魏 文,王 勇

《中國心血管健康與疾病報告2019概要》[1]顯示,隨著我國居民生活方式的改變,心血管疾病的發(fā)生率和病死率處于不斷上升的階段,已成為我國病死率最高的疾病。急性心肌梗死(AMI)等缺血性心肌病作為心血管疾病中最為常見且嚴(yán)重的一種,給個人和國家都帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此,探究和尋找對缺血性心肌病安全有效的防治策略具有重要的臨床意義[2]。缺血等外界刺激可促進(jìn)炎性小體NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)的轉(zhuǎn)錄翻譯,升高的NLRP3通過激活下游信號通路直接誘導(dǎo)合成分泌白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎性因子,介導(dǎo)參與免疫反應(yīng)[3]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)和輔助性T細(xì)胞17(Th17細(xì)胞)屬于CD4+T細(xì)胞亞群,分別具有免疫抑制和促進(jìn)炎癥反應(yīng)的功能,相關(guān)研究已證實,Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞在炎性環(huán)境中可以相互轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致Treg/Th17比例發(fā)生改變,二者的動態(tài)平衡參與了多種慢性炎性疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。AMI等缺血性心肌病同樣涉及多種白細(xì)胞亞群和炎性細(xì)胞因子的相互作用,馮金花等[5]研究證實,Treg/Th17失衡與AMI致心肌損傷密切相關(guān)。

中醫(yī)藥在AMI的治療與預(yù)防中的使用較廣泛,有助于改善AMI預(yù)后[6]。迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是1958年由Elis首次從唇形科植物迷迭香中分離獲得,主要存在于唇形科、紫草科、葫蘆科、椴樹科、傘形科的多種植物中[7]。研究表明,迷迭香酸是一種具有多功能的天然活性物質(zhì),具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理學(xué)作用[7]。因此,本研究擬探究迷迭香酸對AMI大鼠Treg/Th17平衡及對NLRP3、IL-1β和IL-10水平的影響,并分析其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠50只,體質(zhì)量(230±30)g,購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,實驗動物合格證號:11400700058280,實驗動物許可證號:SCXK(京)2016-0011。大鼠飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食水,光線各12 h明暗交替,飼養(yǎng)濕度(40±10)%,溫度(25±2)℃。實驗方案獲實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗儀器、藥物和試劑 流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特科技有限公司);石蠟包埋機(jī)(德國Leica公司);石蠟切片機(jī)(德國Leica公司);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);電子天平(上海良品儀器廠);低溫高速離心機(jī)(日本Hitachi公司);多功能圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)。迷迭香酸(Sigma公司,貨號:R4033)。IL-1β酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(Sigma公司,貨號:AB1832P);IL-10 ELISA試劑盒(Sigma公司,貨號:RAB0246);NLRP3 ELISA試劑盒(Sigma公司,貨號:SAB5700723);2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)試劑(Sigma公司,貨號:17779);CD4-FITC抗體(Ebioscience,貨號:11-0041-82);CD25-PE抗體(Ebioscience,貨號:25-0251-82);CD127-PE-CY7抗體(Ebioscience,貨號:25-1271-82);CD3-FITC抗體(Ebioscience,貨號:11-0039-45);IL-17-PE(Ebioscience,貨號:25-7177-82)。

1.3 動物分組和給藥 將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、迷迭香酸低劑量組、迷迭香酸中劑量組、迷迭香酸高劑量組,每組10只。假手術(shù)組和模型組按10 mg/kg給予0.9%NaCl灌胃,迷迭香酸低劑量組、迷迭香酸中劑量組、迷迭香酸高劑量組分別給予迷迭香酸50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg灌胃,連續(xù)灌胃5 d后建立大鼠AMI模型,收集大鼠外周血及心肌標(biāo)本待檢。

1.4 大鼠AMI模型的建立 3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉大鼠,固定并行氣管插管,連接小動物心電圖機(jī)檢測大鼠心電情況。于大鼠胸骨左緣第3肋、第4肋開胸,完全暴露心臟后,在前室間溝處可見左冠狀動脈前降支(LAD)走形,用4-0絲線穿過大鼠LAD起始部,拉緊絲線結(jié)扎,阻斷LAD致心肌缺血,此時心電圖機(jī)記錄到心電圖ST-T抬高,說明大鼠AMI模型建模成功。

1.5 檢測方法

1.5.1 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌組織病理改變 將獲取的心臟組織置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h后,通過脫水、透明、浸蠟、包埋等過程獲得石蠟塊。將石蠟切片脫蠟,同時先后行蘇木精染液染色和伊紅染液染色,經(jīng)過二甲苯和無水乙醇透明后,將已透明的切片滴上中性樹脂封片,于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.2 TTC染色檢測心肌梗死面積 AMI 2 h后,打開大鼠腹腔,充分暴露下腔靜脈,現(xiàn)配現(xiàn)用TTC液,以腎臟水平為穿刺點,朝向頭部穿刺下腔靜脈并推注約1 mL TTC液。15 min后靜脈注射氯化鉀(75 mg/kg)處死大鼠并取出心臟,清洗心肌組織后置于-80 ℃冰箱內(nèi)冰凍20 min后切片。心臟切片用0.9%NaCl清洗后放入多聚甲醛中固定顯色,最終白色為梗死區(qū)域,根據(jù)白色區(qū)域面積占比大小評估梗死情況。

1.5.3 ELISA法測定NLRP3、IL-1β及IL-10水平 左室心肌組織勻漿后,4 ℃,3 000 r/min離心15 min后取上清液于-20 ℃進(jìn)行檢查。按照ELISA試劑盒操作說明書檢測NLRP3、IL-1β及IL-10水平。

1.5.4 流式細(xì)胞儀檢測外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中Treg/Th17 缺血2 h后打開大鼠腹腔于下腔靜脈處取血5 mL至抗凝管中,采用密度梯度離心法進(jìn)行PBMC的分離。將下腔靜脈血與等量磷酸鹽緩沖液(PBS)及淋巴細(xì)胞分離液混合均勻,然后室溫下1 500 r/min離心15 min將混合液分為4層,吸取第2層細(xì)胞至15 mL離心管中,加入3倍的PBS混勻,再次室溫下1 000 r/min離心10 min后棄上清液并重懸細(xì)胞,將PBMC濃度調(diào)整至2×106/mL。

1.5.4.1 Treg細(xì)胞檢測 將分離好的PBMC加入24孔板上,加入CD4-FITC抗體,4 ℃下避光孵育20 min后加入CD25-PE抗體進(jìn)行透膜/固定30 min,然后加入CD127-PE-CY7抗體。最后加入預(yù)冷的PBS 2 mL離心并重懸細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀檢測。以CD4-FITC同型對照抗體作為對照,加入同型對照抗體。

1.5.4.2 Th17細(xì)胞檢測 將分離好的PBMC加入24孔板上,加入25 ng/mL的丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)、1 μg/mL的離子霉素、1.4 μg/mL的莫能霉素和3 μg/mL的布雷菲德菌素A(BFA),混勻后在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。完成后1 300 r/min離心10 min,去上清,加入CD3-FITC抗體,4 ℃下避光孵育20 min;透膜/固定30 min后加入IL-17-PE抗體。最后加入預(yù)冷的PBS 2 mL離心并重懸細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀檢測。以CD3-FITC同型對照抗體作為對照。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理改變 假手術(shù)組大鼠心肌組織未見異常變化。模型組大鼠心肌組織紊亂,心肌變性、壞死明顯,細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯,還有大量炎性細(xì)胞浸潤。不同濃度迷迭香酸預(yù)處理可使心肌細(xì)胞變性壞死得到改善,且這種改變呈劑量依賴性。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理改變(×200)(A為假手術(shù)組,B為模型組,C為迷迭香酸低劑量組,D為迷迭香酸中劑量組,E為迷迭香酸高劑量組)

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較 與模型組比較,迷迭香酸低劑量組、迷迭香酸中劑量組、迷迭香酸高劑量組大鼠心肌梗死面積均減小,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s) 單位:%

2.3 各組大鼠NLRP3、IL-1β及IL-10蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較,模型組NLRP3、IL-1β升高,IL-10下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,迷迭香酸低劑量組、迷迭香酸中劑量組、迷迭香酸高劑量組NLRP3、IL-1β表達(dá)減低,IL-10水平升高,且呈劑量依賴性,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠NLRP3、IL-1β、IL-10蛋白表達(dá)比較(±s)

2.4 各組大鼠外周血PBMC中Treg和Th17細(xì)胞比較 與假手術(shù)組比較,模型組中Treg細(xì)胞占比下降,Th17細(xì)胞占比升高,Treg/Th17值下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,迷迭香酸低劑量組、迷迭香酸中劑量組、迷迭香酸高劑量組Treg細(xì)胞占比增加,Th17細(xì)胞占比降低,Treg/Th17值升高,且呈劑量依賴性,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠外周血PBMC中Treg和Th17細(xì)胞比較(±s)

3 討 論

本研究結(jié)果顯示,AMI大鼠心肌NLRP3水平、外周血Th17細(xì)胞占比及Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β水平顯著增高,Treg細(xì)胞占比及Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10水平明顯下降;而迷迭香酸低、中、高劑量組可減輕心肌梗死面積,改善心肌細(xì)胞變性壞死,降低NLRP3、IL-1β水平及Th17細(xì)胞占比,升高IL-10水平、Treg細(xì)胞占比及Treg/Th17值,且以上改變呈劑量依賴性,表明迷迭香酸對急性心肌梗死心肌具有有效的保護(hù)作用,其作用可能是通過升高Treg/Th17比值,調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)因子NLRP3、IL-1β及IL-10的表達(dá)實現(xiàn)的。

NLRP3是人體免疫的重要調(diào)控者,其可由各種激活劑觸發(fā)[8]。NLRP3的特征為其N端熱蛋白結(jié)構(gòu)域可通過同型相互作用招募凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC),進(jìn)而通過Caspase募集域同型相互作用征集Caspase-1前體,完成NLRP3炎性小體的組裝,促使Caspase-1的活化和IL-1β的生成,激活并放大炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷[3,8]。研究表明,NLRP3的表達(dá)水平與AMI病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[9]。吳蔚等[10]研究表明,NLRP3的高表達(dá)與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),與冠狀動脈正常對照組比較,冠心病病人血清NLRP3表達(dá)水平顯著增高。Jaén等[11]研究顯示,AMI發(fā)生后,激活后的NLRP3還可活化核因子-κB(NF-κB),促使IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎因子的釋放,而釋放的炎癥介質(zhì)又可進(jìn)一步促進(jìn)NLRP3合成分泌,形成炎癥正反饋。Treg和Th17兩種CD4+T細(xì)胞亞型在AMI的發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用,Treg細(xì)胞及IL-10可抑制AMI所致的心肌損傷,而Th17細(xì)胞及IL-1β卻加速了AMI的進(jìn)展,在AMI動物模型和冠心病病人中均發(fā)現(xiàn)存在Treg/Th17失衡[12-15]。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,AMI大鼠心肌組織中NLRP3的表達(dá)升高,外周血中Th17細(xì)胞占比及Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β水平顯著增高;而Treg細(xì)胞占比及Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10水平明顯下降,與既往研究結(jié)果一致。

相關(guān)研究證實,中醫(yī)藥可能為有效防治AMI等缺血性心肌病帶來新希望[16]。中醫(yī)藥理論認(rèn)為,AMI等缺血性心肌病存在血瘀病癥。藥理研究表明,迷迭香酸可通瘀血,在改善缺血性損傷、抗炎及抗氧化方面有良好的藥理活性及較高的開發(fā)潛質(zhì)[17]。李麗等[18]研究發(fā)現(xiàn),迷迭香酸可通過提高氧化酶活性、增強(qiáng)自由基清除能力而對大鼠冠狀動脈結(jié)扎后引起的心肌缺血損傷發(fā)揮保護(hù)作用。張鑫等[19]研究顯示,迷迭香酸可有效降低過氧化氫所致心肌細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述,迷迭香酸可以增加Treg/Th17值,降低AMI心肌中NLRP3、IL-1β蛋白的高表達(dá),同時增加IL-10表達(dá),從而減小心肌梗死面積,發(fā)揮心肌保護(hù)作用。