研究了多肋藻配子體階段和孢子體階段光合活性對(duì)PAR的響應(yīng)，結(jié)果表明，配子體對(duì)低光照強(qiáng)度有較高的適應(yīng)性，其補(bǔ)償光強(qiáng)為1 μmol/（m2·s），飽和光強(qiáng)為44 μmol/（m2·s），若連續(xù)6 h 處于100 μmol/（m2·s）時(shí)，配子體將受到光損傷，且無法恢復(fù)。而孢子體階段的飽和光強(qiáng)為243 μmol/（m2·s）。本試驗(yàn)得出了相似的結(jié)論，由圖1 可見，當(dāng)光照強(qiáng)度≥40 μmol/（m2·s）時(shí)，隨著光照強(qiáng)度的增加，配子體細(xì)胞數(shù)量顯著減少，80~160 μmol/（m2·s）時(shí)，僅有孢子體存活。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同光照強(qiáng)度下，多肋藻配子體發(fā)育存在顯著差異。在光照周期為10L∶14D、光照強(qiáng)度40 μmol/（m2·s）時(shí)發(fā)育率最高，且出現(xiàn)孢子體的時(shí)間早于其他各組。由此可見，40 μmol/（m2·s）光照強(qiáng)度更有利于多肋藻配子體的發(fā)育。一些學(xué)者的研究也得出與本研究相似的結(jié)論。付剛等[9]研究表明，當(dāng)溫度為15 ℃、光照強(qiáng)度為40 或60 μmol/（m2·s）時(shí)，多肋藻配子體的發(fā)育過程中的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段持續(xù)時(shí)間為3~5 d，之后即可進(jìn)入繁殖階段；而當(dāng)溫度較低（5 ℃）、較高（25 ℃）或者光照強(qiáng)度較低[20 μmol/（m2·s）]時(shí)，則不利于配子的發(fā)育成熟，配子體表現(xiàn)出旺盛的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)趨勢(shì)，且營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。

張喜昌等[15]研究表明，“中寶1 號(hào)”海帶（Saccharina japonica）配子體預(yù)發(fā)育的最適光照周期和光照強(qiáng)度為12L∶12D 和37.5 μmol/（m2·s）。陳書秀等[14]研究了光照強(qiáng)度對(duì)籠目海帶（Saccharina sculpera）配子體的發(fā)育，結(jié)果表明，在光周期為10L∶14D 時(shí)，籠目海帶配子體發(fā)育的最適光照強(qiáng)度為20~40 μmol/（m2·s）。Lee[16]的研究表明，當(dāng)光照強(qiáng)度為80 μmol/（m2·s）時(shí)，皺海帶（Laminaria relifiosa）配子體的繁殖率達(dá)到最大。Lüning 等[17]研究表明，通常條件下海帶配子體在充足光照下，會(huì)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，在低光照下，則維持營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)。

3.2 光照周期對(duì)多肋藻配子體發(fā)育的影響

藻類的生長(zhǎng)既與光照強(qiáng)度有關(guān)，也與光照時(shí)間的長(zhǎng)短密切相關(guān)。本試驗(yàn)中，配子體發(fā)育率在光照周期12L∶12D 時(shí)最高，且隨著光照時(shí)間的減少或降低，多肋藻配子體發(fā)育率明顯下降，在6L∶18D 和20L∶4D 時(shí)，大部分配子體仍處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)。由此可見，光照強(qiáng)度為30 μmol/（m2·s）時(shí)，多肋藻配子體發(fā)育的最適光照周期為12L∶12D。

陳書秀等[14]研究表明，籠目海帶在15μmol/（m2·s）光照強(qiáng)度下，較長(zhǎng)的光照時(shí)間（16L∶8D、20L∶4D），有利于促進(jìn)配子體的生殖生長(zhǎng)進(jìn)程，促進(jìn)卵囊的形成、受精卵的排放及孢子體的生長(zhǎng)。張?chǎng)蔚萚18]研究了不同光照周期對(duì)羊棲菜（Hizikia fusiformis）有性繁殖過程的影響，結(jié)果表明，長(zhǎng)光照周期可以明顯促進(jìn)卵子的排放，延長(zhǎng)卵子的存活時(shí)間，提高卵子的受精效率，有利于合子的發(fā)育與生長(zhǎng)。