燕煉鋼 周婷 賈澤坤 李靜 王儲(chǔ)蓄

創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎(traumatic osteoarthritis,TOA)是骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)的一種亞型,發(fā)生于關(guān)節(jié)損傷后,關(guān)節(jié)軟骨磨損、退化變性為TOA的主要病理改變,造成患者膝關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)障礙[1]。諸多證據(jù)表明,炎性反應(yīng)是介導(dǎo)TOA病理過程重要且不可避免的促成因素,其中核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)是介導(dǎo)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因子,其通過核易位而活化,調(diào)控促炎因子表達(dá),誘導(dǎo)炎性發(fā)生[2]。蛋白翻譯后修飾在NF-κB核易位過程中扮演著重要角色,如經(jīng)乙酰化、甲基化、磷酸化等,沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)是一種常見的去乙?；?其可誘導(dǎo)NF-κB去乙?；?從而抑制其核易位,減輕炎性反應(yīng)[3,4]。而SIRT1在一定程度上受5’磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)的調(diào)控[5]。故而AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路被認(rèn)為是抑制炎性反應(yīng)的重要靶向信號通路。中醫(yī)將TOA歸屬于“骨痹”“痹癥”范疇[6]。隔藥灸為艾灸的形式之一,其較直接灸火力溫和,且可實(shí)現(xiàn)艾灸和藥物雙重作用,適用于諸多慢性疾病的治療[7,8]。三七又名人參三七,有散瘀活血、消腫止痛的功效,且現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,三七亦具有顯著的抗炎療效[9]。目前已有研究報(bào)道隔三七餅灸對OA取得了較好的療效[10],但其作用機(jī)制仍不清楚?；谏鲜鰞?nèi)容,本研究采用經(jīng)典Hulth方法復(fù)制TOA大鼠模型,觀察隔三七餅灸對TOA大鼠軟骨損傷的影響,并探究調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路作為其藥理機(jī)制的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級SD大鼠,雄性,體重280～300 g,購自北京華阜康生物公司[許可證號:SYXK(京)2019-0022]。喂養(yǎng)環(huán)境:12 h光/12 h暗交替模式,溫度22～26℃,濕度40%～55%,自由攝食、進(jìn)水。

1.2 主要試劑 三七粉、艾絨由本院中藥房提供;AMPK抑制劑Compound C(MedCheExpress公司);HE染色、番紅-固綠染色試劑盒(上海源葉生物公司);一氧化氮(NO)檢測試劑盒、RIPA裂解液、核蛋白抽提試劑盒、BCA試劑盒(均碧云天生物公司);白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)Elisa檢測試劑盒(均上海酶研生物公司);基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1,3 Elisa檢測試劑盒(均武漢華美生物工程有限公司);兔源一抗Ⅱ型膠原蛋白(Collagen Ⅱ)、AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、SIRT1、乙?；疦F-κB(ac-NF-κB)、anti-Histone H3、anti-GAPDH(均Abcam公司);兔源一抗NF-κB(北京百奧萊博科技公司);山羊抗兔二抗(Absin公司)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)藥物制作:①三七餅制作法:取三七粉10 g,加入5 ml 60%酒精調(diào)制為濃稠糊狀,隨后做成直徑約3 cm、厚約0.8 cm的餅狀,用針在餅中間刺10個(gè)小孔,利于艾灸熱力的傳導(dǎo)。②艾炷制作法:取艾絨2 g,反復(fù)揉搓使之緊實(shí),隨后通過邊旋轉(zhuǎn)、邊捏,使其變成圓錐形(上尖下平)的艾炷。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型構(gòu)建:隨機(jī)把40只大鼠分為假手術(shù)(sham)組、TOA組、隔三七餅灸組、扶他林組、隔三七餅灸+AMPK抑制劑組,每組8只。采用經(jīng)典Hulth方法復(fù)制TOA模型[11],將大鼠麻醉后固定,消毒膝關(guān)節(jié)后打開關(guān)節(jié)腔,切斷前后交叉韌帶,移除內(nèi)側(cè)半月板,sham組僅做打開關(guān)節(jié)腔處理。術(shù)后抗炎3 d。術(shù)后1周根據(jù)分組進(jìn)行干預(yù)。

1.3.3 治療方法:將隔三七餅灸組大鼠麻醉、固定于鼠臺(tái)上,參考《小動(dòng)物針灸法手冊》對其進(jìn)行穴位定位,取足三里穴、腎俞穴并進(jìn)行備皮,將三七餅置于穴位上,艾炷置于三七餅上方,隨后開始艾灸,每次每穴灸5個(gè)艾炷(藥餅烤干時(shí)及時(shí)更換),以灸側(cè)皮膚紅潤且不起泡為度,隔日1次,10次為1個(gè)療程,共治療2個(gè)療程(療程間隔5 d);隔三七餅灸+AMPK抑制劑組在隔三七餅灸組處理基礎(chǔ)上腹腔注射AMPK抑制劑,每次10 mg/kg,1次/周,連續(xù)給藥3周;對扶他林組大鼠行膝關(guān)節(jié)周圍備皮,而后均勻涂抹扶他林,2次/d,10次為1個(gè)療程,共治療2個(gè)療程(療程間隔5 d)。

1.3.4 HE染色和番紅-固綠染色觀察軟骨組織病理改變:于末次給藥后次日,處死大鼠,取出膝關(guān)節(jié)軟骨組織,將一部分經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后置于EDTA脫鈣液中脫鈣15 d,隨后進(jìn)行組織脫水、石蠟包埋、切片(4 μm厚),進(jìn)行常規(guī)HE染色和番紅-固綠染色,于顯微鏡下觀察分析,并進(jìn)行Mankin’s評分[12],得分越高表示病變越嚴(yán)重。剩余軟骨組織保存于-80℃?zhèn)溆?。見?。

1.3.5 免疫組化檢測軟骨組織中Collagen Ⅱ 陽性表達(dá)情況:取2.4制作好的切片,常規(guī)脫蠟水化處理后進(jìn)行抗原修復(fù),而后浸于3%H2O2溶液中10 min以滅活過氧化物酶活性,浸于5%山羊血清中封閉非特異性位點(diǎn),而后孵育兔抗大鼠一抗Collagen Ⅱ(4℃過夜),次日孵育山羊抗兔二抗(37℃ 30 min),DAB顯色液孵育5 min,蘇木精復(fù)染2 min,而后脫水、透明、封片,于顯微鏡下觀察,利用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

表1 Mankin’s評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.6 檢測軟骨組織中炎性介質(zhì)水平:取1.3保存的軟骨組織,勻漿后離心收集上清,采用NO檢測試劑盒,IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-13 Elisa檢測試劑盒測定上清中NO、IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-13水平。

1.3.7 Western Blot檢測軟骨組織中AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況:取1.3.4保存的軟骨組織,利用RIPA裂解液提取總蛋白或利用核蛋白抽提試劑盒提取核蛋白,BCA法測定濃度,加入2×蛋白上樣緩沖液定量后進(jìn)行沸水浴變性,而后經(jīng)凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)模,5%脫脂奶粉封閉后孵育兔源一抗AMPK、p-AMPK、SIRT1、NF-κB、ac-NF-κB、anti-Histone H3、anti-GAPDH(4℃過夜),次日孵育山羊抗兔二抗(室溫2 h),最后滴加ECL顯色劑、置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照,最后借助Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 5組軟骨組織病理改變 Sham組軟骨表面光滑,軟骨細(xì)胞豐富、排列整齊;TOA組軟骨層變薄,表面出現(xiàn)裂隙樣破壞,軟骨細(xì)胞大量減少、排列紊亂,蛋白多糖明顯丟失,Mankin’s評分增高,經(jīng)隔三七餅灸或扶他林干預(yù)后,軟骨組織病變明顯減輕,Mankin’s評分下降,且隔三七餅灸干預(yù)改善更明顯;隔三七餅灸+AMPK抑制劑組較隔三七餅灸組軟骨病變加重,Mankin’s評分增高。見表2,圖1。

表2 5組軟骨組織Mankin’s評分 n=8,分,

2.2 5組軟骨組織中Collagen Ⅱ陽性表達(dá)情況 與Sham組比較,TOA組軟骨組織中Collagen Ⅱ陽性表達(dá)下降(P<0.05);與TOA組比較,隔三七餅灸組、扶他林組軟骨組織中Collagen Ⅱ陽性表達(dá)增高,且隔三七餅灸組增高更明顯(P<0.05);與隔三七餅灸組比較,隔三七餅灸+AMPK抑制劑組軟骨組織中Collagen Ⅱ陽性表達(dá)下降(P<0.05)。見圖2,表3。

圖1 5組軟骨組織病理改變(×200)

圖2 Collagen Ⅱ免疫組化染色(×200)

表3 5組軟骨組織中Collagen Ⅱ陽性表達(dá)情況 n=8,

2.3 5組軟骨組織中炎性介質(zhì)水平 與Sham組比較,TOA組軟骨組織中NO、IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-3水平增高(P<0.05);與TOA組比較,隔三七餅灸組、扶他林組軟骨組織中NO、IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-3水平下降,且隔三七餅灸組下降更明顯(P<0.05);與隔三七餅灸組比較,隔三七餅灸+AMPK抑制劑組軟骨組織中NO、IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-3水平增高(P<0.05)。見表4。

表4 5組軟骨組織中炎性介質(zhì)水平 n=8,

2.4 4組軟骨組織中AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 與Sham組比較,TOA組軟骨組織中p-AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)下降,ac-NF-κB、核NF-κB蛋白表達(dá)增高(P<0.05)(P<0.05);與TOA組比較,隔三七餅灸組軟骨組織中p-AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)增高,ac-NF-κB、核NF-κB蛋白表達(dá)下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與隔三七餅灸組比較,隔三七餅灸+AMPK抑制劑組軟骨組織中p-AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)下降,ac-NF-κB、核NF-κB蛋白表達(dá)增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5,圖3。

表5 4組軟骨組織中AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 n=8,

圖3 AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白Western Blot條帶圖;A Sham組; B TOA組;C 隔三七餅灸組;D 隔三七餅灸+AMPK抑制劑組

3 討論

TOA為OA的一種常見類型,易發(fā)生于膝蓋、腳踝、肘關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)等部位,其發(fā)病率越來越高[1]。目前認(rèn)為,長期的炎性刺激是介導(dǎo)TOA發(fā)病的主要病理基礎(chǔ),NO、IL-1β、TNF-α等為常見的炎性因子,不僅可抑制軟骨細(xì)胞的增長,還可誘導(dǎo)MMP-1、MMP-3等蛋白酶的產(chǎn)生,使軟骨中的膠原蛋白及蛋白多糖被分解,進(jìn)而導(dǎo)致軟骨損傷[13,14]。本研究結(jié)果顯示,相比于Sham組,TOA組軟骨組織軟骨層變薄,表面出現(xiàn)裂隙樣破壞,軟骨細(xì)胞大量減少,蛋白多糖明顯丟失,Mankin’s評分增高,同時(shí)MMP-1、MMP-3水平增高,Collagen Ⅱ陽性表達(dá)下降,此外,NO、IL-1β、TNF-α水平增高,表明TOA大鼠軟骨組織存在明顯炎性反應(yīng)及軟骨損傷。

臨床研究顯示,非甾體抗炎藥如扶他林為臨床治療TOA的常用藥物,可在一定程度上消炎、鎮(zhèn)痛,但效果仍不盡理想[15]。筆者發(fā)現(xiàn)近年來,研究者逐漸把目光投向了我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)。TOA屬傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“骨痹”“痹癥”范疇,主要病機(jī)為外傷或勞損致氣血瘀滯,經(jīng)絡(luò)閉阻,不通則通,筋骨失養(yǎng),久之骨節(jié)偏枯,關(guān)節(jié)失動(dòng)[16]。艾灸是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的特色外治方法之一,主要借助灸火的熱力,通過經(jīng)絡(luò)傳導(dǎo),以達(dá)到散瘀散節(jié)、活血行氣的功效[17]。

隔藥灸為艾灸的一種常見形式,可實(shí)現(xiàn)艾灸和藥物的雙重作用。已有大量研究報(bào)道隔藥灸對OA及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有顯著的療效[7,8]。在本研究中,我們選用三七作為隔藥灸的藥物,其不僅具有化瘀、散血、止痛的功效,亦具有抗炎的功效[9]。足三里穴、腎俞穴為常用的防病強(qiáng)壯穴,其中足三里穴具有扶正祛邪,補(bǔ)氣益中、通經(jīng)活絡(luò)的功效;腎俞穴不僅可溫陽補(bǔ)腎,強(qiáng)化骨骼,且可疏通諸陽經(jīng)經(jīng)氣,使經(jīng)絡(luò)通暢,二者綜合使用,可達(dá)到相互滋生、兼顧的功效[18,19]。本研究結(jié)果表明隔三七餅灸能夠抑制TOA大鼠軟骨組織炎性反應(yīng),減輕軟骨損傷,且效果顯著。

SIRT1/NF-κB是介導(dǎo)炎性反應(yīng)的重要信號通路之一,且該通路已被大量研究證實(shí)與OA的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān),其作用機(jī)制為SIRT1是一種去乙?；?通過誘導(dǎo)NF-κB去乙酰化而抑制其核易位,進(jìn)而抑制炎性因子的釋放[3,4]。此外,諸多研究表明AMPK磷酸化活化后可調(diào)控SIRT1表達(dá),激活SIRT1/NF-κB通路[5]。

為了探究調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路是否為隔三七餅灸的可能藥理機(jī)制,我們首先檢測了隔三七餅灸干預(yù)后,TOA大鼠軟骨組織中AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)p-AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)下降,ac-NF-κB、核NF-κB蛋白表達(dá)增高,提示隔三七餅灸能夠調(diào)控AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路。然后我們在隔三七餅灸干預(yù)的同時(shí)給予AMPK抑制劑Compound C干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)TOA大鼠軟骨組織炎性反應(yīng)及損傷加重,證實(shí)調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路為隔三七餅灸的藥理機(jī)制。

綜上所述,隔三七餅灸能夠減輕TOA大鼠軟骨損傷,可能與調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路有關(guān)。希望本研究能為隔三七餅灸應(yīng)用于治療TOA提供參考依據(jù)。