劉海全，吳梅劍宗，蒙祖玉

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)惠州醫(yī)院骨科（廣東惠州 516000）

2.惠州市中醫(yī)醫(yī)院骨科（廣東惠州 516000）

3.暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院（廣州 510000）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis,OP）嚴(yán)重影響患者的健康水平，該病是一種全身性骨病，以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)損壞、骨脆性增加為主要病理變化。OP主要致病因素包括成骨潛能減弱和破骨潛能增強(qiáng)，原發(fā)性骨重塑失衡最終導(dǎo)致骨破壞[1]。目前，針對(duì)OP防治的研究更傾向于阻止骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，增強(qiáng)其向成骨細(xì)胞分化的能力[2]。因此，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）成骨分化是治療OP的潛在策略。中醫(yī)將OP歸屬于“骨痿”范疇，其主要病機(jī)是腎虛精虧，辨證論治以補(bǔ)腎為主。淫羊藿具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨之功，含有多種化學(xué)成分及微量元素，如淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿多糖等，具有抗炎、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、抗抑郁等作用，臨床應(yīng)用廣泛[3-4]。前期研究證實(shí)，中藥淫羊藿可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）、ADSCs的成骨分化[5]，其作用機(jī)制可能與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ）、Ajuba、Hippo信號(hào)通路相關(guān)?，F(xiàn)就淫羊藿防治OP與Ajuba/Hippo/PPARγ信號(hào)軸的相關(guān)性，以及可能存在的作用機(jī)制作如下綜述，旨在初步闡明淫羊藿防治OP相關(guān)分子的作用機(jī)制。

1 淫羊藿治療骨質(zhì)疏松癥的概述

1.1 中醫(yī)關(guān)于骨質(zhì)疏松癥的概述

中醫(yī)學(xué)中無(wú)“OP”這一病名，歷代中醫(yī)文獻(xiàn)記載中的“骨痿”“骨枯”等證的描述與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)OP的臨床表現(xiàn)及發(fā)病機(jī)制頗為相似?！端貑?wèn)·痿論》曰：“腎主身之骨髓，腎氣熱，則腰脊不舉，腎枯而髓減，發(fā)為骨痿”。腎藏精，主骨生髓，精化髓，骨賴(lài)髓以充養(yǎng)，腎精充足則髓充而骨堅(jiān)韌；腎精不足，骨髓空虛，骨失其養(yǎng)而脆弱無(wú)力，不耐久立和勞作。目前中醫(yī)將其歸屬于骨痿范疇，其主要病機(jī)是腎虛精虧，辨證論治以補(bǔ)腎為主。

1.2 淫羊藿概述

淫羊藿性味辛甘性溫，歸肝、腎經(jīng)；功善補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕，用于腎陽(yáng)虛衰、陽(yáng)痿遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣等癥。該藥功效古籍中亦有記載，《本草綱目》中稱(chēng)其有“益精氣，堅(jiān)筋骨，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力”之功效；《日華子本草》載“治一切冷風(fēng)勞氣，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力，丈夫絕陽(yáng)不起，女子絕陰無(wú)子，筋骨攣急，四肢不任，老人昏耄，中年健忘”。淫羊藿作為防治OP最常用的中藥之一，其安全性和有效性已被證實(shí)[6-7]。研究表明，淫羊藿具有抗OP、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、延緩衰老、抗腫瘤等作用，淫羊藿植物、酮類(lèi)物質(zhì)及活性單體多次被證明具有類(lèi)雌激素樣作用[8-9]。淫羊藿還參與調(diào)節(jié)大量與細(xì)胞因子、腫瘤、免疫、自噬、凋亡、神經(jīng)傳導(dǎo)、雌激素相關(guān)信號(hào)通路及生物過(guò)程[10-11]。

1.3 淫羊藿促進(jìn)骨細(xì)胞成骨分化

淫羊藿有效成分淫羊藿苷可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化、礦化結(jié)節(jié)形成與骨形成。同時(shí)，還能降低破骨細(xì)胞中鈣離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基，導(dǎo)致吸收陷窩面積減小，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收。淫羊藿苷作用機(jī)制包括：抑制膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（ferroportin 1,FPN1）表達(dá)，調(diào)節(jié)鐵死亡通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化[12]；保護(hù)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞，促進(jìn)其增殖，作用機(jī)制可能與調(diào)控成骨細(xì)胞ISR1/AKT/Runx2信號(hào)通路有關(guān)[13]；促進(jìn)負(fù)調(diào)控因子Gα13的表達(dá)，從而抑制其下游Akt-GSK3β-NFATc1信號(hào)通路以抑制破骨細(xì)胞形成[14]；上調(diào)Nrf2/HO-1信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞氧化應(yīng)激改變，增加破骨細(xì)胞內(nèi)ROS水平，提高破骨細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子水平，下調(diào)鐵代謝相關(guān)的GPX4基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控破骨細(xì)胞內(nèi)鐵代謝水平，增加其氧化應(yīng)激損傷，從而抑制破骨細(xì)胞形成和骨吸收[15]；增加去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度和骨礦含量，改善血清BGP、ALP、Ca水平，抑制成骨細(xì)胞凋亡；其機(jī)制可能與上調(diào)骨組織OPG mRNA表達(dá)、下調(diào)RANKL mRNA、RANK mRNA表達(dá)有關(guān)[16]。

1.4 淫羊藿促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

淫羊藿苷可直接抑制破骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，改善骨組織微結(jié)構(gòu)。多項(xiàng)研究表明，濃度為10-7mol/L的淫羊藿苷具有促進(jìn)雄性小鼠ADSCs成骨分化的作用[17-18]。此外，淫羊藿可促進(jìn)BMSCs成骨分化，抑制其向脂肪分化[19-20]。相較于BMSCs，ADSCs在來(lái)源、取材方法以及成果分化和繁殖速度等方面有更多優(yōu)勢(shì)[21-22]。因此，淫羊藿調(diào)控ADSCs成骨分化的研究和應(yīng)用價(jià)值更大。

研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿可促進(jìn)ADSCs成骨分化，抑制成脂分化[5]。進(jìn)一步通過(guò)RNA測(cè)序分析篩選出Ajuba基因，發(fā)現(xiàn)其在淫羊藿組誘導(dǎo)后表達(dá)明顯降低。同時(shí)結(jié)合基因集富集分析發(fā)現(xiàn)Ajuba與干細(xì)胞相關(guān)，結(jié)合測(cè)序結(jié)果中差異基因的通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路的差異基因占有較大比例；同時(shí)通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ajuba高表達(dá)，Hippo信號(hào)通路活性受到抑制。

2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨細(xì)胞的成骨分化作用

目前公認(rèn)的OP發(fā)病機(jī)制是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在塑造過(guò)程中失衡，成骨細(xì)胞數(shù)量和活性降低，破骨細(xì)胞數(shù)量及活性增加，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，造成骨質(zhì)疏松。此前研究多集中在BMSCs成骨分化方面，但是BMSCs體外培養(yǎng)對(duì)取材要求高，需從骨髓腔中取材，取材困難，且其來(lái)源少，更重要的是細(xì)胞增殖速度較慢，限制了其廣泛應(yīng)用。ADSCs是從脂肪組織中分離得到的一種多向分化的干細(xì)胞，可分泌包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等多種細(xì)胞因子[23]。ADSCs具有體內(nèi)儲(chǔ)存量大、可反復(fù)取材、容易獲取及增殖能力較強(qiáng)的特點(diǎn)，且具有免疫原性較低、成瘤性較低、移植排斥反應(yīng)較少的特點(diǎn)，是理想的種子細(xì)胞來(lái)源[2,24]。既往研究證實(shí)，應(yīng)用SDF-1、NELL-1單獨(dú)轉(zhuǎn)染，或兩者共轉(zhuǎn)染ADSCs，特別是兩種基因共同轉(zhuǎn)染，可顯著增強(qiáng)ADSCs的體外成骨效果[25]；合適的應(yīng)力刺激可以提高ADSCs內(nèi)成骨相關(guān)mRNA表達(dá)，并促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化[26-27]。卓麗丹等研究證實(shí)，BMSCs和ADSCs生物學(xué)性狀穩(wěn)定，均具有成骨分化潛能；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示P3代ADSCs的增殖能力強(qiáng)于BMSCs[28]。上述研究表明ADSCs在受到物理、化學(xué)等刺激時(shí)可通過(guò)不同機(jī)制加強(qiáng)ADSCs成骨分化傾向。

3 Ajuba蛋白調(diào)控Hippo通路參與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

3.1 PPARγ與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制、干細(xì)胞成脂分化關(guān)系

PPARγ主要在脂肪組織中表達(dá)，調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化，其中PPARγ2較特異地在脂肪組織中表達(dá)，被誘導(dǎo)后啟動(dòng)脂肪細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄，是促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化最關(guān)鍵的調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)活化PPARγ可促進(jìn)ADSCs向脂肪細(xì)胞分化，抑制成骨分化[29]。Sirtuin 蛋白家族是一類(lèi)高度保守的、NAD+依賴(lài)的蛋白去乙?；负?ADP 核糖基轉(zhuǎn)移酶，在卡路里限制、細(xì)胞壽命調(diào)控和多種糖脂代謝中起重要作用。其中Sirt1為Sirtuin 蛋白家族重要成員之一，調(diào)控多種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，具有平衡干細(xì)胞的靜息與增殖、維持干細(xì)胞自我更新功能、緩解年齡相關(guān)性成體干細(xì)胞功能下降和抑制成體干細(xì)胞分化紊亂的作用。研究發(fā)現(xiàn)Sirt1是PPARγ2的上游調(diào)控因子，可使PPARγ2乙?；?，從而抑制其活性[30]。應(yīng)用淫羊藿含藥血清干預(yù)去勢(shì)大鼠BMSCs，能夠有效上調(diào)Sirt1表達(dá)水平，抑制PPARγ表達(dá)，促進(jìn)BMSCs成骨分化、抑制其成脂分化的作用，從而發(fā)揮淫羊藿對(duì)OP的防治作用[31-32]。

3.2 Hippo通路與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制

進(jìn)化上高度保守的Hippo信號(hào)通路是細(xì)胞正常生命活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)器，其在調(diào)控器官發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展和組織穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。近年來(lái)，Hippo信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨代謝的潛在生物學(xué)機(jī)制成為該領(lǐng)域又一研究熱點(diǎn)。哺乳動(dòng)物Yes相關(guān)蛋白（yes-associated protein,YAP）/攜帶PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔助激活物（transcriptional coactivator,TAZ）為Hippo信號(hào)通路核心組件，在其上下游多種轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)下，Hippo信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等細(xì)胞的生理活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，Hippo途徑通過(guò)激酶級(jí)聯(lián)控制YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄輔活化因子的活性，這一途徑在細(xì)胞分化和組織生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用[33]。YAP和TAZ是兩種促進(jìn)細(xì)胞增殖、干細(xì)胞維持和組織穩(wěn)態(tài)的同源轉(zhuǎn)錄輔激活因子。Hippo通路參與成骨分化，TAZ能與Runx2結(jié)合入核，促進(jìn)成骨相關(guān)基因表達(dá)，從而促進(jìn)成骨分化[34]。胡佳安等研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs體外成骨分化過(guò)程中TAZ表達(dá)上調(diào)，而在成脂分化中其表達(dá)降低[35]；TAZ激動(dòng)劑TM-25659可以促進(jìn)ADSCs中TAZ的表達(dá)，并增強(qiáng)ADSCs體內(nèi)成骨及骨生成能力；當(dāng)TAZ通過(guò)WW結(jié)構(gòu)域與PPARγ的PPXY模體結(jié)合后，抑制PPARγ活性，進(jìn)而抑制ADSCs向脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化[36]。同時(shí)，YAP也有類(lèi)似的作用。磷酸化的YAP可在細(xì)胞核內(nèi)與Runx2結(jié)合，促進(jìn)BMSCs成骨分化，抑制其成脂分化，且其成骨分化程度與細(xì)胞骨架密度呈正相關(guān)[37]。

3.3 Ajuba與PPARγ、Hippo信號(hào)通路相關(guān)性

Ajuba分子屬于Zyxin/Ajuba家族，作為支架蛋白或銜接蛋白參與細(xì)胞黏附、增殖、遷移等功能，其在調(diào)節(jié)器官發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞增殖反應(yīng)、修復(fù)受損組織和早期癌癥發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并在細(xì)胞增殖過(guò)程中限制Hippo信號(hào)通路活性[38]。YAP1是Hippo信號(hào)通路下游的主要效應(yīng)因子。在哺乳動(dòng)物和果蠅細(xì)胞中，Ajuba可以通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)的Hippo激酶復(fù)合物，使YAP1去磷酸化，抑制Hippo信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[39]。Ajuba是細(xì)胞成脂分化的重要調(diào)節(jié)劑，是一種新型的PPARγ相互作用蛋白。Ajuba與LPL啟動(dòng)子的結(jié)合在很大程度上取決于PPARγ的存在，進(jìn)而可以增強(qiáng)Ajuba和PPARγ的DNA結(jié)合，Ajuba通過(guò)其preLIM區(qū)域直接結(jié)合PPARγ的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，需要Ajuba才能最大程度地激活PPARγ，Ajuba和PPARγ協(xié)同作用激活靶基因的表達(dá)。此外，Ajuba通過(guò)與C/EBPβ的相互作用促進(jìn)C/EBPβ與PPARγ和C/EBPα啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)脂肪生成[40]。Ajuba可以免疫沉淀內(nèi)源性p300和CBP，是PPARγ有效募集p300/CBP所必需的目標(biāo)染色質(zhì)，可通過(guò)其LIM域?qū)300/CBP募集到PPARγ，表明PPARγ與Ajuba成員選擇性相互作用[41]。

根據(jù)上述研究可以初步推斷，在OP發(fā)病機(jī)制中，PPARγ、Hippo通路、Ajuba三者之間存在著密切的關(guān)聯(lián)性；結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)研究，中藥淫羊藿作用于ADSCs防治OP的作用機(jī)制，可能與其通過(guò)Ajuba/Hippo/PPARγ通路誘導(dǎo)ADSCs成骨分化有關(guān)。

4 結(jié)語(yǔ)

間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化減少、成脂分化增加導(dǎo)致的骨平衡失穩(wěn)是OP發(fā)生的重要因素之一，通過(guò)促進(jìn)ADSCs成骨分化、增加骨形成可以作為OP的潛在治療方案[42-43]。此外，還有研究表明通過(guò)移植ADSCs可以改善去勢(shì)大鼠的骨量流失[44]；通過(guò)淫羊藿苷干預(yù)可以提高復(fù)合支架共培養(yǎng)ADSCs的存活率并促進(jìn)其成骨分化[45]。然而，ADSCs具有多種分化潛能，其中的調(diào)控機(jī)制尚不十分明確。結(jié)合前期工作及目前研究情況，故推測(cè)淫羊藿誘導(dǎo)ADSCs成骨分化，抑制其成脂分化，可能通過(guò)調(diào)控Ajuba/Hippo/PPARγ信號(hào)軸發(fā)揮相關(guān)作用。Ajuba/Hippo/PPARγ信號(hào)軸在淫羊藿刺激誘導(dǎo)ADSCs成骨及成脂的分化過(guò)程中起著重要的作用，探明其作用相關(guān)分子機(jī)制將為淫羊藿干預(yù)ADSCs的臨床干細(xì)胞治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，明確淫羊藿促進(jìn)ADSCs成骨分化的分子機(jī)制，為淫羊藿防治OP的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，臨床應(yīng)用ADSCs治療OP仍存在許多問(wèn)題，如治療途徑、移植治療后細(xì)胞遷移及歸巢等。下一步研究中，將致力于藥物干預(yù)后干細(xì)胞臨床治療的相關(guān)研究，以獲得更為有效的OP診療方法。