焦琳,殷春霞,夏琦,曹麗芬,余萬霖,鄧時貴

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510006; 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510006

順鉑是一線抗癌藥物,具有廣譜療效顯著、性價比高的優(yōu)勢,但腎毒副作用嚴(yán)重,且呈劑量依賴性,據(jù)報(bào)道,大約有20%～30%的患者在使用順鉑化療后會出現(xiàn)不同程度的腎臟功能下降,因此臨床應(yīng)用受限[1-2]。為解決此問題,臨床上常采用水化利尿法或調(diào)節(jié)順鉑給藥方式治療,雖顯現(xiàn)出了一定的腎臟保護(hù)作用,但效果有限,并存在遠(yuǎn)期療效差、藥品價格高等缺點(diǎn)[3];同時,大量補(bǔ)液會對患者不利,也給臨床工作帶來不便,新的緩解順鉑腎毒性(cisplatin nephrotoxicity,C-IN)的療法急待開發(fā)。

中醫(yī)認(rèn)為,順鉑腎毒屬于“藥毒”范疇[4-5],其根本病機(jī)是邪盛正虛,是腎脾功能受損所致“濕濁中阻”而引起的一種代謝異常性副作用,以祛邪扶正為基本原則,采用祛濕化濁法或可調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、緩解順鉑腎毒性。參苓白術(shù)散是常用的祛濕經(jīng)典名方,具有益氣健脾,滲濕止瀉,通調(diào)水道之功效,主治脾虛濕盛證[6],臨床多與化療藥物聯(lián)用提高患者行為能力。然而參苓白術(shù)散與順鉑聯(lián)用改善C-IN的效果及其機(jī)制均未清楚。因此,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合分子對接技術(shù)預(yù)測參苓白術(shù)散核心活性成分、作用通路與關(guān)鍵分子靶點(diǎn),然后應(yīng)用小鼠腎損傷模型驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果,闡明參苓白術(shù)散緩解 C-IN的潛在作用機(jī)制,為開發(fā)緩解C-IN的臨床辦法提供新策略。

1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究參苓白術(shù)散緩解C-IN的作用機(jī)制

1.1 資料與方法

1.1.1 參苓白術(shù)散活性成分和靶點(diǎn)的搜集運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php,數(shù)據(jù)收集日期為2022年1月)檢索參苓白術(shù)散中白扁豆、白術(shù)、茯苓、甘草、桔梗、蓮子、人參、砂仁、山藥、薏苡仁的化學(xué)成分,并以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥ 30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥ 0.18為條件進(jìn)行篩選,得出相應(yīng)活性成分及靶標(biāo)蛋白。由于TCMSP平臺未收錄蓮子的化學(xué)成分,故以“蓮子”為檢索詞,在中醫(yī)藥百科全書(The encyclopedia of traditional Chinese medicine,ETCM,http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php)、SymMap數(shù)據(jù)庫(http://www.symmap.org/)查找,同時結(jié)合文獻(xiàn)收集蓮子的成分,通過PubChem網(wǎng)站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載其2D結(jié)構(gòu)的SDF文件,基于SwissADME(http://www.swissadme.ch/)和SwissTargetPrediction平臺(http://swisstargetprediction.ch/)篩選出蓮子的活性成分與靶點(diǎn)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/),選擇物種為“Human”,對獲得成分靶點(diǎn)信息進(jìn)行基因名稱的規(guī)范統(tǒng)一。

1.1.2 C-IN相關(guān)靶點(diǎn)搜集以“cisplatin-induced kidney injury”“cisplatin-induced renal injury”“cisplatin-induced kidney failure”“cisplatin-induced renal failure”“cisplatin-induced kidney damage”“cisplatin-induced nephrotoxicity”“cisplatin kidney damage”為檢索詞在在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://www.omim.org/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)收集C-IN的靶點(diǎn),其中GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選條件為Score≥10。將3個數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)匯總,刪除重復(fù)值。

1.1.3 參苓白術(shù)散緩解C-IN的潛在相關(guān)靶點(diǎn)篩選將參苓白術(shù)散活性成分靶點(diǎn)與C-IN疾病相關(guān)靶點(diǎn)錄入Venny 2.1.0軟件,繪制韋恩圖,得到兩者的交集靶點(diǎn),即為參苓白術(shù)散緩解C-IN的潛在靶點(diǎn)。

1.1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)的篩選利用STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)構(gòu)建交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò),物種選擇“Homo sapiens”,相互作用閾值為0.9,隱去游離靶點(diǎn),將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?篩選同時大于2倍網(wǎng)絡(luò)中介中心性中位數(shù)、2倍節(jié)點(diǎn)連接度值中位數(shù)、接近中心性中位數(shù)的靶點(diǎn);同時結(jié)合MCODE模塊篩選核心靶點(diǎn)。MCODE模塊參數(shù)設(shè)置為:Degree cutoff:2,Node Score Cutoff:0.2,K-Core:2。

1.1.5 基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)中進(jìn)行GO與KEGG分析,其中GO分析包括分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)、生物學(xué)過程(biological process,BP)3個部分。選擇“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”,物種為“Homo”,根據(jù)Pvalue與Count值篩選結(jié)果。

1.1.6 分子對接與可視化在RCSB PDB網(wǎng)站(https://www.pdbus.org/)中根據(jù)物種、Score值及分辨率選取核心靶點(diǎn)骨架,在PubChem網(wǎng)站中下載核心化合物的3D結(jié)構(gòu),將兩者導(dǎo)入AutoDock 1.5.6軟件進(jìn)行分子對接并計(jì)算結(jié)合能,利用PyMol 2.5軟件進(jìn)行可視化分析。

1.2 結(jié)果

1.2.1 參苓白術(shù)散活性成分及靶點(diǎn)篩選通過檢索TCMSP、ETCM、SymMap數(shù)據(jù)庫,同時結(jié)合文獻(xiàn)共獲得參苓白術(shù)散活性成分213個,其中白扁豆1個,白術(shù)7個,茯苓15個,甘草92個,桔梗7個,蓮子34個,人參22個,砂仁10個,山藥16個,薏苡仁9個,去重后共得到204個活性成分,包括生物堿類、黃酮類、多酚類等,主要活性成分見表1。根據(jù)TCMSP、SwissADME和SwissTargetPrediction平臺篩選活性化合物的靶點(diǎn),匯總刪除重復(fù)值后共得到靶點(diǎn)335個。

表1 參苓白術(shù)散主要活性成分

1.2.2 C-IN靶點(diǎn)篩選基于OMIM、Drugbank、GeneCards數(shù)據(jù)庫收集C-IN的靶點(diǎn),將3個數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)匯總,刪除重復(fù)值共得到C-IN疾病相關(guān)靶點(diǎn)1 298個。

1.2.3 核心活性成分及核心靶點(diǎn)分析將參苓白術(shù)散活性成分靶點(diǎn)與C-IN疾病相關(guān)靶點(diǎn)錄入Venny 2.1.0軟件,如圖1所示,共得到參苓白術(shù)散緩解C-IN的潛在治療靶點(diǎn)(交集靶點(diǎn))137個,選出靶向治療靶點(diǎn)的活性化合物作為參苓白術(shù)散的有效成分。利用Cytoscape 3.8.2軟件分析參苓白術(shù)散“有效成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),將有效成分按照度值大小排列,得到排名前3位的核心活性成分分別為槲皮素、山柰酚、木犀草素,結(jié)果見表2。

圖1 參苓白術(shù)散緩解順鉑腎毒性的交集靶點(diǎn)韋恩圖

表2 參苓白術(shù)散核心活性成分(度值前10位)

為了進(jìn)一步研究參苓白術(shù)散緩解C-IN的作用機(jī)制,將137個治療靶點(diǎn)通過STRING網(wǎng)站進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)共有137個節(jié)點(diǎn),742條邊(其中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn),邊表示靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系)。隨后將結(jié)果錄入Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D,分析篩選出同時大于2倍網(wǎng)絡(luò)中介中心性中位數(shù)(0.006 8)、2倍節(jié)點(diǎn)連接度值中位數(shù)(22)、接近中心性中位數(shù)(0.426 0)的靶點(diǎn)19個。最后利用MCODE插件選出核心模塊,同時結(jié)合度值篩選出排名前10位的核心靶點(diǎn)分別為TP53、STAT3、AKT1、HSP90AA1、JUN、SRC、MAPK3、MAPK1、ESR1、PIK3R1,結(jié)果見圖2與表3。

注:圖中節(jié)點(diǎn)越大,顏色越深表明該靶點(diǎn)度值越大,在網(wǎng)絡(luò)中越重要;連線越粗,顏色越深表明靶點(diǎn)之間的關(guān)系越緊密

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)信息

1.2.4 GO與KEGG富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫,將137個治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果共富集得到794項(xiàng)BP,84項(xiàng)CC,152項(xiàng)MF。根據(jù)顯著性與基因富集數(shù)目篩選出排名前10位的GO條目,其中BP主要涉及細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程(cytokine-mediated signaling pathway)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控過程(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、負(fù)調(diào)控凋亡過程(negative regulation of apoptotic process)等;CC主要涉及細(xì)胞核(nucleus)、細(xì)胞溶質(zhì)(cytosol)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)等;MF主要涉及蛋白結(jié)合(protein binding)、相同蛋白結(jié)合(identical protein binding)、酶結(jié)合(enzyme binding)等,結(jié)果見圖3。

圖3 GO富集分析條形圖

KEGG富集分析共得到188條通路,選取P值排名前20位的通路進(jìn)行可視化分析,結(jié)果如圖4所示,參苓白術(shù)散主要通過作用于癌癥相關(guān)通路(pathways in cancer)、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化相關(guān)通路(lipid and atherosclerosis)以及糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、PI3K/AKT信號通路(PI3K/AKT signaling pathway)和MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等來緩解C-IN。

注:圓形節(jié)點(diǎn)代表通路。

采用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建參苓白術(shù)散緩解C-IN的“靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò),如圖5所示。對“靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治龊髮Φ玫降陌悬c(diǎn)度值進(jìn)行排序,同時與1.2.3項(xiàng)下得到的核心靶點(diǎn)比對取交集,篩選出AKT1、PIK3R1、TP53、MAPK1、MAPK3是其關(guān)鍵作用靶點(diǎn)(紅色圖標(biāo))。

注:藍(lán)色三角形為通路;黃色菱形為作用靶點(diǎn);紅色菱形為關(guān)鍵作用靶點(diǎn)

1.2.5 分子對接選擇核心活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素分別與關(guān)鍵作用靶點(diǎn)蛋白AKT1、PIK3R1、TP53、MAPK1、MAPK3進(jìn)行分子對接,進(jìn)一步驗(yàn)證參苓白術(shù)散緩解C-IN的關(guān)鍵成分與作用靶點(diǎn)。較低的結(jié)合能代表配體和蛋白質(zhì)之間較高的親和力,一般認(rèn)為受體和配體的結(jié)合能≤-5.0 kcal·mol-1說明兩者有較好的結(jié)合活性[7-8]。分子對接結(jié)果如表4所示,核心活性成分與關(guān)鍵作用靶點(diǎn)具有較好結(jié)合活性,且均與MAPK1蛋白有最優(yōu)結(jié)合活性。

表4 參苓白術(shù)散核心活性成分與關(guān)鍵作用靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

將核心活性成分與MAPK1蛋白對接結(jié)果經(jīng)PyMol 2.5軟件可視化,結(jié)果見圖6。槲皮素與MAPK1相互作用的氨基酸殘基為異亮氨酸-84、亮氨酸-73、異亮氨酸-81、組氨酸-78、精氨酸-77和亮氨酸-74;山柰酚與MAPK1相互作用的氨基酸殘基為蘇氨酸-61、丙氨酸-33、酪氨酸-34和絲氨酸-55;木犀草素與MAPK1相互作用的氨基酸殘基為天冬氨酸-104、賴氨酸-162、異亮氨酸-81、組氨酸-78和亮氨酸-74。

注:藍(lán)色為MAPK1蛋白骨架結(jié)構(gòu);紅色為活性成分3D結(jié)構(gòu);綠色為氨基酸殘基;黃色虛線為氫鍵;數(shù)字為氫鍵長度

2 基于動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證參苓白術(shù)散緩解C-IN的作用機(jī)制

2.1 材料

2.1.1 動物SPF級雄性C57BL/6J小鼠24只,購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,許可證號:SCXK(粵)2018-0002,飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心,許可證號:SYXK(粵)2018-0094,飼養(yǎng)條件為SPF級環(huán)境,溫度23～25 ℃,濕度45%～65%,12 h晝夜節(jié)律,800—2000光照,小鼠自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)通過了廣東省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查,倫理審查批準(zhǔn)號:202243。

2.1.2 藥物與試劑參苓白術(shù)散(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠,規(guī)格:每袋12 g,批號:21101018);順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司,規(guī)格:30 mg/5 mL,批號:601210607)。優(yōu)級純硝酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);調(diào)諧液(安捷倫科技有限公司,貨號:5185-5959);鉑(Pt)ICP-MS標(biāo)準(zhǔn)液(美國o2si Smart Solutions公司,貨號:060078-04-01);尿素氮(urea,BUN)測試盒 (脲酶法)、肌酐(Creatinine,Cr)測定試劑盒 (肌氨酸氧化酶法)(微板法)(南京建成生物工程研究所,貨號:C013-2-1、C011-2-1);HE染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號:C0105);中性樹脂、4%多聚甲醛(上海晶欣生物科技有限公司,貨號:C1010、JX0100);β-actin引物、AKT1引物、TP53引物、PIK3R1引物、MAPK1引物、MAPK3引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司,貨號:AG11711);預(yù)混型qPCR試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司,貨號:AG11701)。

2.1.3 儀器真空冷凍干燥機(jī)(型號:FreeZone,美國LABCONCO公司);微波消解儀(型號:MARS6,美國CEM公司);電感耦合等離子體質(zhì)譜(型號:8800ICP-MS,美國Agilent公司);萬分之一天平(型號:BSA323S-CW,德國Sartorius公司);冷凍離心機(jī)(型號:5418R,德國Eppendorf公司);恒溫孵育箱(型號:DNP-9162,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);水浴鍋(型號:DK-S22,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);酶標(biāo)儀(型號:EonC,美國BioTek公司);全自動組織脫水機(jī)(型號:VIP6 AI-J2,日本SAKURA公司);組織包埋機(jī)、超微量分光光度計(jì)、熒光定量PCR儀(型號:HistoStar、NanoDrop 2000c、ABI7500,美國Thermo Fisher Scientific公司);切片機(jī)(型號:RM2245,德國Leica公司);全自動染色工作站(型號:ST5020,德國Leica公司);研究級電動顯微鏡(型號:BX53,日本Olympus公司);梯度PCR儀(型號:Veriti,美國Applied Biosystems公司)。

2.2 方法

2.2.1 腎損傷動物模型制備及分組將24只C56BL/6J雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,隨機(jī)分為對照組、模型組、減毒組及參苓白術(shù)散組,每組6只。模型組每3天注射1次順鉑注射液(3 mg·kg-1)誘導(dǎo)腎損傷[9-11];減毒組注射順鉑注射液(3 mg·kg-1)同時灌胃給予參苓白術(shù)散治療(3 g·kg-1);參苓白術(shù)散組僅灌胃給予參苓白術(shù)散(3 g·kg-1),對照組每天給予等量的生理鹽水。30 d后處死小鼠,取腎臟與血液做后續(xù)研究。通過觀察腎組織HE病理切片,檢測小鼠血清中Cre、BUN的含量,同時采用 ICP-MS檢測腎組織內(nèi)鉑離子含量判定模型建立是否成功。

2.2.2 鉑離子在腎臟中的含量測定采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)檢測腎臟中鉑離子的含量。(1)供試品準(zhǔn)備:將腎臟組織于-80 ℃預(yù)冷24 h后真空干燥研成粉狀保存。稱取適量腎組織凍干粉至消解罐中,加入5 mL硝酸室溫預(yù)消解30 min,按照表5程序完成消解后進(jìn)行趕酸,最后用10%硝酸定容至10 mL。(2)ICP-MS儀器條件:等離子體工作線圈射頻功率為1 550 W,采樣深度8.00 mm,冷卻氣、輔助氣、霧化氣均為氬氣,流速分別為 15.00 L·min-1、1.00 L·min-1和0.99 L·min-1,霧化室溫度為2 ℃,蠕動泵轉(zhuǎn)速為0.30RSP。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立:取Pt標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用2%硝酸將其稀釋成濃度分別為0.00 μg·L-1、10.00 μg·L-1、25.00 μg·L-1、50.00 μg·L-1、100.00 μg·L-1、500.00 μg·L-1、1 000.00 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,ICP-MS檢測后根據(jù)其CPS響應(yīng)值與濃度關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)供試品經(jīng)ICP-MS檢測后,根據(jù)其CPS響應(yīng)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算檢測腎組織中鉑離子的含量,并計(jì)算組織的藥物含量,其中300.05為順鉑注射液相對分子量,195.08為鉑的相對分子量。

表5 消解程序

順鉑含量=檢測鉑含量×300.05/195.08

2.2.3 腎功能檢查將小鼠血液離心后取血清,按照試劑盒列出的方法檢測各組小鼠血清中BUN、Cre的含量。

2.2.4 HE病理檢查腎臟組織經(jīng)脫水、石蠟包埋后,將蠟塊切成4 μm的片狀,在66 ℃烘箱烘烤 2 h,按照說明書進(jìn)行HE染色,封片后用病理顯微鏡觀察拍照。

2.2.5 核心靶點(diǎn)的基因表達(dá)水平檢測取適量腎臟組織提取總RNA并檢測濃度,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,參照預(yù)混型qPCR試劑盒加入SYBR Green后進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系:10 μL 2X SYBR Green Pro Taq HS Premix,2 μL cDNA,0.8 μL 上游引物,0.8 μL下游引物,0.4 μL ROX Reference Dye(4 μmol·L-1),6 μL無菌超純水。擴(kuò)增程序:95 ℃ 預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線,記錄Ct值,以β-actin作為內(nèi)參,采用 2-ΔΔCt方法計(jì)算核心靶點(diǎn)的基因表達(dá)量。引物序列見表6。

表6 引物序列

2.3 結(jié)果

2.3.1 參苓白術(shù)散顯著減少腎組織內(nèi)鉑離子蓄積采用ICP-MS檢測各組腎組織內(nèi)鉑離子含量,如表7所示,與對照組比較,模型組腎組織內(nèi)鉑離子含量明顯升高(P<0.01);與模型組比較,參苓白術(shù)散用藥后(減毒組)能顯著降低鉑離子蓄積(P<0.01),調(diào)節(jié)順鉑代謝。

表7 參苓白術(shù)散緩解順鉑腎毒性評價

2.3.2 參苓白術(shù)散能夠降低順鉑腎毒副作用與模型組比較,參苓白術(shù)散與順鉑聯(lián)用能夠降低小鼠血清中BUN(P<0.05)含量,結(jié)果見表7。同時病理HE結(jié)果表明,模型組小鼠腎臟組織有明顯的結(jié)構(gòu)損傷現(xiàn)象:腎小管變性、壞死(胞漿空泡樣變),管腔內(nèi)有大量受損的管型及脫落的上皮細(xì)胞,細(xì)胞排列紊亂,腎間質(zhì)有大量炎細(xì)胞浸潤;減毒組小鼠腎臟組織中腎小管與腎小球形態(tài)比較清晰,有少量腎小管管壁細(xì)胞壞死,少見炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)果見圖7。根據(jù) Paller 法對各組小鼠腎小管損傷進(jìn)行病理評分[12],與模型組比較,減毒組腎小管損傷程度明顯降低(P<0.01),結(jié)果見表7。以上結(jié)果說明參苓白術(shù)散能夠有效緩解C-IN。

注:A:對照組;B:模型組;C:減毒組;D:參苓白術(shù)散組

2.3.3 參苓白術(shù)散與順鉑聯(lián)用對小鼠體質(zhì)量的影響實(shí)驗(yàn)過程中每5天記錄小鼠體質(zhì)量,結(jié)果顯示對照組與參苓白術(shù)散組小鼠體質(zhì)量隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)程而增長,與對照組比較,從第20天開始模型組和減毒組小鼠體質(zhì)量明顯減少(P<0.01),說明參苓白術(shù)散未能緩解順鉑引起的小鼠體質(zhì)量的下降,結(jié)果見表8。

表8 參苓白術(shù)散與順鉑聯(lián)用對小鼠體質(zhì)量的影響

2.3.4 參苓白術(shù)散對小鼠腎組織AKT1、PIK3R1、TP53、MAPK1、MAPK3mRNA表達(dá)的影響根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)分析結(jié)果,選取小鼠各組腎組織檢測復(fù)方關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如表9所示,與對照組比較,模型組TP53、MAPK1、MAPK3的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,減毒組能夠顯著升高PIK3R1mRNA的表達(dá)(P<0.01),降低TP53、MAPK1、MAPK3的mRNA表達(dá)(P<0.01)。說明參苓白術(shù)散可能通過調(diào)控PIK3R1、TP53、MAPK1、MAPK3mRNA的表達(dá)發(fā)揮緩解C-IN的作用。

表9 腎組織中關(guān)鍵作用靶點(diǎn)mRNA相對表達(dá)水平比較

3 討論

參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》,為中醫(yī)健脾祛濕經(jīng)典名方,由蓮子、薏苡仁(炒)、砂仁、桔梗、白扁豆(炒)、茯苓、人參、甘草、白術(shù)(炒)、山藥組成,具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、改善胃腸功能、抗氧化、抗腫瘤、抗炎等藥理作用[13],臨床上常用參苓白術(shù)散(單用或以加減方)輔助鉑類化療藥治療結(jié)直腸癌、肺癌,以改善術(shù)后患者生活質(zhì)量[14-15]。最新研究發(fā)現(xiàn),參苓白術(shù)散具有鎮(zhèn)痛作用并可延長肺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠的生存期[16],說明參苓白術(shù)散在參與癌癥治療過程中具有減毒潛力,然而其對化療藥物的減毒作用與機(jī)制尚不清楚。今后可進(jìn)一步應(yīng)用現(xiàn)代多學(xué)科交叉技術(shù)闡明其作用機(jī)制和有效成分,為參苓白術(shù)散更好地運(yùn)用于臨床治療提供依據(jù)。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析篩選出槲皮素、山柰酚、木犀草素是參苓白術(shù)散的核心活性化合物。槲皮素、山柰酚和木犀草素都是具有多種生物活性的黃酮類化合物。槲皮素具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖及免疫調(diào)節(jié)等作用[17],有研究證實(shí)其能夠抑制腎小管細(xì)胞凋亡[18],或通過抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)等方式緩解順鉑引起的腎毒性[19]。最近有研究制備了槲皮素膠束制劑,在增加槲皮素血藥濃度與生物利用度的同時保留了其對順鉑腎毒的緩解作用[20]。山柰酚和木犀草素均具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌、抗炎等功效,能從氧化應(yīng)激、凋亡、炎癥等多方面緩解順鉑介導(dǎo)的腎毒性[21-22],尤其是木犀草素能夠減少鉑離子在腎臟內(nèi)的蓄積[23],與本研究中參苓白術(shù)散的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫絽④甙仔g(shù)散緩解C-IN的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)為AKT1、PIK3R1、TP53、MAPK1、MAPK3。分子對接顯示槲皮素、山柰酚和木犀草素能較好地與AKT1、PIK3R1、TP53、MAPK1、MAPK3結(jié)合。AKT是PI3K下游主要效應(yīng)分子之一,當(dāng)PI3K與生長因子受體結(jié)合后,可改變AKT的蛋白結(jié)構(gòu)使其活化,并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物[24],激活A(yù)KT1能夠有效緩解順鉑引起的腎臟毒性[25]。TP53基因是一種抑癌基因,因編碼一種分子量為53 kDa的蛋白質(zhì)(p53蛋白)而得名[26],抑制p53表達(dá)或于近端小管靶向缺失p53可在順鉑腎毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)揮腎保護(hù)作用[27-30]。MAPK是一組進(jìn)化保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶,MAPK1和MAPK3分別編碼細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2(extracellular regulated protein kinases 2,ERK2)與ERK1,通過抑制MAPK1的表達(dá)能夠降低順鉑耳毒性[31],且越來越多的研究證實(shí)ERK1/2參與改善順鉑副作用[32-33]。此外,5個關(guān)鍵靶點(diǎn)均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[34-35],推測參苓白術(shù)散與化療藥聯(lián)用時可能參與腫瘤治療進(jìn)程,其配伍效果需要進(jìn)一步深入探究。

GO富集分析發(fā)現(xiàn),參苓白術(shù)散能夠調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白結(jié)合等過程,進(jìn)一步說明中藥復(fù)方具有多層次的藥理功能。KEGG分析結(jié)果表明參苓白術(shù)散緩解C-IN的主要信號通路為AGE-RAGE信號通路、PI3K/AKT信號通路和MAPK信號通路。AGE-RAGE信號通路是糖尿病腎病重要發(fā)病通路之一,該通路激活后可促使PI3K/AKT和MAPK等通路的激活[36]。PI3K/AKT信號通路是一種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,響應(yīng)細(xì)胞外信號,促進(jìn)代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長和血管生成等,PI3K和AKT是該通路的關(guān)鍵基因[37],激活PI3K/AKT信號通路能抑制腎小管細(xì)胞凋亡,減輕順鉑引起的腎毒性[38-40]。MAPK信號通路參與細(xì)胞的增殖、分化、應(yīng)激、炎癥等多種反應(yīng)[41],抑制MAPK通路能夠降低ERK1/2等基因與蛋白的表達(dá),減輕順鉑耐藥與毒副作用[31,42-44]。此外,近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過激活PI3K/AKT信號通路拮抗MAPK介導(dǎo)的自噬通路能夠抑制順鉑腸毒性[45],進(jìn)一步證明PI3K/AKT與MAPK信號通路與順鉑的副作用具有相關(guān)性。

為了驗(yàn)證參苓白術(shù)散緩解C-IN的作用,本研究構(gòu)建了C57BL/6J小鼠順鉑腎損傷模型,結(jié)果顯示,參苓白術(shù)散和順鉑聯(lián)用可以降低順鉑在小鼠腎組織的蓄積,調(diào)節(jié)順鉑代謝,降低小鼠血清中BUN和Cre含量,改善腎小管細(xì)胞形態(tài)。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,參苓白術(shù)散能夠降低模型小鼠腎組織TP53、MAPK1及MAPK3mRNA的表達(dá),升高PIK3R1mRNA的表達(dá)。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步預(yù)測了參苓白術(shù)散在多成分、多靶點(diǎn)、多通路的共同作用下緩解C-IN的作用機(jī)制,同時利用動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了參苓白術(shù)散可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮緩解C-IN的作用,為開發(fā)降低順鉑毒副作用的臨床辦法提供新思路與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而中藥復(fù)方成分復(fù)雜且具有作用通路與靶點(diǎn)不唯一的特點(diǎn),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析仍有一定局限性,后續(xù)需要更深入的分子生物學(xué)與臨床實(shí)驗(yàn)來探究。