黃利美

天津市河?xùn)|區(qū)疾病預(yù)防控制中心 300151

流感嗜血桿菌是導(dǎo)致細(xì)菌性感染的主要致病菌,其檢出率處于革蘭陰性菌的第2位[1]。該病菌主要分布在人體的咽部、鼻部及鼻咽部,常會引起肺炎、急性鼻竇炎、中耳炎等疾病,甚至?xí)?dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[2]。長期以來,受醫(yī)療條件的限制,使該病菌檢出率處于較低水平。細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定方法是鑒定流感嗜血桿菌的主要方法,但細(xì)菌培養(yǎng)檢測時間長,生化檢驗(yàn)干擾因素多,均難以滿足大量樣本的檢測需求。隨著檢測水平的發(fā)展,實(shí)時熒光PCR(Rt-PCR)技術(shù)逐漸用于臨床,具備快速、易操作、敏感度高、高通量等優(yōu)勢,明顯提高臨床檢測水平[3]。但關(guān)于Rt-PCR試劑盒的質(zhì)量控制及相關(guān)評價,尚無標(biāo)準(zhǔn)。全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(MALDI-TOF)是通過基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜來實(shí)現(xiàn)對菌種蛋白質(zhì)組學(xué)的快速檢測,在病原菌快速鑒定中得到廣泛應(yīng)用[4]。現(xiàn)本文分析MALDI-TOF系統(tǒng)在鑒定流感嗜血桿菌中的應(yīng)用價值,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2020年1—6月于醫(yī)院住院或門診就診患者的痰液標(biāo)本或咽拭子標(biāo)本1 200份,其中男638例,女562例;年齡6～74(42.35±5.28)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)納入患者均為呼吸道感染;(2)所采集的標(biāo)本未污染;(3)具有完整的臨床資料及檢測資料。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、菌血癥等嚴(yán)重感染者;(2)伴惡性腫瘤者;(3)近期接受免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素治療者。

1.2 方法 采集1 200份痰液標(biāo)本或咽拭子標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng),參加研究的檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)豐富、技術(shù)嫻熟,均在同一批檢測儀器上進(jìn)行。檢測儀器與設(shè)備:嗜血巧克力平板(江門凱琳),V+X因子(英國OXOID公司);ABI9700 PCR 儀;VITEK MS質(zhì)譜儀(法國梅里埃);全自動細(xì)菌鑒定儀及配套試劑卡片(法國梅里埃)。常規(guī)生化細(xì)菌鑒定系統(tǒng):細(xì)菌培養(yǎng):將采集的痰液標(biāo)本或咽拭子標(biāo)本接種于嗜血巧克力平板上,培養(yǎng)時間為18～24h,培養(yǎng)條件:35℃;5.0%CO2培養(yǎng)箱;若菌株在血平板上不生長,或呈生長不良狀態(tài),巧克力平板上出現(xiàn)的菌落呈灰白、大小中等,透明或半透明,濕潤,染色鏡檢為革蘭陰性短小桿菌,則可考慮為嗜血桿菌。(1)MALDI-TOF檢測系統(tǒng):選取細(xì)菌培養(yǎng)后的某單個菌落數(shù),涂抹在質(zhì)譜儀金屬靶板上,添加培養(yǎng)基質(zhì)液,在質(zhì)控點(diǎn)添加大腸埃希菌ATCC8739,添加配套基質(zhì)液,靜置3min,待干燥后,將樣品板放置質(zhì)譜儀中鑒定。鑒定結(jié)果可靠:鑒定結(jié)果處于60.0%～99.9%(綠色),黃色:低分辨率,有2～4個鑒定結(jié)果,可信率>60%,需進(jìn)一步鑒定;紅色:無法鑒定,可信率≤60%。(2)M-H瓊脂試驗(yàn):按照V、X因子需求試驗(yàn)檢測,選取某個單菌落涂在培養(yǎng)基內(nèi),分別粘貼V+X因子、X、V因子試片內(nèi),置于6%～12%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24h,若V+X因子周圍生長,則判斷流感嗜血桿菌。(3)16SrDNA檢測:采用16SrDNA 序列測序作為流感嗜血桿菌檢測金標(biāo)準(zhǔn),DNA提取檢測試劑盒提取相應(yīng)模板,對16SrDNA片段做PCR擴(kuò)增檢測,若檢測結(jié)果為陽性時再采用DNA序列測序,并與資料庫內(nèi)的序列資料進(jìn)行比較,若相似度>99%,可判斷為同種類細(xì)菌。

1.3 觀察指標(biāo) (1)比較三種檢測方法對流感嗜血桿菌的檢出率,以16SrDNA 序列測序檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),判斷三種方法之間的差異;(2)比較三種檢測方法的檢測所需時間;(3)比較檢測人員對三種檢測方法的滿意度:包括檢測時間、檢測流程、檢測結(jié)果判讀、檢測成本4個維度進(jìn)行評價,共抽查20名檢測人員,每個維度計(jì)0～10分,評分越高,檢測滿意度越高。

2 結(jié)果

2.1 三種檢測方法對流感嗜血桿菌檢出率比較 1 200份痰液標(biāo)本或咽拭子標(biāo)本采用16SrDNA 序列測序檢測后,剔除同一個患者重復(fù)分離的菌株后,得到45株流感嗜血桿菌。MALDI-TOF檢測系統(tǒng)對流感嗜血桿菌檢出率最高,依次是常規(guī)生化細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、M-H瓊脂藥敏試驗(yàn)法,其中MALDI-TOF檢測系統(tǒng)檢出率高于M-H瓊脂藥敏試驗(yàn)法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但與常規(guī)生化細(xì)菌鑒定系統(tǒng)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 三種檢測方法對流感嗜血桿菌檢出率比較[n(%)]

2.2 三種檢測方法檢測所需時間比較 三種方法檢測系統(tǒng)檢測流感嗜血桿菌所需時間顯示:MALDI-TOF檢測系統(tǒng)<常規(guī)生化細(xì)菌鑒定系統(tǒng)

表2 三種檢測方法檢測所需時間比較

2.3 三種檢測方法滿意度比較 MALDI-TOF檢測系統(tǒng)對檢測時間、檢測流程、檢測結(jié)果判讀、檢測成本的滿意度最高,其次是常規(guī)生化細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、M-H瓊脂藥敏試驗(yàn)法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 三種檢測方法滿意度比較分)

3 討論

流感嗜血桿菌是引起呼吸道感染性疾病的主要病原菌,對生長營養(yǎng)的要求較高。韋忠廳等[5]研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)5 241例呼吸道感染患兒中對流感嗜血桿菌檢出率為22.50%。而且近年來,流感嗜血桿菌感染率日益增加,受呼吸道正常菌群及抗生素濫用的影響,使其檢出率較低,且不同檢測方法的分離率差異較為明顯,使其漏檢率較高[6]。常規(guī)生化細(xì)菌培養(yǎng)法是臨床診斷病原菌的常用方法,但其操作復(fù)雜,檢測時間長達(dá)6～24h,而且菌株傳次數(shù)會影響檢測生化反應(yīng),導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)生長不良或生化反應(yīng)不顯著等情況[7]。同時細(xì)菌培養(yǎng)法結(jié)果判斷時多依靠肉眼觀察,主觀性較強(qiáng),故會影響細(xì)菌檢出率。隨著臨床診斷技術(shù)的發(fā)展,各種診斷方法層出不窮,其中M-H瓊脂實(shí)驗(yàn)法及MALDI-TOF檢測系統(tǒng)的出現(xiàn),操作簡單,價格成本相對較低,故而能提高臨床診斷水平[8]。

本文結(jié)果顯示,MALDI-TOF檢測系統(tǒng)對流感嗜血桿菌的檢出率為97.78%,高于M-H瓊脂藥敏試驗(yàn)法的75.56%(P<0.05),但與常規(guī)生化細(xì)菌鑒定系統(tǒng)檢出率88.89%比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與秦淑國等[9]研究類似,其顯示MALDI-TOF檢測系統(tǒng)菌株檢出率為96.67%高于M-H瓊脂試驗(yàn)的73.33%,而與細(xì)菌培養(yǎng)法的86.67%相比無顯著差異。故采用MALDI-TOF檢測系統(tǒng)鑒定流感嗜血桿菌具有較高檢出意義。且檢測時間相比,MALDI-TOF檢測系統(tǒng)檢測時間最短(僅在幾分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果),其次是細(xì)菌培養(yǎng)法(6～24h),最后是M-H瓊脂藥敏試驗(yàn)法(24～48h)。袁君君[10]研究結(jié)果也與本文結(jié)果相一致。故說明MALDI-TOF檢測系統(tǒng)診斷流感嗜血桿菌,檢出率高,檢測時間短。分析原因細(xì)菌培養(yǎng)作為病原菌診斷的常用方法,容易受實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、操作人員的主觀判斷能力的影響,導(dǎo)致診斷結(jié)果差異。MALDI-TOF檢測系統(tǒng)主要是通過對比已知菌種建立數(shù)據(jù)庫,將檢測獲得的微生物蛋白質(zhì)圖譜與數(shù)據(jù)庫內(nèi)的微生物圖譜進(jìn)行對比,操作簡單,檢測結(jié)果自動顯示,耗費(fèi)成本低,操作人員及患者無需等待較長時間,檢測不受主觀因素影響,結(jié)果判讀更加客觀,以此能提高病菌檢出率[11];M-H瓊脂藥敏試驗(yàn)操作簡單,無需特殊儀器,但其耗材成本高于MALDI-TOF檢測系統(tǒng),需要肉眼判斷結(jié)果,進(jìn)而會導(dǎo)致結(jié)果判斷的主觀性;同時該方法對培養(yǎng)環(huán)境要求高,技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)、操作水平參差不齊等,均會降低流感嗜血桿菌檢出率;另外該檢測方法操作檢驗(yàn)步驟煩瑣、復(fù)雜,檢測時間長,且傳代次數(shù)增加會影響生化反應(yīng)結(jié)果,從而導(dǎo)致流感嗜血桿菌檢出率降低[12]。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn),MALDI-TOF檢測系統(tǒng)對檢測時間、檢測流程、檢測結(jié)果判讀、檢測成本的滿意度最高,其次是常規(guī)生化細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、M-H瓊脂藥敏試驗(yàn)法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)室操作人員在診斷流感嗜血桿菌時,更傾向于采用MALDI-TOF檢測系統(tǒng),滿意度高。主要是細(xì)菌培養(yǎng)、M-H瓊脂藥敏試驗(yàn)操作步驟煩瑣、耗費(fèi)成本相對較高,等待時間長、需要自主結(jié)果判讀,從而會增加檢測人員的工作負(fù)擔(dān);而采用MALDI-TOF檢測系統(tǒng),只根據(jù)細(xì)菌、真菌特性蛋白質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行鑒定,儀器自動出檢測結(jié)果,只需要幾分鐘的檢測時間,實(shí)現(xiàn)微生物的快速鑒定,從而能減輕檢測人員的工作負(fù)擔(dān),降低人為因素導(dǎo)致的檢測結(jié)果誤差,滿足大樣本量檢測,故而能減輕操作負(fù)擔(dān),明顯提高檢測效率及工作滿意度[13]。

基于此,得出結(jié)論,MALDI-TOF檢測系統(tǒng)鑒定時間僅需要幾分鐘,無須特殊操作,成本低、自動判讀結(jié)果,不受主觀因素影響,故能明顯提高樣本檢測準(zhǔn)確性。但其檢測準(zhǔn)確性仍未達(dá)到100%,可能是嗜血桿菌的數(shù)據(jù)庫還未徹底完善;同時菌落與基質(zhì)液共結(jié)晶的均勻程度、基質(zhì)液保存時間等,均會影響流感嗜血桿菌的檢出結(jié)果。因此MALDI-TOF檢測系統(tǒng)鑒定準(zhǔn)確性依賴于數(shù)據(jù)庫內(nèi)菌種圖譜的信息量,需要醫(yī)務(wù)工作者深入研究,增加菌種圖譜信息。

綜上所述,全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)鑒定流感嗜血桿菌的應(yīng)用價值高,檢測時間短,檢出率高,可明顯減輕檢測人員的工作負(fù)擔(dān),降低人為因素導(dǎo)致的檢測結(jié)果誤差,明顯提高檢測效率及工作滿意度,值得臨床應(yīng)用。