張赫 關(guān)昕 祁可香 尤夢(mèng)瑤 鄭春英

摘要：采用HPLC法，以反式肉桂酸為對(duì)照，分析內(nèi)生真菌GRE4的活性成分；采用瓊脂糖擴(kuò)散法，對(duì)內(nèi)生真菌GRE4進(jìn)行抑菌活性分析，并采用單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)對(duì)內(nèi)生真菌GRE4的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化；采用形態(tài)學(xué)觀察及ITS序列分析法，對(duì)內(nèi)生真菌GRE4進(jìn)行初步菌種鑒定。結(jié)果表明，在內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液中含有反式肉桂酸；抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)生真菌對(duì)10種致病菌均有較好的抑制作用，尤其對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果較顯著；優(yōu)化后得到GRE4的最佳發(fā)酵工藝條件：培養(yǎng)基碳源為質(zhì)量濃度2.0%的葡萄糖，氮源為質(zhì)量濃度1.5%的蛋白胨，初始pH值為7.0，裝液量為50%（體積比），種子液接種量為5%（體積比），空氣浴振蕩器儀器參數(shù)為140 r/min、28 ℃培養(yǎng)9 d。經(jīng)鑒定，內(nèi)生真菌GRE4為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。上述研究說明內(nèi)生真菌GRE4為反式肉桂酸產(chǎn)生菌。

關(guān)鍵詞：反式肉桂酸；內(nèi)生真菌；抑菌活性；發(fā)酵條件；鑒定

中圖分類號(hào)：TS201.2? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1000-9973（2023）07-0025-07

Abstract： The active components of endophytic fungus GRE4 are analyzed by HPLC method with trans-cinnamic acid as the control. The agarose diffusion method is used to analyze the antibacterial activities of endophytic fungus GRE4 and the fermentation conditions of endophytic fungus GRE4 are optimized by single factor experiment and orthogonal experiment. Morphological observation and ITS sequence analysis method are used to preliminarily identify the endophytic fungus GRE4. The results show that there is trans-cinnamic acid in the endophytic fungus GRE4 fermentation broth.The antibacterial activity results show that endophytic fungus has good antibacterial effects on 10 pathogenic bacteria， especially on Pseudomonas aeruginosa. After optimization， the optimum fermentation process conditions of GRE4 are determined as follows： the carbon source of the culture medium is glucose with the mass concentration of 2.0%， and the nitrogen source is peptone with the mass concentration of 1.5%， the initial pH value is 7.0， the liquid volume is 50%（volume ratio）， the inoculation amount of seed liquid is 5% （volume ratio）， the instrument parameters of air bath oscillator are 140 r/min， 28 ℃ and the incubation time of 9 d. Through identification， endophytic fungus GRE4 is Aspergillus versicolor. The results indicate that endophytic fungus GRE4 is a trans-cinnamic acid-producing fungus.

Key words： trans-cinnamic acid； endophytic fungus； antibacterial activity； fermentation condition； identification

反式肉桂酸（見圖1）是一種重要的有機(jī)酸[1]，具有抑菌[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]等活性，安全、無毒，既可用于配制香辛料，也可作為水果防腐保鮮劑[5]，既是重要的有機(jī)合成工業(yè)中間體，用以合成人體自身不能合成的必需氨基酸——L-苯丙氨酸[6]?，F(xiàn)在反式肉桂酸的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)合成[7]，但反式肉桂酸在合成過程中存在工藝流程長(zhǎng)、反應(yīng)條件苛刻等問題[8]。從植物中提取反式肉桂酸存在得率低、浪費(fèi)植物資源等問題[9]。

植物內(nèi)生菌是一類寄生在植物組織中，并且不會(huì)導(dǎo)致宿主植物發(fā)生病變的微生物[10]。植物內(nèi)生菌作為重要的微生物資源[11]，具有能夠產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)[12]。從植物內(nèi)生菌所產(chǎn)生的次生代謝物中篩選出天然活性物質(zhì)，并利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)其次生代謝產(chǎn)物[13]，可節(jié)省資源[14]，并應(yīng)用于醫(yī)藥、食品以及調(diào)味品生產(chǎn)中，這對(duì)生產(chǎn)新型功能性調(diào)味品具有重要意義。

甘草是一種常見的甜味劑[15]，其主要甜味成分是甘草甜素，具有抗病毒、抗氧化、解毒以及免疫調(diào)節(jié)等多種活性作用[16]。甘草常作為功能性調(diào)味品應(yīng)用于食品加工中。而甘草內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與甘草相同或相似的次生代謝產(chǎn)物[17]，并具有較好的生物活性。因此，采用微生物發(fā)酵法，從甘草植物體內(nèi)分離出的內(nèi)生菌中尋找能夠產(chǎn)生作為調(diào)味品及香料成分的內(nèi)生菌[18]，通過發(fā)酵生產(chǎn)其目的次生代謝產(chǎn)物[19]已成為當(dāng)前調(diào)味品生產(chǎn)的發(fā)展方向。

本文以內(nèi)生真菌GRE4為研究對(duì)象，以反式肉桂酸為指標(biāo)，對(duì)GRE4發(fā)酵后獲得的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，同時(shí)進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，分析其抑菌活性，對(duì)GRE4發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)GRE4進(jìn)行菌種鑒定，確定其種屬關(guān)系，以期為采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)反式肉桂酸原料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：GRE4分離自甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）根部（野生健康烏拉爾甘草，采集自黑龍江省大慶地區(qū)）；參閱文獻(xiàn)[20-21]配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）及馬鈴薯液體培養(yǎng)（PDB）；通用引物ITS1、ITS4（參閱文獻(xiàn)[22]，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成）；枯草芽孢桿菌等11株用于抑菌活性實(shí)驗(yàn)的受試菌（購(gòu)于黑龍江省微生物研究所）；HPLC分析所用試劑為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-C型空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；DL-CJ-ZN醫(yī)用型潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-100DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FL2200型高效液相色譜儀、FL2200型紫外檢測(cè)器 溫嶺市福立分析儀器有限公司；Venusil XBP-C 18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） Agela Technologies Inc.。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液的制備

參閱文獻(xiàn)[23]，在無菌條件下，向適量無菌水中加入已活化的內(nèi)生真菌GRE4，制備成 1×107 CFU/mL的種子液；再以5%（體積比）的接種量，于50 mL PDA培養(yǎng)基中接種制備好的GRE4種子液，并將其置于空氣浴振蕩器中培養(yǎng)9 d（空氣浴振蕩器儀器參數(shù)：28 ℃，140 r/min）后，濾除菌絲體，取發(fā)酵液備用。

1.3.2 甘草內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液次生代謝產(chǎn)物分析

參閱文獻(xiàn)[24]，采用HPLC法。流動(dòng)相：乙腈∶水∶冰醋酸為30∶70∶0.1%；柱溫為25 ℃；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.2.1 供試品溶液的制備

取100 mL“1.3.1”中的發(fā)酵液，采用乙醚萃取2次（2×100 mL），合并萃取液，回收萃取液（50 ℃，0.1 MPa）后，殘?jiān)? mL色譜級(jí)甲醇，超聲使殘?jiān)咳芙?，并?.22 μm微孔濾膜過濾后，作為供試品溶液，備用。

1.3.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取0.5 mg反式肉桂酸對(duì)照品，精密稱定，加1 mL色譜級(jí)甲醇使其溶解，作為對(duì)照品溶液，備用。

1.3.2.3 空白對(duì)照品溶液的制備

方法同“1.3.2.1”，取100 mL PDB培養(yǎng)基，制成空白對(duì)照品溶液，備用。

1.3.2.4 樣品分析

分別取10 μL“1.3.2.1”、“1.3.2.2”和“1.3.2.3”中的供試品溶液、對(duì)照品溶液及空白對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。

1.3.3 甘草內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性的測(cè)定

取500 mL“1.3.1”中的發(fā)酵液，將發(fā)酵液進(jìn)行凍干處理，稱取所得凍干粉適量，將適量甲醇加入至稱好的凍干粉中，使其溶解，制成濃度為0.1 mg/mL的甲醇提取物作為抑菌活性測(cè)定供試品；陽(yáng)性對(duì)照品為鏈霉素和制霉素（質(zhì)量濃度均為100 μg/mL）；選取甲醇溶液為空白對(duì)照，參閱文獻(xiàn)[25]，采用瓊脂糖法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

1.3.4 甘草內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵條件篩選

1.3.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

a.甘草內(nèi)生真菌GRE4接種量對(duì)其抑菌活性的影響

取“1.3.1”中制備的種子液，分別按不同的接種量3%、4%、5%、6%、7%、8%（體積比）接種到PDB培養(yǎng)基（50 mL，初始pH為7.0）中，置于空氣浴振蕩器（儀器參數(shù)：28 ℃，140 r/min）中，發(fā)酵培養(yǎng)9 d后，取出，采用“1.3.3”方法測(cè)定內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液對(duì)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的抑菌活性（n=3）。

b.培養(yǎng)基裝液量對(duì)甘草內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性的影響

取“1.3.1”中制備的種子液，以5%（體積比）的接種量，將種子液分別接種到含有不同裝液量的PDB培養(yǎng)基中，裝液量依次為20，30，40，50，60，70 mL，初始pH為7.0，發(fā)酵培養(yǎng)9 d后，取出，其他操作同“1.3.4.1”中a。

c.培養(yǎng)基初始pH值對(duì)甘草內(nèi)生真菌抑菌活性的影響

取“1.3.1”中制備的種子液，以5%（體積比）的接種量，將種子液分別接種到不同初始pH值的PDB培養(yǎng)基（50 mL，初始pH值依次為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）中，發(fā)酵培養(yǎng)9 d后，取出，其他操作同“1.3.4.1”中a。

d.甘草內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵時(shí)間對(duì)其抑菌活性的影響

取“1.3.1”中制備的種子液，以5%（體積比）的接種量，將種子液接種到PDB培養(yǎng)基（50 mL，初始pH為7.0）中，置于空氣浴振蕩器（儀器參數(shù)：28 ℃，140 r/min）中，發(fā)酵培養(yǎng)5，7，9，11，13，15 d，其他操作同“1.3.4.1”中a。

e.儀器參數(shù)對(duì)甘草內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性的影響

取“1.3.1”中制備的種子液，以5%（體積比）的接種量，將種子液接種到PDB培養(yǎng)基（50 mL，初始pH為7.0）中，置于空氣浴振蕩器中，空氣浴振蕩器轉(zhuǎn)數(shù)分別設(shè)定為100，120，140，160，180，200 r/min；溫度分別設(shè)定為22，24，26，28，30，32 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)9 d后，取出，其他操作同“1.3.4.1”中a。

f.培養(yǎng)基碳源及其質(zhì)量濃度對(duì)甘草內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性的影響

分別選用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖為培養(yǎng)基中的碳源、以0%、1%、2%、3%、4%、5%（質(zhì)量和體積比）的質(zhì)量濃度制備“1.1”中的PDB培養(yǎng)基，并以5%（體積比）的接種量，將“1.3.1”中制備的種子液接種到初始pH為7.0的培養(yǎng)基（50 mL）中，置于空氣浴振蕩器（儀器參數(shù)：28 ℃，140 r/min）中，發(fā)酵培養(yǎng)9 d，取出，其他操作同“1.3.4.1”中a。觀察并分析不同碳源在不同質(zhì)量濃度下對(duì)內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性的影響（n=3）。

g.培養(yǎng)基氮源及其質(zhì)量濃度對(duì)甘草內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性的影響

分別選用牛肉膏、酵母膏、蛋白胨為培養(yǎng)基中的氮源，以0%、0.5%、1%、1.5%、2%（質(zhì)量和體積比）的質(zhì)量濃度制備“1.1”中的PDB培養(yǎng)基，同“1.3.4.1”中f的其他條件，發(fā)酵培養(yǎng)9 d后，取出。觀察并分析不同氮源在不同質(zhì)量濃度下對(duì)內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性的影響（n=3）。

1.3.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

基于“1.3.4.1”單因素實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果，分別選取碳源濃度、氮源濃度、初始pH值和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素，采用L 9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)發(fā)酵條件，見表1。

1.3.5 甘草內(nèi)生真菌GRE4的鑒定

參閱文獻(xiàn)[26]，采用顯微觀察法觀察 GRE4菌落形態(tài)；同時(shí)，采用扦片法觀察GRE4的孢子形態(tài)，初步確定菌株的分類地位[27]。

ITS序列分析：參閱文獻(xiàn)[28]對(duì)內(nèi)生真菌GRE4菌株的DNA進(jìn)行提取，對(duì)PCR所獲得的產(chǎn)物進(jìn)行純化，委托生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)所獲得的純化后的PCR產(chǎn)物完成測(cè)序工作。將測(cè)序所得到的序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)Blast檢索分析，選取同源性較高的序列進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，利用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過分析系統(tǒng)發(fā)育樹，明確內(nèi)生真菌GRE4的種屬關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液活性成分分析結(jié)果

以反式肉桂酸作為對(duì)照，采用HPLC法對(duì)內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液活性成分進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在保留時(shí)間9.80 min時(shí)，內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液及反式肉桂酸對(duì)照品均出現(xiàn)相同的色譜峰，而空白對(duì)照品（PDB培養(yǎng)基）在該保留時(shí)間無相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，說明內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液中含有反式肉桂酸，內(nèi)生真菌GRE4為反式肉桂酸產(chǎn)生菌。

2.2 甘草內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性測(cè)定結(jié)果

采用瓊脂糖法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，GRE4發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定結(jié)果見表2。

由表2可知，內(nèi)生真菌GRE4對(duì)10株致病細(xì)菌均能夠產(chǎn)生一定的抑制作用，其中對(duì)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的抑制作用最強(qiáng)。

2.3 內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵條件優(yōu)化篩選結(jié)果

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1.1 甘草內(nèi)生真菌GRE4接種量對(duì)其抑菌活性的影響結(jié)果

內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液在不同接種量條件下的抑菌活性結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)內(nèi)生真菌GRE4接種量為5%時(shí)，其抑菌活性最強(qiáng)；當(dāng)接種量＞5%時(shí)，單位容積培養(yǎng)基內(nèi)菌株密度增加，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)空間過少，從而不利于菌株的正常生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而使抑菌活性產(chǎn)物的合成減少。

2.3.1.2 培養(yǎng)基裝液量對(duì)甘草內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性的影響結(jié)果

在不同培養(yǎng)基裝液量條件下，內(nèi)生真菌GRE4的抑菌活性結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著裝液量的增加，GRE4的抑菌活性出現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，當(dāng)裝液量為50%（體積比）時(shí)，GRE4的抑菌活性最強(qiáng)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是過度增加裝液量，在抑菌活性產(chǎn)物總量不變或變化程度比裝液量變化程度小時(shí)，導(dǎo)致單位體積內(nèi)抑菌活性產(chǎn)物變少，使其濃度被稀釋，從而導(dǎo)致抑菌活性的強(qiáng)度減弱。

2.3.1.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)甘草內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性的影響結(jié)果

在不同培養(yǎng)基初始pH值條件下，內(nèi)生真菌GRE4的抑菌活性結(jié)果見圖5。

由圖5可知，培養(yǎng)基初始pH值對(duì)GRE4的抑菌活性具有一定的影響，當(dāng)發(fā)酵液初始pH值≤7.0時(shí)，隨著pH的逐漸提高，GRE4的抑菌活性逐漸增強(qiáng)；當(dāng)初始pH值控制為7.0時(shí)，GRE4發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng)值，其抑菌圈直徑可達(dá)（24.71±0.24） mm。當(dāng)發(fā)酵液初始pH值>7.0時(shí)，隨著pH的逐漸提高，GRE4的抑菌活性逐漸被抑制并出現(xiàn)減弱的趨勢(shì)。由此可見，GRE4發(fā)酵液最適初始pH為7.0。

2.3.1.4 甘草內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵時(shí)間對(duì)其抑菌活性的影響結(jié)果

不同發(fā)酵時(shí)間下，內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液的抑菌活性結(jié)果見圖6。

由圖6可知，在不同發(fā)酵時(shí)間下，GRE4的抑菌活性不同。具體表現(xiàn)為隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，抑菌活性呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為9 d時(shí)，內(nèi)生真菌GRE4的抑菌活性最強(qiáng)，此后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑菌活性出現(xiàn)逐漸減弱的趨勢(shì)。這可能是由于GRE4菌株在不同生長(zhǎng)期，其次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量及種類有所不同。

2.3.1.5 儀器參數(shù)對(duì)甘草內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性的影響結(jié)果

設(shè)置不同的空氣浴振蕩器儀器參數(shù)，觀察內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液的抑菌活性，結(jié)果見圖7和圖8。

由圖7和圖8可知，選擇空氣浴振蕩器轉(zhuǎn)速及溫度兩個(gè)參數(shù)，觀察其對(duì)內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液抑菌活性的作用。結(jié)果表明，儀器參數(shù)不同，GRE4抑菌活性不同。當(dāng)設(shè)置空氣浴振蕩器轉(zhuǎn)速為140 r/min、溫度為28 ℃時(shí)，其抑菌活性最強(qiáng)。

2.3.1.6 培養(yǎng)基碳源及其質(zhì)量濃度對(duì)甘草內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性的影響結(jié)果

在培養(yǎng)基碳源種類不同及其質(zhì)量濃度不同的條件下，甘草內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液的抑菌活性測(cè)定結(jié)果見圖9。

由圖9可知，培養(yǎng)基碳源及其質(zhì)量濃度對(duì)內(nèi)生真菌GRE4的抑菌活性有較大的影響，當(dāng)2%葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源時(shí)，內(nèi)在真菌GRE4菌株的抑菌活性最強(qiáng)。

2.3.1.7 培養(yǎng)基氮源及其質(zhì)量濃度對(duì)甘草內(nèi)生真菌GRE4抑菌活性的影響結(jié)果

在培養(yǎng)基氮源種類不同及其質(zhì)量濃度不同的條件下，內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液的抑菌活性結(jié)果見圖10。

由圖10可知，培養(yǎng)基氮源的選擇及質(zhì)量濃度對(duì)內(nèi)生真菌GRE4的抑菌活性有一定的影響，當(dāng)1%蛋白胨作為氮源時(shí)，內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng)。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

結(jié)合表3和表4可知，能夠?qū)RE4的抑菌活性起到影響作用的因素順序?yàn)樘荚促|(zhì)量濃度>氮源質(zhì)量濃度>初始pH值>發(fā)酵時(shí)間。對(duì)GRE4抑菌活性產(chǎn)生影響的因素如下：碳源及其質(zhì)量濃度的影響極顯著；氮源及其質(zhì)量濃度的影響顯著；培養(yǎng)基初始pH值的影響顯著；GRE4發(fā)酵時(shí)間無顯著影響。由此可知，GRE4的最優(yōu)發(fā)酵條件為A 2B 3C 2D 2，即選擇質(zhì)量濃度3%的葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源，選擇質(zhì)量濃度1.5%的蛋白胨作為培養(yǎng)基氮源，培養(yǎng)基初始pH值7.0，發(fā)酵培養(yǎng)9 d。綜合單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)及方差分析的結(jié)果，確定GRE4的最佳發(fā)酵條件：質(zhì)量濃度為3%的葡萄糖，質(zhì)量濃度為1.5%的蛋白胨，裝液量為50%（體積比），接種量為5%（體積比），初始pH值為7.0，培養(yǎng)時(shí)間為9 d，空氣浴振蕩器轉(zhuǎn)速為140 r/min，發(fā)酵溫度為28 ℃。

分別采用最佳發(fā)酵條件及“1.3.1”項(xiàng)發(fā)酵條件對(duì)內(nèi)生真菌GRE4進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取兩種不同發(fā)酵條件培養(yǎng)后的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，抑菌結(jié)果表明，在最佳發(fā)酵工藝條件下，內(nèi)生真菌GRE4的抑菌圈直徑為（22.3±0.22） mm，比未進(jìn)行優(yōu)化的發(fā)酵條件的抑菌圈直徑提高1.30 mm。上述結(jié)果驗(yàn)證了最佳發(fā)酵條件的合理性。

2.4 內(nèi)生真菌GRE4的鑒定結(jié)果

2.4.1 內(nèi)生真菌GRE4形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

在PDA 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，甘草內(nèi)生真菌GRE4的菌落直徑為（13.00±0.30） mm左右。菌落呈現(xiàn)白色，漸變?yōu)榛揖G色，基質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色。菌落為緊密圓形，絨毛狀，顏色有數(shù)環(huán)，從灰綠到青綠，菌落邊緣整齊，緊貼培養(yǎng)基，見圖11中a。GRE4產(chǎn)分生孢子，分生孢子頭的頂囊近似球形，呈放射狀排列。GRE4的孢子形態(tài)見圖11中b。

2.4.2 內(nèi)生真菌GRE4 ITS序列分析結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，從甘草內(nèi)生真菌GRE4基因組DNA獲得1條長(zhǎng)度為500 bp的特異性條帶，將獲得的ITS序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)GenBank分析后，運(yùn)用MEGA 7分析與內(nèi)生真菌GRE4序列同源性較高的菌株序列，建立內(nèi)生真菌GRE4的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖12）。內(nèi)生真菌 GRE4 序列（菌種登錄號(hào)：OP614981）與曲霉屬雜色曲霉（Aspergillus versicolor，JN545818.1）的相似性達(dá)到了100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果將甘草內(nèi)生真菌GRE4菌株鑒定為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。

3 結(jié)論

從甘草內(nèi)生真菌中篩選得到一株反式肉桂酸的產(chǎn)生菌GRE4，GRE4的抑菌活性作用較強(qiáng)，為充分利用其生物活性，對(duì)其發(fā)酵工藝條件進(jìn)行篩選，最終得出內(nèi)生真菌GRE4的最佳發(fā)酵條件：培養(yǎng)基選擇質(zhì)量濃度3.0%的葡萄糖作為碳源，質(zhì)量濃度1.5%的蛋白胨作為氮源，初始pH值為7.0，裝液量為50%（體積比），接種量為5%（體積比），培養(yǎng)時(shí)間為9 d，空氣浴振蕩器儀器參數(shù)設(shè)置為轉(zhuǎn)速140 r/min、溫度28 ℃。該條件下，GRE4抑菌圈直徑比未優(yōu)化前提高了1.30 mm；經(jīng)鑒定，內(nèi)生真菌GRE4為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。雜色曲霉能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物[29]，如喹諾酮類化合物[30]、萜類化合物[31]和哌嗪二酮類化合物[32]等，并具有抗菌[33]、抗氧化[34]和抗病毒[35]等多種生物活性，是有開發(fā)應(yīng)用潛力的工業(yè)菌株[36]。上述結(jié)果為采用內(nèi)生真菌GRE4發(fā)酵液生產(chǎn)反式肉桂酸原料提供了參考，為反式肉桂酸的生產(chǎn)開發(fā)提供了新途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1]KANG N H， MUKHERJEE S， YUN J W. Trans-cinnamic acid stimulates white fat browning and activates brown adipocytes[J].Nutrients，2019，11（3）：577.

[2]HAZIR S， SHAPIRO-ILAN D I， BOCK C H， et al. Trans-cinnamic acid and Xenorhabdus szentirmaii metabolites synergize the potency of some commercial fungicides[J].Journal of Invertebrate Pathology，2017，145：1-8.

[3]HSEU Y C， KORIVI M， LIN F Y， et al. Trans-cinnamic acid attenuates UVA-induced photoaging through inhibition of AP-1 activation and induction of Nrf2-mediated antioxidant genes in human skin fibroblasts[J].Journal of Dermatological Science，2018，90（2）：123-134.

[4]SOSTHENE N K， AYESHA J. Multicomponent crystals of p-coumaric acid and trans-ferulic acid：structures and physicochemical properties[J].Journal of Molecular Structure，2021，1244：377-386.

[5]朱燕莉，王正莉，王衛(wèi)，等.天然食品防腐劑的抑菌機(jī)理研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品，2021，46（9）：176-180.

[6]李艷軍，劉飛，于韋，等.反式肉桂酸轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（3）：103-107.

[7]LI Z J， CAI L， MEI R F， et al. A highly efficient transformation of cis- to trans-cinnamic acid derivatives by iodine[J].Tetrahedron Letters，2015，56（52）：7197-7200.

[8]何小英，許東穎，廖正福，等.天然肉桂油深加工研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品，2015，40（10）：120-124.

[9]郭勝男，盧金清，蔡君龍，等.HS-SPME-GC-MS聯(lián)用分析不同產(chǎn)地肉桂揮發(fā)性成分[J].中國(guó)調(diào)味品，2014，39（12）：113-117，128.

[10]TRICHUR S S. The need to study the holobiome for gainful uses of endophytes[J].Fungal Biology Reviews，2020，34（3）：144-150.

[11]尤夢(mèng)瑤，萬璐，閆佳佳，等.甘草內(nèi)生菌研究概況[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2022，38（26）：20-26.

[12]崔瑩瑩，李明燕，翟興偉，等.微生物發(fā)酵法制備鮮辣沙蟹汁工藝研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2022，47（3）：140-145.

[13]CALVILLO ， PELLICER T， CARNICER M， et al. Bioprocess strategies for vitamin B 12 production by microbial fermentation and its market applications[J].Bioengineering（Basel），2022，9（8）：365.

[14]THUAN N H， TATIPAMULA V B， CANH N X， et al. Recent advances in microbial co-culture for production of value-added compounds[J].Biotechnology，2022，12（5）：115.

[15]LI X J Y， SUN R， LIU R P. Natural products in licorice for the therapy of liver diseases：progress and future opportunities[J].Pharmacological Research，2019，144：210-226.

[16]施豐成，梁佳欣，劉遠(yuǎn)上，等.反應(yīng)時(shí)間對(duì)以甘草為原料制備香料揮發(fā)性成分的影響[J].中國(guó)調(diào)味品，2022，47（10）：79-85.

[17]曼瓊，楊志軍，鄧毅，等.甘草內(nèi)生菌的鑒定與藥理作用和活性成分研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2018，34（9）：1125-1128.

[18]陳靜，許貞，張雪，等.不同產(chǎn)地甘草內(nèi)生真菌多樣性及分離條件研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2019，54（2）：373-379.

[19]楊志軍，鄧毅，曼瓊，等.甘草內(nèi)生菌代謝物的抗炎作用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2018，35（5）：633-637.

[20]BRADER G， COMPANT S， MITTER B， et al.Metabolic potential of endophytic bacteria[J].Current Opinion in Biotechnology，2014，27：30-37.

[21]高娟娟，賈麗艷，田宇敏，等.枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)抗生素耐受性的研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2019，44（3）：31-35，41.

[22]鄭雪，徐慧超，李偉，等.東北膜莢黃芪內(nèi)生真菌的分離及其活性代謝物分析[J].中國(guó)新藥雜志，2017，26（12）：1376-1381.

[23]許哲祥，劉玉潔，劉松梅，等.基于木脂素生物合成的內(nèi)生菌發(fā)酵五味子研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2020，45（4）：34-37.

[24]張赫，尤夢(mèng)瑤，萬璐，等.產(chǎn)紫丁香苷內(nèi)生真菌CJ7的鑒定及發(fā)酵條件研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2022，38（25）：143-150.

[25]孫會(huì)剛，陳志軒，卞路遙，等.牛蒡和苔干復(fù)配提取物的抑菌活性及其防腐保鮮作用[J].中國(guó)調(diào)味品，2022，47（4）：198-202，206.

[26]萬璐，閆佳佳，尤夢(mèng)瑤，等.產(chǎn)甘草次酸內(nèi)生真菌GRE111的鑒定及發(fā)酵條件研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2022，47（10）：41-46.

[27]STEELE P R， PIRES J C. Biodiversity assessment： state-of-the-art techniques in phylogenomics and species identification[J].American Journal of Botany，2011，98（3）：415-425.

[28]PAREEK C S， SMOCZYNSKI R， TRETYN A. Sequencing technologies and genome sequencing[J].Journal of Applied Genetics，2011，52（4）：413-435.

[29]WANG H N， YANG X H， WEI S H. Analysis of Aspergillus versicolor exudate composition[J].Journal of Basic Microbiology，2022，62（10）：1241-1253.

[30]羅寒，李曉棟，李曉明，等.紅樹林來源內(nèi)生真菌雜色曲霉Aspergillus versicolor MA-229次級(jí)代謝產(chǎn)物研究[J].中國(guó)抗生素雜志，2017，42（4）：334-340.

[31]LI H， ZHANG R， CAO F， et al．Proversilins A-E， drimane-type sesquiterpenoids from the endophytic Aspergillus versicolor[J].Journal of Natural Products，2020，83（7）：2200-2206.

[32]DING Y， ZHU X， HAO L， et al．Bioactive indolyl diketopiperazines from the marine derived endophytic Aspergillus versicolor DY180635[J].Marine Drugs，2020，18（7）：338.

[33]HU J， LI Z， GAO J， et al．New diketopiperazines from a marine-derived fungus strain Aspergillus versicolor MF180151[J].Marine Drugs，2019，17（5）：262.

[34]YANG L J， PENG X Y， ZHANG Y H， et al．Antimicrobial and antioxidant polyketides from a deep-sea-derived fungus Aspergillus versicolor SH0105[J].Marine Drugs，2020，18（12）：636.

[35]YANG F X， DAI J M， LIU H Y， et al．Isochromenes from the Nicotiana tabacum-derived endophytic fungus Aspergillus versicolor and their anti-tobacco mosaic virus activities[J].Natural Product Research，2022，22：1-9.

[36]許楚旋，王嘉琦，蔣冬花.1株產(chǎn)生洛伐他汀雜色曲霉的篩選、鑒定和發(fā)酵優(yōu)化條件[J].生物技術(shù)通報(bào)，2018，34（11）：210-215.