汪娣，曾雪瑩，胡玉清，李楠

廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（南寧 530004）

野櫻莓（Aronia melanocarpa）又名不老莓、黑果腺肋花楸，是來源于北美洲東部濕樹林和加拿大東部的一種落葉灌木，屬于薔薇科類[1]。野櫻莓果實(shí)中含有許多對人體有益的物質(zhì)，包括維生素、葉酸、奎寧酸、多酚酸、單寧、兒茶素、橙皮苷和花青素等[2]。同時(shí)野櫻莓果實(shí)含有豐富的黃酮類，也含有酚類中像花色苷一樣的化合物，使得野櫻莓具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠清除多種氧自由基，在抗癌、抗炎、降血糖以及心腦血管等疾病方面具有良好的藥理作用[3-4]。甘蔗作為能量提供者，含有大量糖分，其中的鐵可以緩和人體缺鐵性的貧血[5]。與野櫻莓相似，甘蔗具有較強(qiáng)的抵抗突變、氧化和炎癥的能力，因?yàn)楹悬S酮類、多酚類、單寧及多糖等多種具有生物活性的化合物，甘蔗也能降低人類患心腦血管疾病的概率，以此強(qiáng)身健體[6]。

近年來，具備保健功能的低醇度果酒越來越受到消費(fèi)者的歡迎，研制此類果酒具有良好的市場前景。野櫻莓中含有豐富的生物活性成分，能與藍(lán)莓相媲美，具有釀造時(shí)間短一大特點(diǎn)，利用野櫻莓釀造出的果酒顏色透亮，營養(yǎng)豐富、口感醇厚、風(fēng)味獨(dú)特。然而，對于野櫻莓的產(chǎn)品開發(fā)較少，缺乏系統(tǒng)研究，且野櫻莓中不含可發(fā)酵糖，甘蔗汁具有充分糖分和營養(yǎng)價(jià)值以增加果酒風(fēng)味和特色。因此，試驗(yàn)以野櫻莓為原料，利用甘蔗汁為發(fā)酵糖釀制果酒，整合雙方的營養(yǎng)功能，優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，主要對果酒的抗氧化成分進(jìn)行提取和研究，創(chuàng)新果酒類別，同時(shí)拓寬野櫻莓和甘蔗產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用范圍[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野櫻莓、白砂糖（市售）；釀酒酵母（安琪酵母股份有限公司）；甘蔗（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地提供）；果膠酶（50 000 U/g，南寧龐博生物技術(shù)有限公司）；偏重亞硫酸鉀（上海麥克林生化科技有限公司）；氫氧化鈉（天津博迪化工股份有限公司）；檸檬酸（南寧恒因生物科技有限公司）；DPPH（美國Sigma公司）；無水乙醇（成都市科隆化工試劑廠）；鐵氰化鉀（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三氯化鐵（臺山市化工廠有限公司）；三氯乙酸（成都市科隆化工試劑廠）；磷酸二氫鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；磷酸氫二鈉（天津博迪化工股份有限公司）。所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2組織搗碎機(jī)（上海菁華科技儀器有限公司）；PAL-1日本愛拓迷你數(shù)顯折射計(jì)（廣州愛拓科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3E雷磁pH計(jì)、TW-12恒溫水浴鍋（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；UVmini-1240紫外-可見分光光度計(jì)[島津儀器（蘇州）有限公司]；SHP-250生化培養(yǎng)箱（優(yōu)博萊技術(shù)有限公司）；PL-303電子分析天平（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；TGL-20M高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 野櫻莓果酒制備工藝與操作要點(diǎn)[9-11]

1.3.1.1 工藝流程

野櫻莓→挑選→去梗去枝→清洗→破碎→酶解→榨取甘蔗汁同時(shí)調(diào)整糖度、pH→主發(fā)酵→過濾→后發(fā)酵→澄清→陳釀→野櫻莓果酒

1.3.1.2 操作要點(diǎn)

原料的選?。哼x取形態(tài)飽滿、深紫色、無蟲蠅叮咬的野櫻莓；選取多汁新鮮且無蟲害的甘蔗；均儲存于-20 ℃冰箱備用。

預(yù)處理、破碎：野櫻莓和甘蔗清洗干凈，將甘蔗破碎榨汁儲存于-20 ℃冰箱備用，將野櫻莓去梗破碎打漿。

酶解：將野櫻莓和甘蔗汁按照7∶25（g/mL）的料水比混合，按質(zhì)量比加入0.3%的果膠酶，在40 ℃條件下酶解3 h。

調(diào)整糖度、pH：添加白砂糖或蔗糖用來調(diào)整發(fā)酵液糖度至26.0 °Bx，用無水檸檬酸和堿性液體調(diào)整發(fā)酵液的pH至4.0。

主發(fā)酵：添加偏重亞硫酸鉀，使二氧化硫濃度30mg/kg進(jìn)行殺菌；按照1 g/100 mL的接種量進(jìn)行接種，攪拌均勻，封閉置于28 ℃的培養(yǎng)箱恒溫發(fā)酵9 d。

后發(fā)酵、澄清：將主發(fā)酵后的果酒濾液除渣，繼續(xù)將果酒密封處理，發(fā)酵完全，澄清得到初成品。

陳釀：果酒繼續(xù)密封保存可使果體更澄清，果味更醇厚。

1.3.2 野櫻莓果酒釀造單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別在野櫻莓添加量（16，20，24，28和32 g）、發(fā)酵溫度（24，26，28，30和32 ℃）、酵母接種量（0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4%）條件下，對野櫻莓果酒的感官評分和酒精度等評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行測定，確定最適宜的發(fā)酵條件。

1.3.3 野櫻莓果酒釀造正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在野櫻莓果酒釀造單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵溫度（A）、野櫻莓添加量（B）和酵母添加量（C）為影響因素，以酒精度為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，篩選野櫻莓果酒釀造的最適發(fā)酵條件[12]。設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)的因素與水平如表1所示。

表1 野櫻莓果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.4 測定方法

1.3.4.1 基本理化指標(biāo)的測定

乙醇體積分?jǐn)?shù)的測定按照GB/T 5009.48——2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》；總酸含量測定均參照GB/T 15038——2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；總酚采用Folin-Ciocalte比色方法[13]測定；還原糖含量采用3, 5-二硝基水楊酸法[14]測定；總黃酮采用硝酸鋁比色法[15]測定。

1.3.4.2 野櫻莓果酒抗氧化活性分析

測定野櫻莓果汁、野櫻莓果酒及0.3 g/L VC的DPPH自由基清除能力和總還原能力，探究其抗氧化活性。

DPPH自由基清除率的測定參考文獻(xiàn)[16-19]的方法，略有修改。分別準(zhǔn)確移取0.6 mL不同體積分?jǐn)?shù)（1%，2%，3%，4%，5%和6%）的樣品溶液，取5 mL 60 μmol/L的DPPH乙醇溶液加入其中，混勻，常溫避光30 min，在4 000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，取上清液，測定吸光度（波長517 nm）A1；將0.6 mL無水乙醇和5 mL DPPH乙醇溶液混勻，按上述方法測定吸光度A3；將5 mL無水乙醇和0.6 mL樣品水溶液混勻，按上述方法測定吸光度A2。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。

總還原能力的測定參考文獻(xiàn)[20-22]的方法，略有改動(dòng)。分別取1 mL不同體積分?jǐn)?shù)樣液（5%，10%，15%，20%，25%和30%），加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液，混勻，加入2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液。于50 ℃反應(yīng)20 min，迅速放入低溫冷卻，加入1 mL 10%三氯乙酸，終止反應(yīng)，在4 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取2.5 mL上清液，按順序加入2.5mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，搖勻，靜置5 min，測定吸光度（波長700 nm）。

1.3.5 感官評定

選擇有感官評定經(jīng)驗(yàn)的專家，男女共10名，組成野櫻桃果酒的感官評價(jià)小組。標(biāo)準(zhǔn)從色澤（20分）、氣味（30分）、滋味（40分）和典型性（10分）4個(gè)方面進(jìn)行評定；參照GB/T 15038——2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》制定感官評分細(xì)則[23]，評分標(biāo)準(zhǔn)詳見表2，取百分制，最終評分結(jié)果為平均值。

表2 野櫻莓果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010整合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，平行3次試驗(yàn)以保證數(shù)據(jù)客觀；使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 2017制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵溫度對野櫻莓果酒品質(zhì)的影響

由圖1可見，隨著發(fā)酵溫度的增加，酒精度先趨于增加，后減少，在28 ℃時(shí)獲得最高的酒精度和感官評分。在24 ℃的發(fā)酵溫度下，成品野櫻莓果酒的酒精度為16.8%vol，感官評分為78.5分，此時(shí)果酒未發(fā)酵完全，果味濃郁，但是酒味略顯單薄，口味酸澀，主要原因可能是發(fā)酵溫度較低，微生物利用糖分產(chǎn)生較多的酸類物質(zhì)，產(chǎn)生乙醇較少，同時(shí)此種情況下導(dǎo)致酵母活性較低，從而使得發(fā)酵速度較慢，果酒發(fā)酵不完全。發(fā)酵溫度升高至28 ℃時(shí)果酒酒精度達(dá)到最高，為17.4%vol，感官評分也居于最高，為87.4分，與孫天利等[24]發(fā)酵結(jié)果類似，結(jié)果表明此溫度下微生物繁殖迅速，發(fā)酵適中，酒香濃厚，但當(dāng)溫度持續(xù)升高時(shí)，超過最適溫度會抑制微生物繁殖，導(dǎo)致發(fā)酵不充分，果酒異味增加，酒精度降低。因此，最適合野櫻莓果酒的發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖1 發(fā)酵溫度對野櫻莓果酒品質(zhì)的影響

2.1.2 野櫻莓添加量對果酒品質(zhì)的影響

由圖2可知，在野櫻莓添加量28 g時(shí)，酒精度和感官評價(jià)達(dá)到最高。野櫻莓添加量16 g時(shí)，感官評分較低，為73.3分，口感風(fēng)味較差。野櫻莓添加量持續(xù)增加到28 g時(shí)，酒精度到達(dá)峰值17.2%vol，感官評分也達(dá)到峰值89.2分。而隨著野櫻莓添加量繼續(xù)升高，果酒感官評分降低，與尚宏遠(yuǎn)等[25]研究芒果蘋果復(fù)合果酒的結(jié)果一致。因此，最適合果酒的野櫻莓添加量為28 g。

圖2 野櫻莓添加量對野櫻莓果酒品質(zhì)的影響

2.1.3 酵母添加量對果酒品質(zhì)的影響

由圖3可知，野櫻莓果酒的酵母接種量1%時(shí)，酒精度達(dá)到峰值，感官評分適中。酵母接種量低于1%時(shí)，酵母活性低導(dǎo)致果酒不能充分發(fā)酵，因此果酒中的糖分不能被全部轉(zhuǎn)化，從而酒精度低。而酵母添加量持續(xù)增加時(shí)，酵母含量越高，酵母的轉(zhuǎn)化率變低，從而酒精度降低，感官評分降低[26]。因此，最適合野櫻莓果酒的酵母添加量為1%。

圖3 酵母添加量對野櫻莓果酒品質(zhì)的影響

2.2 野櫻莓果酒釀造工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表3可知，各個(gè)因素對野櫻莓果酒酒精度的影響主次順序依次為B＞C＞A，即野櫻莓添加量＞酵母添加量＞發(fā)酵溫度，其中野櫻莓添加量對野櫻莓果酒的發(fā)酵影響顯著，說明在發(fā)酵過程，野櫻莓添加量對酒精發(fā)酵品質(zhì)影響最大，地位最重要。從k值大小可知，工藝的最佳組合為A2B3C2，即發(fā)酵溫度28 ℃、野櫻莓添加量28 g、酵母添加量1.0%，由于試驗(yàn)沒有A2B3C2的組合，在最優(yōu)條件下，進(jìn)行3次試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，與謝春陽等[27]研究結(jié)果相似，發(fā)酵結(jié)束后的野櫻莓果酒酒精度為17.5%vol，感官評分為92.1分。

表3 野櫻莓果酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 誤差分析表

2.3 野櫻莓果酒成品檢測結(jié)果及分析

野櫻莓果酒澄清透明，顏色淺紫色有光澤，無懸浮物及沉淀；有明顯的野櫻莓果香，酒香自然；酸甜協(xié)調(diào)，柔和爽口，風(fēng)格明顯。理化和微生物指標(biāo)檢測結(jié)果見表5。按最優(yōu)工藝條件發(fā)酵的野櫻莓果酒的理化指標(biāo)及微生物量均符合GB 2758——2012《發(fā)酵酒及其配制酒》[28]。

表5 野櫻莓果酒理化及微生物指標(biāo)檢測結(jié)果

2.4 野櫻莓果酒抗氧化能力

野櫻莓果酒、野櫻莓果汁及0.3 g/L VC對DPPH自由基的清除能力和總還原能力的測定結(jié)果見圖4。

圖4 不同樣品清除DPPH自由基（A）及總還原能力（B）的能力

由圖4（A）可知，野櫻莓果酒、野櫻莓果汁及0.3 g/L VC對DPPH自由基的清除作用均隨著濃度的增加而增強(qiáng)，但增長的速率有所不同，具有良好線性關(guān)系。體積分?jǐn)?shù)6%時(shí)，不同樣品DPPH自由基清除率排序?yàn)橐皺演疲?1.76%）＞野櫻莓果汁（64.85%）＞0.3 g/L VC（8.51%），野櫻莓果酒清除率最高，抗氧化能力明顯比野櫻莓果汁好，說明相比較自然果汁，發(fā)酵可使活性成分更好地發(fā)揮作用并溶出，表明野櫻莓果酒可有效清除DPPH自由基。

由圖4（B）可知，野櫻莓果酒、野櫻莓果汁及0.3 g/L VC的還原能力隨樣品用量的增加三者均呈現(xiàn)上升趨勢。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，2種樣品的還原能力均優(yōu)于0.3 g/L VC，且樣品體積30%時(shí)，野櫻莓果汁還原能力是0.3 g/L VC的44.45%，野櫻莓果酒還原能力與0.3 g/L VC相當(dāng)。這說明野櫻莓果酒具有良好的還原能力。

3 結(jié)論與討論

運(yùn)用單因素試驗(yàn)，在結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上分析得出野櫻莓果酒釀造的最優(yōu)工藝參數(shù)：野櫻莓添加量28 g、發(fā)酵溫度28 ℃、酵母添加量1%。此條件下得到的果酒酒精度為17.5%vol，果酒顏色澄清透明、酒香濃郁、入口微酸，感官評分為92.1分，各項(xiàng)理化及微生物指標(biāo)均符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)。野櫻莓成品果酒富含黃酮，對比其他2類樣品的DPPH自由基清除能力和總還原能力，均反映果酒具有較好的抗氧化活性。試驗(yàn)為野櫻莓的應(yīng)用開闊了前景，也為利用甘蔗汁的發(fā)酵增加新思路。