王一鳴 安全 楊楊 霍彤 邵雪 權(quán)強(qiáng)華

關(guān)鍵詞：松茸；色素沉著；酪氨酸酶活性；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

在人類皮膚中，黑色素在表皮底層的黑色素細(xì)胞中合成，是抵御紫外線引起的皮膚損傷的重要保護(hù)元件[1， 2]。雖然黑色素能夠吸收紫外線，刺激皮膚生長(zhǎng)來保護(hù)暴露在陽(yáng)光下的皮膚，但黑色素過量聚集則會(huì)導(dǎo)致皮膚產(chǎn)生色斑、色素過度沉著等皮膚問題。酪氨酸酶以及酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TRP-1） 和酪氨酸酶相關(guān)蛋白質(zhì)2（TRP-2） 作為參與黑色素生物合成的主要酶，其酶活性與黑色素生成密切相關(guān)[3， 4]。在皮膚色素沉著相關(guān)的抑制劑研究中，是否能夠調(diào)控酪氨酸酶活性是研究黑色素生成過程的重要方向[5，6]。目前熊果苷、曲酸和維生素衍生物多被用作改善皮膚色素沉著的成分。然而，由于安全性問題，如嗜鉻癥、萎縮癌變和其他局部或全身的副作用，使得天然藥用植物資源代替皮膚色素沉著抑制劑成為護(hù)膚品研究關(guān)注的重點(diǎn)領(lǐng)域[7-10]。

松茸（Tricholoma matsutake，TM） 是一種外生菌根共生真菌，屬于松茸亞屬，也是一種非常重要的食用菌，營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美。之前研究表明松茸多糖具有多種免疫刺激活性[11]、抗腫瘤活性[12]、抗氧化活性[13]、造血活性和抗突變活性[14，15]。在中國(guó)和日本等亞洲國(guó)家，松茸被用于疾病的預(yù)防和治療已有1000 多年歷史[15-21]。然而，目前還沒有關(guān)于松茸在改善色素沉著過度方面的全面性功能性研究。

因此，本研究探討了松茸提取物對(duì)B16-F10 黑色素瘤細(xì)胞的黑色素合成、酪氨酸酶活性的影響。通過建立動(dòng)物皮膚色素沉著模型，進(jìn)一步研究松茸對(duì)膚色調(diào)節(jié)的作用。隨后，為了確定松茸提取物對(duì)人類皮膚色素沉著的影響，檢測(cè)了34 名受試者在使用了松茸提取物后皮膚顏色和光澤改善情況。最后為了探索松茸提取物潛在的抗色素沉著機(jī)制，對(duì)UVB 刺激和松茸提取物處理后的B16-F10 細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

01實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑

含有10%（v/v） 胎牛血清（FBS） 和1% 鏈霉素—青霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM） 購(gòu)自GIBCO Invitrogen。磷酸鹽緩沖溶液購(gòu)自康寧公司。蘑菇酪氨酸酶和l-3，4- 二羥基苯丙氨酸（L-DOPA） 購(gòu)自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密蘇里州，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備松茸提取物

松茸在100℃去離子水中提取，隨后用H1O3 大孔吸附樹脂和40% 乙醇純化。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠黑色素瘤B16-F10 細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并在37℃的5%CO2 培養(yǎng)箱中保存。

1.2.3 細(xì)胞活力測(cè)定

利用CCK-8 測(cè)定法測(cè)量松茸提取物誘導(dǎo)后的B16-F10 細(xì)胞增殖水平。首先將細(xì)胞接種于DMEM 的96孔板中并培養(yǎng)24 h。隨后將松茸提取物加入細(xì)胞中培養(yǎng)24 h，將10 μL 的CCK-8 溶液添加到每個(gè)孔中孵育1 小時(shí)并測(cè)量細(xì)胞在490 nm 處的細(xì)胞活力。

1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（SCXK Liao 2015-0001）。C57BL/6 雄性小鼠購(gòu)自遼寧昌盛生物科技有限公司。飼養(yǎng)條件：溫度20 ～ 24℃；相對(duì)濕度55% ～ 65%；晝夜12 h-12 h；可自由進(jìn)食飲水。小鼠每天暴露于330 mJ/cm2 的UVB 輻射，持續(xù)15 天。實(shí)驗(yàn)前將小鼠背部區(qū)域電剪刀剃毛（面積均為2 cm×2cm），隨后用0.2%、0.5%、1% 的松茸提取物和3% 的熊果苷對(duì)小鼠背部皮膚進(jìn)行局部給藥，每天兩次，持續(xù)40 天。

1.2.5 B16-F10 的黑色素含量和酪氨酸酶活性測(cè)定

B16-F10 細(xì)胞在37 ℃ 和5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。在加入50 μM 的8-MOP（8- 甲氧補(bǔ)骨脂素） 之前，用松茸提取物預(yù)處理細(xì)胞6h。24h 后丟棄上清液，并用1 mL PBS 洗滌兩次。使用1 mL 1 moL/L NaOH（含有10%DMSO） 溶解B16-F10 細(xì)胞中的黑色素，測(cè)定490nm 處吸光度。

1.2.6 小鼠皮膚的黑色素含量測(cè)定

在松茸提取物和熊果苷處理后的40 天，使用多功能皮膚UV 分析儀（ES-3100） 檢測(cè)小鼠背部皮膚的黑色素指數(shù)。

1.2.7 小鼠皮膚的酪氨酸酶含量測(cè)定

向小鼠腹膜內(nèi)注射三溴乙醇（240 mg/kg） 進(jìn)行麻醉，取背部皮膚，并進(jìn)行精確稱重和勻漿，通過TYRELISA試劑盒測(cè)定勻漿中酪氨酸酶的含量。每組3 個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.2.8 志愿者指標(biāo)采集

研究得到了北京中德聯(lián)合化妝品研究所的批準(zhǔn)，所有志愿者都充分了解了實(shí)驗(yàn)的目的并簽署了知情同意書。對(duì)34 名女性（44 ～ 55 歲） 進(jìn)行了自身對(duì)照研究，評(píng)估松茸提取物改善面部皮膚膚色的能力。受試者每晚使用含有松茸提取物的面膜共4 周，測(cè)試期間，受試者保持原有的清潔護(hù)膚方式、習(xí)慣和品牌不變，停用自己的面膜。

1.2.9 人臉皮膚顏色和光澤測(cè)定

在22±2℃和50%±5% 濕度環(huán)境下檢測(cè)皮膚顏色和光澤度。志愿者洗臉30 分鐘后，使用MPA-580（CK，德國(guó)） 的Chromeeter CR-400 和Glossymeter GL200 的探頭檢測(cè)皮膚顏色和光澤度檢測(cè)每個(gè)受試者的皮膚狀態(tài)。檢測(cè)時(shí)間分別為試驗(yàn)前、試驗(yàn)后2 周和試驗(yàn)后4 周。

1.2.10 轉(zhuǎn)錄組分析

本研究對(duì)UVB 刺激和松茸提取物處理后的B16-F10細(xì)胞進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步了解松茸提取物抗紫外機(jī)制。以P 值<0.01，|log2FC|>2為標(biāo)準(zhǔn)，篩選8-MOP 處理前后細(xì)胞顯著差異表達(dá)基因。隨后對(duì)上調(diào)和下調(diào)的顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析，包括解析其相關(guān)潛在靶點(diǎn)在生物過程（PB）、分子功能（MF） 和細(xì)胞成分（CC） 中的作用。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 7.0 版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均值的平均標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM） 表示，在P 值<0.05 時(shí)，數(shù)值差異被認(rèn)為是顯著的。

02結(jié)果

2.1 松茸提取物抑制B16-F10 細(xì)胞中酪氨酸酶的活性，從而抑制黑色素生成

通過CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活性以確定松茸提取物的最佳處理濃度。與對(duì)照組相比，在較高濃度1 mg/mL 松茸提取物的刺激下未觀察到細(xì)胞毒性（見圖2A）。通過測(cè)量B16-F10 細(xì)胞的黑色素含量發(fā)現(xiàn)，以8-MOP 刺激B16-F10 細(xì)胞作為黑色素生成模型組，模型組的黑色素含量為對(duì)照組的117.54%（p <0.01），高于空白組、加入熊果苷處理的陽(yáng)性對(duì)照組和加入松茸提取物處理組（見圖2B）。如圖2C 所示，松茸提取物以劑量依賴的方式抑制酪氨酸酶活性，與對(duì)照組和空白組相比，松茸處理組和陽(yáng)性對(duì)照組的酪氨酸酶活性均顯著下降。

2.2 松茸提取物對(duì)動(dòng)物皮膚具有美白作用

以上結(jié)果表明，松茸提取物可以通過抑制B16-F10中的酪氨酸酶活性，從而抑制黑色素的生成。為了確定松茸提取物對(duì)小鼠皮膚色素沉著過度的影響，隨后檢測(cè)暴露于UVB 后小鼠的黑色素指數(shù)變化情況?？瞻捉M小鼠的黑色素指數(shù)為3.34，暴露于UVB 15 天后，UVB 處理組的小鼠黑色素指數(shù)增至5.04。在熊果苷以及0.2%、0.5%、1%的松茸提取物處理40 天后，黑色素指數(shù)分別降至4.585和4.615、3.67、3.04（見圖3A）。并且1% 濃度的松茸提取物對(duì)色素沉著過度的修復(fù)功效優(yōu)于熊果苷。

如圖3B 所示，空白組小鼠的酪氨酸酶含量最初為1.28ng/mL，暴露于UVB 15 天后增加到2.54 ng/mL。然而，在熊果苷、0.2%、0.5% 和1% 的松茸提取物處理40 天后，酪氨酸酶含量分別降至1.3、1.85、1.815 和1.59 ng/mL。

2.3 松茸提取物對(duì)人體皮膚具有美白作用

上述研究表明，松茸提取物可以抑制B16-F10 和小鼠皮膚中黑色素的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步確定松茸對(duì)人類皮膚色素沉著過度的美白修復(fù)功效，檢測(cè)受試者使用含有松茸提取物的面膜后，皮膚白皙程度以及光澤度改善情況。L* 值用來表征皮膚亮度，L* 值越大，代表皮膚顏色越白；ITA°值用來表征人體皮膚顏色，ITA°值越大，代表皮膚顏色越淺。如圖4A 所示，隨著松茸提取物的處理時(shí)間的增加，L*/ITA°值也隨之增加。除此之外，皮膚的光澤度也隨著松茸提取物的使用時(shí)間增加而增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明松茸提取物能夠起到提亮膚色美白的效果。

2.4 GO 和KEGG 通路分析

通過分析不同組間的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出了3631 個(gè)差異表達(dá)基因（DEG），其中1876 個(gè)基因上調(diào)，1755 個(gè)基因下調(diào)（見圖5A）。通過更嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)（|logFC|>2，P <0. 05），篩選出841 個(gè)差異表達(dá)基因（包括144 個(gè)上調(diào)基因和697 個(gè)下調(diào)基因） 進(jìn)行后續(xù)的通路富集分析。

GO 術(shù)語(yǔ)富集分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的DEG 在14 個(gè)GOBP、8 個(gè)GO-MF 和10 個(gè)GO-CC 中顯著富集，對(duì)細(xì)胞質(zhì)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、相同蛋白結(jié)合、鎂離子結(jié)合、凋亡過程和碳水化合物代謝過程的正調(diào)控；下調(diào)的DEG 在92 個(gè)GO-BP、49 個(gè)GO-MF 和44 個(gè)GO-CC 中顯著富集，對(duì)PML 體、染色體、著絲粒區(qū)、泛素蛋白連接酶結(jié)合、RNA聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)呈正向調(diào)控。差異表達(dá)基因顯著富集的KEGG 通路數(shù)據(jù)的結(jié)果也如圖5C 所示。上調(diào)的基因顯著富集了2 條與色素沉著相關(guān)的KEGG 通路，包括P13/Akt 信號(hào)通路和MAPK 信號(hào)通路。

2.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

將松茸處理后得到的差異蛋白列表導(dǎo)入Cytoscape軟件中，以構(gòu)建分析其蛋白在生物系統(tǒng)中的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。在分析松茸處理的靶向互作網(wǎng)絡(luò)中有841 個(gè)蛋白質(zhì)映射到模型網(wǎng)絡(luò)中的78 個(gè)節(jié)點(diǎn)（見圖6A） 以及拓?fù)浞治觯ㄒ妶D6B） 后發(fā)現(xiàn)，Ndufs6、Ndufs5、Rpl4、RplB、Rps5、Rps3、Rps18、Rps11、Rps9、Rps14、Psmb7、Psmb2、Psmb4 和Psmb6 可以作為重要的交互基因參與黑色素以及酪氨酸酶活性的調(diào)控過程。

03討論

松茸作為一種非常重要的食用菌，1000 多年來一直在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。最近的一項(xiàng)研究表明，肉桂酸甲酯是松茸的重要成分之一，可抑制小鼠B16-F10 黑色素瘤細(xì)胞中的酶促反應(yīng)和黑色素的生成，表明肉桂酸甲酯可能作為一種新的黑色素生成抑制劑[22]。然而，這項(xiàng)研究?jī)H使用黑色素瘤細(xì)胞來評(píng)估肉桂酸甲酯對(duì)黑色素生成的影響，研究并不全面。此外，肉桂酸甲酯與熊果苷和曲酸具有相同的安全問題。因此，該項(xiàng)研究通過分析松茸這類藥用植物資源，探究植物提取物對(duì)皮膚色素沉著抑制的功效。

酪氨酸酶是黑色素生物合成的限速酶，在調(diào)節(jié)黑色素生成，酪氨酸酶在黑色素生成中發(fā)揮重要作用[23]。之前研究表明Phytoclear-EL1 大戟種子提取物，能夠降低B16-F10 黑色素瘤細(xì)胞的黑色素含量和酪氨酸酶活性[24]。當(dāng)歸提取物以劑量依賴的方式顯著降低了B16-F10 中的黑色素含量和酪氨酸酶活性，可能也是一種潛在的抗色素沉著劑[25]。因此在本實(shí)驗(yàn)中，我們也選擇B16-F10 細(xì)胞檢測(cè)了松茸提取物黑色素含量和酪氨酸酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)松茸提取物顯著抑制B16-F10 細(xì)胞中黑色素的形成。此外，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)松茸提取物以比熊果苷更好的劑量依賴性方式抑制B16-F10 細(xì)胞中的酪氨酸酶活性。總之，松茸提取物可以通過抑制B16-F10 細(xì)胞中的酪氨酸酶活性來抑制黑色素的形成，并且可以作為改善色素沉著的重要自然植物資源。

隨后通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，評(píng)估松茸提取物是否能夠抑制暴露于UVB 后的動(dòng)物皮膚色素沉著。紫外線是影響皮膚黑色素類型和數(shù)量的主要外在因素。UVB 照射角質(zhì)形成細(xì)胞增加了POMC（α-MSH 前體） 的表達(dá)和受體MC1-R 的表達(dá)，導(dǎo)致形成α-MSH、黑色素合成酶和其他信號(hào)因子表達(dá)的激活[26，27]。通過暴露于UVB 后的小鼠構(gòu)建了動(dòng)物皮膚的色素沉著模型，我們發(fā)現(xiàn)松茸提取物能夠抑制黑色素的形成并改善動(dòng)物皮膚的過度色素沉著。隨后人體皮膚實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用含有松茸提取物的產(chǎn)品后4 周發(fā)現(xiàn)，松茸對(duì)人體皮膚美白具有顯著效果。以上結(jié)果表明松茸提取物能夠改善小鼠皮膚和人類皮膚的色素沉著。

為了確定調(diào)控黑色素生成的關(guān)鍵基因和調(diào)控途徑并闡明松茸調(diào)控的分子機(jī)制，我們使用RNA 測(cè)序來分析完整的轉(zhuǎn)錄組。RNA 測(cè)序分析表明，松茸提取物可以影響色素沉著調(diào)控相關(guān)通路，主要作用于P13K/Akt 信號(hào)通路和MAPK 信號(hào)通路。MITF 的表達(dá)受cAMP 調(diào)節(jié)，cAMP 抑制PI3K 并刺激GSK-β 活性[28]。此外，GSK-β 刺激MITF磷酸化，增強(qiáng)了色素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活和黑色素的合成[29，30]。在環(huán)己酰亞胺存在的情況下，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK） 激酶抑制MITF 的表達(dá)，從而使細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）/MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)參與MITF 的降解。在該調(diào)控途徑中，配體- 受體相互作用激活Ras 蛋白，從而進(jìn)一步激活B-Raf 激酶和ERK1/2。MAPK 能夠磷酸化MITF 蛋白，導(dǎo)致MITF 的泛素化和降解，黑色素生成相關(guān)基因的表達(dá)降低[31]。此外，PPI 結(jié)果表明，松茸提取物可能通過黑色素細(xì)胞的增殖和凋亡來調(diào)節(jié)色素沉著。

綜上所述，通過體外B16-F10 細(xì)胞培養(yǎng)、UVB 誘導(dǎo)的小鼠皮膚色素沉著，以及人類皮膚中的皮膚美白效果發(fā)現(xiàn)，松茸提取物具有調(diào)控色素沉著、酪氨酸酶活性方面的功效。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)松茸提取物可以通過調(diào)節(jié)P13K/Akt 信號(hào)通路和MAPK 信號(hào)通路來改善色素沉著過度，并與黑色素生成以及黑色素瘤的增殖和凋亡有關(guān)。