宋耀峰,張林森,趙紫嫣,陳楓楠,劉 宇,趙先飛,于國康,王林林

(西北農(nóng)林科技大學 園藝學院,陜西楊凌 712100)

在中國蘋果栽培地區(qū),‘富士’占總蘋果栽培面積比例較大。但‘富士’幼樹枝條易旺長,花芽難形成,大小年現(xiàn)象嚴重。果樹枝條生長過旺時,會打破營養(yǎng)生長和生殖生長之間的平衡關(guān)系,不利于果樹花芽分化。目前,生產(chǎn)上雖然通過許多農(nóng)藝措施如扭枝、環(huán)割、拉枝等技術(shù)措施來控制果樹的過旺生長[1],但其人工費用高,也有采用一些化學方法,如噴施多效唑等會造成大量農(nóng)藥殘留,影響果實品質(zhì)和環(huán)境安全。因此,在果樹生產(chǎn)中使用一些高效安全、綠色環(huán)保的措施來調(diào)節(jié)果樹花芽分化,對提高蘋果產(chǎn)量及經(jīng)濟效益具有重要 意義。

花芽分化受到多種因素的影響,果樹花芽分化的基礎(chǔ)是營養(yǎng),關(guān)鍵過程是花芽中內(nèi)源激素的動態(tài)平衡,其需要的途徑是花芽分化過程中的基因表達[2],在這些條件下果樹花芽分化才可以順利進行。植物的花芽分化主要分為花芽生理分化期和花芽形態(tài)分化期[3]。成花誘導階段是花芽生理分化期的重要階段[4],主要發(fā)生在花后的3～6周[5],蘋果花芽形態(tài)分化期一般發(fā)生在花后12周。果樹的花芽孕育與枝條停止生長有關(guān)[3],對花芽分化影響的諸多因素中蘋果枝條的停長是花芽分化開始的先決條件之一。因此,控制枝條旺長形成花芽也是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一。植物激素在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用,參與了花芽分化的過程,影響植物的成花,激素平衡與否,將決定著芽是向花芽還是葉芽的方向轉(zhuǎn)變。植物激素如細胞分裂素(CTK)、脫落酸(ABA)、生長素(IAA)和赤霉素(GA),通過多種開花途徑調(diào)節(jié)開花[6-9],各激素之間通過相互影響和協(xié)調(diào)來調(diào)控植物的開花。蘋果成花的分子機理一直是人們研究的重點,目前在調(diào)控蘋果成花的分子機理上已形成多種調(diào)控途徑,各途徑之間相互影響并匯聚到整合因子上,誘導花分生組織的基因表達,使植物最終開花[10-12]。

復(fù)硝酚鉀是1997年經(jīng)美國國家環(huán)保局批準,進入美國綠色食品工程唯一人工合成植物生長調(diào)節(jié)劑,復(fù)硝酚鉀及其制劑被國際糧農(nóng)組織(FAO)指定為綠色食品工程推薦的植物生長調(diào)節(jié)劑,目前在文心蘭上的研究認為,復(fù)硝酚鉀對文心蘭幼苗的生長有一定的正效應(yīng),濃度越高,抑制效應(yīng)越明顯[13]。目前在國外,亞磷酸鉀在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用主要是作為一種殺菌劑在防疫病害和植物營養(yǎng)的功能性肥料方面,亞磷酸鹽被稱為肥料和殺菌劑[14-16]。亞磷酸鹽作為一種功能性的肥料在國外已廣泛應(yīng)用,而在我國研究的較少,亞磷酸態(tài)的3價磷具有雙向運輸?shù)墓δ?可同時在作物木質(zhì)部和韌皮部進行運輸,能夠加快植物對營養(yǎng)的吸收和利用,它可以促進草莓、馬鈴薯等植物的開花,提高產(chǎn)量[17]。本試驗在‘富士’蘋果生長季從生理和分子的角度揭示噴施復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀影響‘富士’成花的機制,為生產(chǎn)上人工調(diào)控蘋果成花,緩解‘富士’大小年問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗點位于陜西省寶雞市千陽縣南寨鎮(zhèn)西北農(nóng)林科技大學千陽蘋果試驗示范站,試驗區(qū)經(jīng)度107°59′48.5″,緯度34°7′22.5″。該地區(qū)屬暖溫帶半大陸性氣候,年均氣溫10.9 ℃,年降水量653 mm。以‘長富2號’/‘M26’/‘新疆野蘋果’為試驗材料,樹齡為8 a,果園株行距為3.5 m×1 m。

1.2 試驗設(shè)計

在2020年預(yù)備試驗的基礎(chǔ)上,2021年生長季共設(shè)4個處理,分別為清水對照CK、T1(復(fù)硝酚鉀1 mg·L-1)、T2(亞磷酸鉀3 340 mg·L-1)、T3(復(fù)硝酚鉀1 mg·L-1+ 亞磷酸鉀 3 340 mg·L-1)。試驗采取隨機區(qū)組設(shè)計,每個處理1株,有9個重復(fù),每個處理之間有1棵防護樹,在5月20日、6月20和7月20日分別進行噴施,所選試驗樹樹干周長一致,果園其他管理措施基本一致。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 枝條生長量測定 從處理的試驗樹上東西南北方向隨機選擇20個當年生新梢,用植物標簽做好標記,測定時間從噴施的時間開始到生長季結(jié)束,測定的時間為每兩周1次直至生長季節(jié)結(jié)束,最后計算當年生枝條長度的平均生長量。

1.3.2 短枝頂芽內(nèi)源激素含量測定 分別于3次噴施處理后第10天時采集4個處理短枝上的花芽,共采3次,芽采集完成后要迅速用錫箔紙包好,立即放入液氮后帶回實驗室存放-80 ℃冰箱保存,用于測定花芽內(nèi)源激素含量。內(nèi)源激素在提取和測定之前,將樣品從-80 ℃冰箱取出放入液氮中研磨好后稱取0.3 g,每個處理有3個生物學重復(fù),將研磨好的不同處理的樣品放入經(jīng)過滅菌的10 mL的離心管中(離心管在放樣之前要在液氮中進行預(yù)冷),然后立即放入提前在試劑公司預(yù)定好的20 kg的干冰中,隔熱密封好后,快遞郵寄至中國農(nóng)業(yè)大學植物激素研究所,并由該研究所通過間接酶聯(lián)免疫吸附測定法進行IAA(生長素)、ABA(脫落酸)、GA3(赤霉素)、ZR(玉米素核苷)等內(nèi)源激素含量的測定。

1.3.3 短枝頂芽相關(guān)成花基因表達量測定 在初次噴施之日后,采集噴施復(fù)硝酚鉀、亞磷酸鉀、復(fù)硝酚鉀+亞磷酸鉀以及對照4個處理的短枝頂芽,每隔15 d采集1次,共采集4次,采集完成后要立即將所有樣品用錫箔紙包好并做標記好后放置液氮中保存,帶回實驗室放置于-80 ℃低溫冰箱內(nèi)保存,用于測定芽內(nèi)相關(guān)成花基因的表達量。

短枝頂芽RNA的提取采用天根RNA試劑盒進行提取,提取完成后用2%瓊脂糖凝膠電泳對其完整性進行驗證,cDNA的合成使用的是塔克拉反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Bio,Japan),使用NCBI設(shè)計成花相關(guān)基因的引物序列(表1),qRT-PCR步驟按照塔克拉熒光定量預(yù)混試劑盒說明書進行,MdActin作為內(nèi)參基因,計算基因的表達量采用2-ΔΔCt法進行。

表1 成花相關(guān)基因定量PCR引物序列Table 1 Primers designed for flower related genes

1.3.4 次年成花率調(diào)查 調(diào)查次年蘋果樹露紅期花簇數(shù)量,計算花密度。

花密度=花簇數(shù)量/樹干橫截面積

樹干橫截面積測定是樹干從地面往上10 cm左右的垂直距離時測量的周長,然后計算半徑并求出橫截面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的處理和文圖的制作采用Excel 2019,數(shù)據(jù)的顯著性方差分析采用SPSS 11.5 (SPSS,Chicago,IL,USA)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施復(fù)硝酚鉀與亞磷酸鉀對‘富士’蘋果新梢生長的影響

由表2所示,在盛花期后1個月的時間里新梢迅速增長,各處理間無顯著差異。在5月中旬噴施處理后,與對照相比,噴施T1(復(fù)硝酚鉀)、T2(亞磷酸鉀)和T3(復(fù)硝酚鉀+亞磷酸鉀)處理下春梢長度分別為34.6 cm、31.6 cm、30.8 cm,而對照為43.4 cm,T2和T3比對照顯著地減少27.19%、29.03%。在7月中旬時,與對照相比,T2和T3顯著地降低了枝條的生長量,分別減少29.25%和28.26%。在蘋果整個生長季節(jié)結(jié)束時,枝條經(jīng)噴施處理后,都有一定的控制效果,其中T1、T2和T3處理下秋梢上長約2 cm,而對照噴清水上長10 cm左右。綜上所述,說明在噴施復(fù)硝酚鉀、亞磷酸鉀處理3次時,可以顯著地抑制枝條后期的生長。

表2 噴施復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀對不同時間‘富士’蘋果枝條平均長度的影響Table 2 Effects of compound potassium nitrophenolate and potassium phosphite application on mean shoot length in‘Fuji’apple tree cm

2.2 噴施亞磷酸鉀和復(fù)硝酚鉀對‘富士’蘋果花芽內(nèi)激素含量的影響

由圖1可知,‘富士’樹經(jīng)噴施處理后,隨著噴施次數(shù)的增加,IAA的含量呈下降趨勢,噴施第2次和第3次時,T3(復(fù)硝酚鉀+亞磷酸鉀)處理下IAA的含量與對照相比差異顯著(圖1-A)。ZR的含量隨著噴施次數(shù)的增加呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢,噴施第2次和第3次時,各處理間與對照相比, T3(復(fù)硝酚鉀+亞磷酸鉀)處理下ZR的含量顯著提高且高于其他處理,且差異顯著(圖1-B)。GA3的含量和IAA的含量整體趨勢一致,在整個測定時期內(nèi),GA3的含量隨著噴施次數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,噴施第1次時其他各處理和對照相比較差異顯著。噴施第3次時GA3的含量明顯降低,且差異顯著(圖1-C),與對照組相比,各處理對ABA的含量影響較小,ABA噴施第1次時含量較高,其他處理時期含量都比較低,且只在第3次噴施時有比較明顯的差異(圖1-D)。

同一噴施次數(shù)之間不同小寫字母表示顯著性差異水平(P<0.05)。下同

2.3 噴施復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀對相關(guān)成花基因表達的影響

圖2結(jié)果顯示,MdSOC1在花后45 d時一直處于低表達,但在花后60 d后表達量上調(diào),其中在花后60～75 d時表達量增加,與對照相比,T3處理都高于對照且差異顯著。MdFT和MdSOC1的趨勢基本一致,在花后45 d時低表達差異不明顯,在花后45 d以后,芽內(nèi)MdFT的表達水平顯著上升,在花后60 d時,MdFT各處理的表達量都高于對照,且差異顯著。在花后45 d和60 d對MdLFY的表達水平顯著提高,在花后 60 d時,T3處理的表達顯著高于其他處理,且差異顯著。在花后45 d后,MdFD的表達量逐漸增加,在60 d、75 d、105 d,MdFD的表達水平上調(diào),在花后60～75 d時,各處理間的表達水平都高于對照且差異比較顯著。MdTFL-1的表達水平在花后45 d開始被顯著下調(diào),在花后45 d時,與對照相比,各處理之間的表達量都低于對照,且T3處理下差異比較顯著。MdGA20ox的表達量出現(xiàn)先降低后升高的趨勢,在花后45 d ～60 d,MdGA20ox的表達顯著被下調(diào),在花后45 d時,各處理都低于對照且差異顯著,在花后60 d時,與對照相比,亞磷酸鉀處理下的MdGA20ox差異顯著,在花后105 d時,MdGA20ox的表達量雖然升高,但與對照相比降低且差異顯著。

圖2 不同處理下短枝頂芽內(nèi)相關(guān)成花基因的表達Fig.2 Expression of related flowering genes in short shoot buds under different treatments

2.4 噴施復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀對‘富士’蘋果成花的影響

如表3所示,對次年成花率而言,與對照相比,各處理開花數(shù)量上高于對照,T1(復(fù)硝酚鉀)和T2(亞磷酸鉀)處理后差異不顯著,T3(復(fù)硝酚鉀+亞磷酸鉀)處理下開花數(shù)量顯著提高了 63.14%,在花序密度上各處理高于對照,但差異不顯著。

表3 噴施復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀對‘富士’蘋果次年成花的影響Table 3 Effects of compound potassium nitrophenolate and potassium phosphite on flowering of‘Fuji’apple in next year

3 討 論

在影響花芽分化的諸多因素中,蘋果枝條的停長是花芽分化開始的先決條件之一。在對文心蘭幼苗的生長研究中發(fā)現(xiàn),高濃度的復(fù)硝酚鉀能顯著抑制幼苗的生長[13]。亞磷酸鉀作為一種高磷高鉀的肥料,可以調(diào)節(jié)葉片氣孔關(guān)閉,促進新梢老熟[18]。在番茄上,高濃度的亞磷酸鉀會抑制植株的生長[19],在對沃柑的研究中也發(fā)現(xiàn),春梢期噴施亞磷酸鉀可以對新梢轉(zhuǎn)綠老熟速度有明顯的促進作用[20]。本研究結(jié)果表明,‘富士’蘋果在噴施復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀后,與對照相比,T2和T3顯著降低了29.03%～31.64% 和27.18%～ 30.33%,這與前人在文心蘭、番茄和沃柑上研究的高濃度噴施處理情況下能抑制生長的結(jié)論相一致。從本試驗結(jié)果可以看出,‘富士’枝條被顯著地抑制是在枝條生長季節(jié)多次噴施3次后,可使春梢提前停長,防止秋梢旺盛生長,平衡營養(yǎng)生長與生殖生長的關(guān)系,從而在花芽分化的進程中使芽的頂端向有利于花芽形態(tài)的方向轉(zhuǎn)變,促進蘋果成花。

不同的植物激素會對成花產(chǎn)生不同的生理反應(yīng),在花芽的調(diào)控中發(fā)揮著促進或者抑制作用,植物體內(nèi)激素的平衡對是否形成花芽起著關(guān)鍵作用,激素作為一種重要的因子,不僅在果樹花芽分化中起到重要作用[21],也對成花途徑中基因的表達具有重要的影響。前人研究表明,在內(nèi)源激素中,IAA濃度較高不利于花芽分化[22],梁武元等[23]在對荔枝的研究中也表明,生長素含量低會促進果樹的花芽分化。本試驗中,在噴施復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀后,花芽內(nèi)IAA的含量是下降的,且隨著噴施次數(shù)的增加,T3處理下IAA的含量顯著低于對照,這與前人研究結(jié)果一致,說明IAA含量低是有利于成花的。而ZR的含量變化情況正好與IAA相反,隨著噴施次數(shù)的增加,T3處理下ZR的含量都顯著高于對照,這與曹尚銀等[24]所說的ZR能促進果樹花芽分化和植物內(nèi)源激素ZR含量隨成花進行不斷增加[25]的研究結(jié)果一致,說明高含量的ZR對促進花芽分化具有積極意義。有研究認為,IAA和CTK之間具有顯著的動態(tài)平衡關(guān)系,IAA含量的降低,可能會使ZR含量增加[26],而ZR作為CTK重要的運輸形式,與CTK的作用原理相一致。因此,本試驗中內(nèi)源激素IAA含量減少,ZR含量增加,在T3處理下差異顯著的原因可能是在多次噴施后且復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀復(fù)配后共同作用下,改變了芽內(nèi)的激素含量的動態(tài)變化情況,促進了花芽的形成。在中秋脆棗中,內(nèi)源激素GA3的含量與對照相比,明顯都高于對照[27]。前人多項研究表明,GA3在果樹花芽分化時期具有抑制的作用,低含量的GA3有利于果樹的花芽分化。本研究中,GA3的含量和IAA的含量整體趨勢一致,隨著噴施次數(shù)的增加,GA3的含量呈現(xiàn)下降的趨勢,且在噴施第3次時與對照相比各處理間GA3含量顯著下降,推測可能的原因是復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀多次噴施且在共同作用下,使芽內(nèi)有利于成花的激素累積增加,不利成花的GA3的含量下降,促進了成花。有研究表明,高含量的 ABA 對樹體營養(yǎng)生長起抑制作用,但能促進花芽孕育、提高果樹成花率[28]。本試驗中噴施處理后ABA的含量在起初較高,但后期各處理組ABA的含量逐漸下降但各處理之間差異不顯著。關(guān)于ABA與成花相關(guān)的理論說法不一,在花芽孕育臨界期,ABA的含量會上升[29],也有人認為,ABA 主要與枝條停長有關(guān),可能使枝條提前停長的作用而影響花芽的形成[30]。本試驗研究表明,ABA含量只在噴施的初期有顯著的提高,但后期含量確有下降,可能本試驗中ABA是通過枝條的停長來間接地影響花芽分化的。

花后的30～80 d是花芽孕育的關(guān)鍵時期,本試驗選取成花調(diào)控途徑中的幾個關(guān)鍵的成花基因從分子的機理方面來研究噴施復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀對‘富士’蘋果成花的影響。有研究報表明,FT在果樹成花的過程中發(fā)揮著重要作用[31],FT基因編碼的蛋白質(zhì)能夠調(diào)節(jié)成花相關(guān)芽的分生組織,促使其向生殖生長的方向轉(zhuǎn)變,促進成花[32-33],并且FT與FD編碼的蛋白相結(jié)合后,能夠調(diào)節(jié)莖尖與花芽相關(guān)的組織而促進基因表達,使植物開花[34]。本研究結(jié)果顯示,‘富士’經(jīng)噴施處理后,MdFT表達水平被上調(diào),在花后60 d時,T3處理下FT的表達量都顯著高于對照,這與王超等研究的在花芽發(fā)育的整個階段結(jié)果一致,同時,FD基因在花后60 d時也顯著高于對照,這與‘富士’蘋果在噴施NAA后FD基因在盛花后60 d時處理組顯著高于對照[35]的結(jié)果一致。說明復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀對MdFT和MdFD的合成產(chǎn)生了重要影響。SOC1在植物開花途徑中參與了多個途徑的信號因子的響應(yīng),它整合了多個開花途徑中的因子,啟動調(diào)節(jié)LFY的表達。本試驗中SOC1在花后45 d以后表達量上升,T3處理下的表達量最高且差異顯著,同樣在‘富士’經(jīng)葡萄糖處理后也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果[36],說明經(jīng)噴施處理后,促使SOC1整合了其他成花因子,促進了開花。LFY在花芽發(fā)育的進程中有重要的功能,它在果樹營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著重要的作用。在本研究中,在花后60 d時,各處理間與對照相比存在顯著差異,這與杜利莎等[37]研究結(jié)果一致。說明在45～60 d時促進了花芽的形成。此外,成花抑制基因MdGA20ox作為赤霉素成花途徑中的重要基因,可能與花芽內(nèi)GA的含量有關(guān),GA20ox作為一種關(guān)鍵的氧化酶,它在GA合成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[38]。本試驗中,GA20ox在花后45 d時顯著下調(diào),與芽內(nèi)MdGA20ox在成花起始期則開始下調(diào)表達[39]的觀點一致。TFL1在蘋果和梨的花芽誘導早期表達量較高,但在轉(zhuǎn)化至起始階段表達量下降[40-41]。同樣在‘金墜’梨中的表達量也在下降,說明其抑制成花[42]。本試驗中在花后45 d開始后MdTFL-1表達水平被下調(diào),但只在花后45 d時,T3處理的表達量顯著低于對照,這與前人研究中TFL-1基因的下調(diào)表達相一致。

本試驗只是在噴施處理后研究了其內(nèi)源激素具體的動態(tài)變化過程,從生理機制的角度說明了復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀可以通過調(diào)控‘富士’花芽內(nèi)激素的動態(tài)變化來促進‘富士’的花芽分化。

同時,在分子水平上選取了與成花相關(guān)的幾個關(guān)鍵基因來揭示噴施復(fù)硝酚鉀和亞磷酸鉀影響‘富士’蘋果成花的機制,驗證了噴施處理后在成花的關(guān)鍵時期相關(guān)成花基因得到了表達,最終促進了形態(tài)上花芽的形成,為研究蘋果成花的途徑提供了新的思路與方法,也為生產(chǎn)上人工調(diào)控蘋果的成花方法提供新的理論依據(jù),但是在花芽內(nèi)部激素和基因表達上是如何變化和調(diào)控即其作用機理還需進一步研究。