陳同強，吳海智，梁 鋒，向 俊,2，彭程程，陳 惠，邱亞鋒，荊輝華，鄒子爵，彭國泰，李凱龍*

（1.湖南省產商品質量檢驗研究院，湖南 長沙 410007；2.中南大學化學化工學院，湖南 長沙 410083；3.湖南省農業(yè)科學院植物保護研究所，湖南 長沙 410125）

植醇，又名葉綠醇（或葉黃烯醇），屬于一類不飽和高級醇，廣泛存在于自然界植物中，其為葉綠素的組成部分之一。葉綠素通過一定條件下水解可產生植醇[1-4]，自然界中的植醇包括E構型和Z構型2 種異構體[5]。在有機化工及醫(yī)藥工業(yè)行業(yè)，植醇為重要的生產原料，隨著現代經濟的迅速發(fā)展，植醇的市場需求量處于上升趨勢。植醇可作為生產護膚品的主要原料之一，能促使皮膚、毛發(fā)等變得更加有光澤，同時還具備一定的保濕作用[6]。

植物性乳制品相對于動物性乳制品的優(yōu)勢主要體現在兩方面：一是清爽的口感，二是豐富的口味[7-9]。植物原料中脂肪含量相對偏低，如工藝合適，植物脂肪會比動物脂肪味道更加清淡，這樣發(fā)酵出的植物酸乳產品也會更加清爽[10-12]，同時帶有植物原料的自然與清甜，無油膩感[13-15]。因動物類制品的高攝入，許多消費者開始出現肥胖、高血脂、高尿酸等疾病[16-18]。因此，低糖、低脂、高膳食纖維膳食成為熱門食品發(fā)展的趨勢[19-21]。消費者開始關注食品標簽和營養(yǎng)成分含量，越來越青睞于天然產品，避免人工添加[22-23]。因此，植物性乳制品是不錯的選擇，而且植物性乳制品中含有特有功能成分，如膳食纖維、植物甾醇等，這些化合物均有利于身體健康[24-26]。

植醇對于內分泌有很好的輔助效果，具有刺激肝臟活力、促進血液循環(huán)、平衡內分泌、平衡神經等功效[27-30]。植物性乳制品中往往會因原料引入植醇，然而，目前關于食品中該類物質含量的檢測方法報道卻鮮見。李建法等[31]建立了松針軟膏不皂化物中植醇含量的測定方法。本研究采用固相萃取結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術，建立植物性乳制品中植醇對映異構體含量的檢測方法，并對10 種常見植物性乳制品中植醇對映異構體的含量進行測定，為植醇的檢測提供技術支持，為其廣泛應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物性乳制品（酸乳），購于淘寶，共10 份。

C18固相萃取小柱（500 mg，6 mL）、植醇（1 g，98.0%）、石油醚（分析純，500 mL）、乙酸乙酯（色譜純，4 L）、乙醚（分析純，500 mL） 上海安譜實驗科技股份有限公司；其他所用試劑均為色譜純。

1.2 儀器與設備

7890B-5977B GC-MS儀（配備HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

植醇標準儲備混合溶液（1 000 μg/mL）：準確稱取植醇標準品10 mg置于容量瓶中，甲醇溶解后定容至10 mL，渦旋混勻，－4 ℃冰箱中保存。

植醇標準工作混合溶液：準確移取1 000 μg/mL植醇標準儲備混合溶液1.0 mL于100 mL容量瓶中，加入甲醇并定容，即得中間標準混合溶液（質量濃度10 μg/mL），再分別準確移取中間標準溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、1.00 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，渦旋混勻，即得質量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、1.00 μg/mL的系列混合標準工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取試樣10.0 g（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管，加少量水浸濕后，加入20 mL石油醚，渦旋振蕩提取10 min后，以5 000 r/min、－4 ℃冷凍離心5 min，吸取上層有機層于梨形瓶中，重復上述提取過程1 次，提取液于梨形瓶中合并，35 ℃減壓條件下揮發(fā)至近干。

加入5 mL乙酸乙酯溶解上述提取物，將樣液全部轉移至C18固相萃取柱后，靜置平衡10 min，采用15 mL乙酸乙酯-乙醚混合溶液（2∶1，V/V）洗脫，收集洗脫液于塑料離心管中，加入3 g無水硫酸鈉于洗脫液進行脫水。減壓濃縮（溫度控制在35 ℃以下）除去溶劑，揮發(fā)至近干，加入0.5 mL甲醇渦旋振蕩30 s，繼續(xù)減壓濃縮至除盡乙酸乙酯-乙醚溶液，用甲醇定容至1.0 mL，混勻后，0.22 μm濾膜過濾，制得試樣待測液，備用。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 GC條件

進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，以2 ℃/min速率升至90 ℃，再以40 ℃/min速率升至270 ℃，保持5 min；載氣：高純氦氣；設置流速為1.0 mL/min；進樣方式：不分流；進樣體積1.0 μL。

1.3.3.2 MS條件

電離方式：電子轟擊；離子源溫度230 ℃；GC-MS接口溫度280 ℃；監(jiān)測方式：選擇性離子監(jiān)測；監(jiān)測離子：定性離子m/z71、81、95，定量離子m/z123。

1.3.4 結果計算

式中：X為樣品中植醇對映異構體含量/（mg/kg）；ρ為測定液中植醇對映異構體的含量/（μg/mL）；V為樣品測定液的定容體積/mL；m為樣品質量/g。

1.4 數據處理

采用Excel 2010軟件進行數據處理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

選用HP-1701MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、HP-INNOWAX-MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）3 種常見不同極性毛細管色譜柱進行實驗，結果表明，HP-5MS具有較好分離效果，而采用其他2 種色譜柱進行分析時，色譜峰拖尾現象較為嚴重，且目標組分與雜質分離效果較差，對結果定量存在較大的干擾。同時，柱箱的升溫程序對各組分分離度也存在一定影響。最終經過多次實驗摸索，參照1.3.3.1節(jié)升溫程序時，實驗樣品中雜質峰干擾小，并且能獲得較滿意的分離效果。

2.2 提取方法的選擇

實驗室常見的提取方法主要包括3 種：索氏提取、超聲提取及液-液萃取。索氏提取存在過程復雜、溶劑消耗量大、不經濟等缺點；液-液萃取，對于乳制品易出現乳化現象，造成提取效率下降；而超聲提取則具有簡單、適合大批量樣品處理且提取效率較高等特點，所以綜合考慮，選擇超聲提取作為提取本實驗樣品的方法。

2.3 提取溶劑的選擇

因植醇屬于脂溶性化合物，實驗室常見可供選擇的提取試劑有乙腈、乙酸乙酯、正己烷、石油醚等。比較上述4 種常見提取溶劑對花生酸乳中植醇對映異構體的提取效率。由圖1可知，相同加標水平（1.0 mg/kg）下，正己烷與石油醚提取效率相當，植醇對映異構體的加標回收率均維持在90%左右，高于其他2 種提取試劑，但考慮到石油醚經濟成本較低，故選擇石油醚作為植物性乳制品中植醇對映異構體的提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對花生酸乳中植醇加標回收率的影響（n= 3）Fig. 1 Effect of different extraction solvents on spiked recoveries of phytol (n = 3)

2.3 凈化方法的選擇

因植物性乳制品中含有豐富的脂肪、蛋白質、糖類等化合物，屬于基質復雜樣品，易對目標物產生干擾，因此需對其進行凈化處理。實驗室常見的凈化方法有弗羅里硅土固相萃取柱凈化、C18固相萃取柱凈化及QuEChERS凈化管（內含乙二胺-N-丙基硅烷、硫酸鎂等填料）凈化3 種方式。通過相同水平（1.0 mg/kg）加標實驗比較3 種方式的凈化效果。由圖2可知，樣品經超聲提取后的樣液經C18固相萃取柱凈化處理后，植醇加標回收率高于其他2 種凈化方式，因此，選擇C18固相萃取柱作為植物性乳制品中植醇檢測的凈化方法。

圖2 不同固相萃取柱對花生酸乳中植醇加標回收率的影響（n= 3）Fig. 2 Effect of different SPE columns on spiked recoveries of phytol (n = 3)

2.4 標準譜圖與線性范圍

由圖3可知，植醇對映異構體色譜峰型均呈現良好，二者分離效果好，且附近均無雜質峰干擾。同時，實驗選取的對映異構體定量離子均為m/z123，該離子豐度較高，便于準確定量。分別以植醇對映異構體的質量濃度為橫坐標（μg/mL），響應峰面積為縱坐標繪制標準曲線，在0～1.0 μg/mL范圍內線性關系均良好，r均大于0.999。

圖3 植醇對映異構體標準品的選擇性離子監(jiān)測譜圖Fig. 3 Selected ion monitoring chromatograms of phytohydrin enantiomers

2.5 方法檢出限與定量限

注入一定質量濃度的植醇標準溶液1.0 μL，將3 倍信噪比作為本實驗方法的檢出限，經計算得E構型與Z構型植醇檢出限分別為0.03、0.04 mg/kg；以10 倍信噪比作為本實驗方法的定量限，經計算得E構型與Z構型植醇的定量限分別為0.09、0.10 mg/kg。

2.6 加標回收與精密度實驗

稱取空白樣品（E構型與Z構型植醇均未檢出）約10.0 g，共18 份，分別加入適量植醇標準混合溶液，每個添加水平做6 份平行，計算加標回收率，由表1可知，在不同加標水平下，E構型植醇、Z構型植醇平均加標回收率分別為78.6%～93.5%、79.5%～94.7%，二者相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于10%。

表1 植物性乳制品中植醇對映異構體加標回收率與精密度Table 1 Recoveries and precision of phytol enantiomers in spiked blank samples

2.7 植物性乳制品中植醇對映異構體含量測定

由表2可知，10 種植物性乳制品中有8 種檢出植醇對映異構體，且E構型含量普遍高于Z構型，但總體含量都不高，基本上處于定量限附近。

表2 10 種植物性乳制品中植醇對映異構體的檢出情況Table 2 Results of detection of phytol enantiomers in 10 plant-based dairy products

3 結 論

通過對前處理過程，如提取方法、提取溶劑及凈化方式等進行適當優(yōu)化，建立固相萃取-GC-MS法測定植物性乳制品中植醇對映異構體的分析方法，該方法具有靈敏、準確、重復性好等特點，為植物性乳制品中植醇對映異構體的開發(fā)與利用提供了一定技術手段。通過對市面上常見10 種植物性乳制品中植醇對映異構體進行隨機檢測，為植物性乳制品中植醇含量的監(jiān)測及植物中植醇的開發(fā)利用提供了參考依據。