王月紅， 張亞偉， 吳 浩， 孟慶翔

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)肉牛研究中心，北京 100193；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太原 030031）

青貯是一種非常有效的高濕物料加工技術(shù)，可以保障草食家畜粗飼料的全年穩(wěn)定供應(yīng)（Driehuis 等，2018）。 玉米由于具有生物產(chǎn)量高、適宜種植區(qū)域廣且可發(fā)酵碳水化合物含量豐富等特點(diǎn)，具有非常良好的青貯性能，因此被廣泛地用于調(diào)制全株玉米青貯， 目前已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)反芻動(dòng)物生產(chǎn)中最常用的優(yōu)質(zhì)粗飼料來源（Khan 等，2015）。 然而，盡管較高的可溶性碳水化合物含量是全株玉米青貯調(diào)制過程中乳酸發(fā)酵模式建立的基礎(chǔ)， 但是該特性也導(dǎo)致其在青貯調(diào)制和開窖飼喂階段極易滋生腐敗型微生物，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的有氧腐敗和養(yǎng)分損失，尤其是在陰雨天氣不能及時(shí)封窖或環(huán)境溫度高的情況下（Borreani 等，2018）。 因此，在實(shí)際生產(chǎn)上，許多類型的青貯添加劑被用于全株玉米青貯調(diào)制過程， 以提高青貯品質(zhì)和和飼喂階段的有氧穩(wěn)定性（Muck 等，2018）。

常用的青貯添加劑按其功能作用可分為發(fā)酵促進(jìn)劑、發(fā)酵抑制劑、有氧腐敗抑制劑以及吸附和營養(yǎng)性添加劑四種類型， 近年來通過復(fù)配而達(dá)到多種生物學(xué)功能的復(fù)合添加劑受到了廣泛的關(guān)注和研究（Muck 等，2018）。常見的復(fù)合添加劑包括復(fù)合乳酸菌劑和復(fù)合有機(jī)酸（鹽）等，復(fù)合乳酸菌接種劑通常是將同型或兼性異型發(fā)酵乳酸菌與專性異型發(fā)酵乳酸菌組合使用， 以期同時(shí)達(dá)到促進(jìn)發(fā)酵、廣譜抑菌和提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性的目的（Silva等，2021；Benjamim Da Silva 等，2021；Zielińska 和Fabiszewska，2018；Reich 和Kung，2010）。復(fù)合有機(jī)酸（鹽）添加劑是指將多種有機(jī)酸及其鹽進(jìn)行組合應(yīng)用， 以期獲得與復(fù)合乳酸菌接種劑相似的功能。在常用的復(fù)合有機(jī)酸（鹽）中，山梨酸鉀和苯甲酸鈉的復(fù)配組合近年來受到了廣泛的關(guān)注和研究（Zhang 等，2020；Kung 等，2018；Bernardes 等，2015）。研究表明，山梨酸鉀和苯甲酸鈉的組合添加劑可以有效地降低全株玉米青貯的干物質(zhì)損失和發(fā)酵品質(zhì)，并顯著改善其有氧穩(wěn)定性（Benjamim Da Silva 和Kung，2022；Zhang 等，2020）。然而，目前鮮見比較復(fù)合乳酸菌和復(fù)合有機(jī)酸及二者同時(shí)添加對(duì)全株玉米青貯品質(zhì)影響的研究報(bào)道。

因此，本研究擬通過評(píng)價(jià)由兼性異型發(fā)酵乳酸菌（植物乳桿菌和糞腸球菌）和專性異型發(fā)酵乳酸菌（布氏乳桿菌）復(fù)配而成的復(fù)合接種劑，和以山梨酸鉀和苯甲酸鈉為活性成分的復(fù)合有機(jī)酸鹽，及二者組合添加對(duì)全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)、有氧穩(wěn)定性和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，旨在比較不同類型復(fù)合添加劑的作用效果和作用機(jī)制，并為二者在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 青貯調(diào)制與處理 玉米種植于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)肉牛研究中心合作單位的試驗(yàn)田中 （116°04′E，40°49′ N）， 待玉米植株生長至1/2 ～2/3 乳線期時(shí)， 使用牽引式玉米收割機(jī)（JAGUAR830，CLAAS KGaAmbH，Harsewinkel，德國）將整株玉米收割并切碎至理論長度19 mm， 制備成青貯原料，隨即運(yùn)送至中國農(nóng)業(yè)大學(xué)肉牛中心實(shí)驗(yàn)室。

本研究采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)， 用電子臺(tái)秤（ACS-30，東陽市英衡智能設(shè)備有限公司，浙江金華，中國）稱取12 份、每份10.00 kg 的青貯原料，分別進(jìn)行以下4 種處理（n=3）：（1） 對(duì)照組（CON組）： 不進(jìn)行任何處理；（2） 復(fù)合乳酸菌接種劑組（CLB 組）：添加0.002 g/kg 的復(fù)合乳酸菌劑（芯來旺I-HL 型，臺(tái)灣生合科技股份有限公司，臺(tái)灣高雄， 中國）， 其活性成分包括植物乳桿菌L28（≥1011cfu/g）、糞腸球菌EF08（≥109cfu/g）和布氏乳桿菌（≥109cfu/g）；（3）復(fù)合有機(jī)酸鹽組（MS 組）：添加0.1 g/kg 的復(fù)合有機(jī)酸鹽制劑（拉巴克思，薩諾科技股份有限公司，洛伊興市，德國），活性成分為苯甲酸鈉和山梨酸鉀；（4）菌酸復(fù)配組（CLBMS組）：同時(shí)進(jìn)行（2）和（3）處理。 所有添加劑均在處理前先溶解到100 mL 無菌水中， 充分混勻后再使用手持式噴霧器均勻地噴灑到已經(jīng)稱重好的玉米青貯原料上，對(duì)照組僅噴灑100 mL 無菌水。 將添加劑與原料充分混勻后， 裝入青貯專用塑封袋（95 cm×55 cm）中，抽真空并密封，室溫（18 ～28 ℃）貯藏42 d。 抽真空后和開袋前對(duì)青貯袋進(jìn)行稱重并記錄，以計(jì)算干物質(zhì)損失。

1.2 常規(guī)成分和發(fā)酵品質(zhì)分析 袋裝青貯開封后，將玉米青貯在潔凈的容器中充分混勻。 隨后，每個(gè)青貯袋分別采集30 g 玉米青貯樣品，一式2份共24 份青貯樣品。 將每份樣品分別同270 mL無菌水混合，后使用勻漿機(jī)（MJ-WBL2521H，美的集團(tuán)股份有限公司，佛山，中國）勻漿1 min，再分別經(jīng)四層紗布、 定性濾紙和0.45 μm 濾器過濾后收集濾液，用于發(fā)酵品質(zhì)分析。其中，pH 使用玻璃電極pH 計(jì)（PHS-3C，上海雷磁科學(xué)儀器有限公司，上海，中國）進(jìn)行測定；揮發(fā)性脂肪酸含量（乙酸、丙酸、丁酸等）參照Erwin 等（1961）方法，使用配有HP-INNO 毛細(xì)管柱（30 mm×0.32 mm）的氣相色譜儀（GC3420，北京分析儀器廠，北京，中國）進(jìn)行測定； 乳酸濃度使用配備InoPac AS11-HC色譜柱（4 mm×250 mm）的離子色譜儀（DIONEX-2500，Dionex 公司，桑尼維爾，美國）進(jìn)行分析，流動(dòng)相為50 mmol/L 氫氧化鈉溶液，流速0.08 mL/min，柱溫30 ℃； 氨態(tài)氮含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法（Broderick 和Kang，1980）進(jìn)行分析。

每袋裝青貯另分別采集200 g 樣品， 一式2份共24 個(gè)青貯樣品，風(fēng)干后用于干物質(zhì)（DM）、粗蛋白質(zhì)（CP）、粗脂肪（EE）、粗灰分（Ash）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADL）、酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）和酸性洗滌不溶灰分（ADIA）等常規(guī)化學(xué)成分分析，方法參照張麗英等（2016）《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》。其中，EE 采用半自動(dòng)脂肪分析儀（XT10，ANKOM 科技，馬其頓，美國）進(jìn)行測定；CP 使用快速氮素分析儀（Rapid N III，Elementar 分析系統(tǒng)有限公司，朗根塞爾博德，德國）進(jìn)行分析；DNF、ADF 和ADL 使用半自動(dòng)纖維分析儀（200i，ANCOM 科技，馬其頓，美國）進(jìn)行測定， 其中NDF 測定過程中添加了熱穩(wěn)定性α-淀粉酶以促進(jìn)消煮。

1.3 有氧穩(wěn)定性分析 每袋裝青貯另取約2.00 kg新鮮青貯樣品，一式2 份共24 份樣品，用于有氧穩(wěn)定性分析。 具體方法如下： 將樣品分別裝入雙層、四周帶有孔洞的專用塑料袋中，使用多通道數(shù)據(jù)記錄儀（SMOWO MDL-1048A，上海天賀自動(dòng)化儀表有限公司，上海，中國）每12 min 采集并記錄其幾何中心溫度，同時(shí)記錄室溫變化。有氧穩(wěn)定性參照Da Silva 等（2015）描述的方法進(jìn)行計(jì)算，定義為青貯飼料幾何中心溫度較基線溫度（室溫）高出2 ℃時(shí)所用的小時(shí)數(shù)。

1.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 每袋裝青貯另取約30 g新鮮青貯樣品， 共21 份樣品置于50 mL 無菌離心管中，-80 ℃保存用于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析。 樣品全基因組DNA 參照Ni 等（2017）的方法進(jìn)行提取，將10 g 樣品和90 mL 0.85%的無菌生理鹽水混合，在120 r/min、4 ℃條件下振蕩2 h；隨后使用4 層紗布過濾，濾液在12000 r/min、4 ℃條件下離心10 min 后棄去上清液， 沉降物使用1 mL 0.85%的無菌生理鹽水進(jìn)行重懸。 重懸溶液再次在12000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，獲取沉降物用于DNA 提取。 全基因組DNA 使用FastDNA SPIN 試劑盒 （QBioGene/MP 生物醫(yī)學(xué)有限公司，圣安娜，加利福尼亞，美國）進(jìn)行提取，DNA 的濃度和純度分別使用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（NanoDrop 科技，威明頓，美國）和1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測定。

利用PCR 技術(shù)基于515F/806R 引物對(duì)（515F：5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’，806R：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因V4 可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。 PCR 反應(yīng)使用30 μL 反應(yīng)體系，包括雙向引物各3 μMol，1×PCR預(yù)混液、DNA 模板10 ng，DNA 聚合酶（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司，伊普斯威奇，英國）1 μL，剩余體積用dd H2O 補(bǔ)足。 PCR 反應(yīng)在循環(huán)溫控儀中進(jìn)行（Bio-rad T100，赫拉克勒斯，美國），具體程序如下：98 ℃預(yù)變性30 s，隨后進(jìn)行30 個(gè)溫控循環(huán)擴(kuò)增 （98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃合成30 s），最后72 ℃延長5 min。PCR 產(chǎn)品使用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行定性定量分析， 并切取目標(biāo)長度為400 ～450 bp 的條帶使用凝膠提取試劑盒（GeneJET，賽默飛世爾科技有限公司，卡爾斯巴德，美國）進(jìn)行純化，純化后的DNA 樣品根據(jù)濃度進(jìn)行等量混合。 隨后， 使用文庫構(gòu)建試劑盒（Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns， 賽默飛世爾科技有限公司，卡爾斯巴德，美國）進(jìn)行擴(kuò)增子文庫構(gòu)建。 構(gòu)建好的擴(kuò)增子文庫采用諾禾致源有限公司（北京，中國）的Ion S5TM XL 平臺(tái)（賽默飛世爾科技有限公司，卡爾斯巴德，美國）進(jìn)行測序，獲得長度約為600 bp 的單端序列。

擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)參考本課題組已構(gòu)建好的流程基于QIIME2 平臺(tái)（Bolyen 等，2019）進(jìn)行分析。首先使用q2-cutadapt 插件中的trim-single 方法在默認(rèn)條件下將barcode 和primer 序列從單端序列中移除（Martin，2011），隨后使用q2-dada2 插件中集成的denoise-pyro 方法對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪等處理 （Callahan 等，2016）， 以獲得代表性序列（ASVs）及其頻率分布表用于下游分析，該過程設(shè)置參數(shù)為移除單端序列第400 位后的所有堿基序列。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 處理對(duì)全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的影響采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，均值采用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，顯著性水平為P＜0.05，該過程使用SAS 9.4（SAS 軟件研究所，加里，美國）中的GLM 進(jìn)程來完成。 試驗(yàn)處理對(duì)青貯有氧穩(wěn)定性和細(xì)菌群落alpha 多樣性指標(biāo)的影響使用Kruskal-Wallis 進(jìn)行非參檢驗(yàn)，組間差異采用Dunn’s 法進(jìn)行多重比較， 顯著性水平為P＜0.05； 細(xì)菌群落beta 多樣性的處理效應(yīng)采用置換多元方差分析（PERMANOVA）（Anderson，2014）進(jìn)行檢驗(yàn)，樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間的差異基于bray_curtis 距離使用主坐標(biāo)分析（PCoA）進(jìn)行計(jì)算和可視化， 該過程使用R （版本3.6.0） 語言qiime2R 軟件包（版本0.99.20）來完成。

細(xì)菌的生物學(xué)分類信息在門和屬水平上進(jìn)行分析， 定義相對(duì)豐度在至少1 個(gè)樣本中大于0.01%的菌群是可鑒定的，相對(duì)豐度大于0.01%且在至少50%以上的樣品中存在的菌群是可檢測的，僅后者用于組間差異分析。顯著差異菌群使用線性判別分析效應(yīng)尺寸法（LEfSe）進(jìn)行篩選，顯著性水平為P＜0.05 且LDA Score ＞2。 另外，采用韋恩圖法在物種水平上對(duì)各組間共有或特有的菌群進(jìn)行計(jì)算和總結(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型復(fù)合添加劑處理全株玉米青貯的發(fā)酵品質(zhì) 由表1 可知，與CON 組相比，各處理對(duì)DM、DM 損失、CP、EE、Ash、ADF、ADL、ADIA 等常規(guī)養(yǎng)分和氨態(tài)氮含量均無顯著影響 （P＞0.05）。CON 組玉米青貯的pH 為3.95， 顯著高于其余三個(gè)處理組玉米青貯的pH （P＜0.05）。 MS 和CLBMS 處理組玉米青貯的乙酸濃度較CON 組和CLB 處理組有升高的趨勢（P =0.06），而前兩組的乳酸濃度和乳酸/乙酸比要顯著低于CLB 組和CON 組（P＜0.05）。 與CLB（40.07%）和CLBMS（41.54%） 處理組相比，MS 處理組玉米青貯具有更高的NDF 含量（45.07%，P＜0.05），但三個(gè)處理組與CON 組（42.85%）間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 不同類型復(fù)合青貯添加劑處理的全株玉米青貯的常規(guī)養(yǎng)分組成和發(fā)酵參數(shù)

2.2 不同類型復(fù)合添加劑處理后的全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性 由圖1 可知，CLBMS 處理組玉米青貯的有氧穩(wěn)定為66.2 h，較CLB 組的50.2 h 提高了31.9%（P＜0.05），但二者與CON 組（60.2 h）和MS處理組（65.3 h）間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 不同類型復(fù)合添加劑處理的全株玉米青貯的有氧穩(wěn)定性

2.3 不同類型復(fù)合添加劑處理后的全株玉米青貯中細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)

2.3.1 細(xì)菌群落Alpha 多樣性 擴(kuò)增子測序共產(chǎn)生696094（58007±4 574；n=12）個(gè)擴(kuò)增子序列。 經(jīng)過過濾、 降噪、 去嵌合體等質(zhì)控處理， 共產(chǎn)生201818（16818±3551；n=12）個(gè)高質(zhì)量16S rRNA 基因片段序列，單樣本序列數(shù)從11623 到23806。去重復(fù)處理后，共產(chǎn)生了651 個(gè)代表性序列，即擴(kuò)增子序列變異 （ASVs）。 所有樣本的覆蓋度度指數(shù)（Good’s coverage）均為1.000，表明本研究測序深度足以覆蓋所有全部細(xì)菌群落；該結(jié)果也可由Alpha 多樣性稀疏度曲線分析進(jìn)一步證明。 當(dāng)測序深度超過6000 后， 細(xì)菌群落香農(nóng)指數(shù)和費(fèi)氏系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)變化曲線均趨于水平，表明所有樣本測序深度足夠滿足統(tǒng)計(jì)分析所需。

Alpha 多樣性組間差異分析顯示（表2），細(xì)菌群落的香農(nóng)指數(shù)、可觀測特征序列、皮氏均勻度指數(shù)、 費(fèi)氏系統(tǒng)發(fā)育學(xué)多樣性指數(shù)和辛普森指數(shù)等在各處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.40）。 基于Bray_curtis 距離的主坐標(biāo)分析（PCoA）分析顯示（圖2）， 主坐標(biāo)1 和2 共能解釋細(xì)菌群落變異的54.93%，且CON 組細(xì)菌區(qū)系結(jié)構(gòu)與處理組明顯分離。 PERMANOVA 分析進(jìn)一步證實(shí)，試驗(yàn)處理對(duì)細(xì)菌區(qū)系結(jié)構(gòu)具有顯著影響 （P =0.01）， 且CON組與其他各組均有分離的趨勢（P＜0.10）。

圖2 不同類型復(fù)合添加劑處理的全株玉米青貯中細(xì)菌群落的主成分分析圖

表2 不同類型復(fù)合青貯添加劑處理的全株玉米青貯的細(xì)菌群落Alpha 多樣性指標(biāo)

2.3.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) 細(xì)菌分類學(xué)分析共鑒定得到9 個(gè)菌門、124 個(gè)菌屬和166 個(gè)菌種，其中5 菌門、50 菌屬和62 菌種處于可檢測水平。 在門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是含量最為豐富的5 個(gè)菌群， 約占序列總數(shù)的99.70%（圖3A）。 其中， 厚壁菌門平均約占總序列數(shù)的84.52%，是所有青貯樣品細(xì)菌群落中最具優(yōu)勢地位的菌群； 其次為變形菌門， 約占總序列數(shù)的11.88%。 在屬水平，含量最為豐富的四個(gè)菌屬為乳桿菌屬 （Lactobacillus）、 魏斯氏菌屬（Weissel-la）、片球菌屬（Pediococcus）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），四者共占序列總數(shù)的84.94%（圖3C）。 其中乳桿菌屬 （69.96%） 和魏斯氏菌屬（10.72%） 在所有處理組細(xì)菌群落中均占據(jù)優(yōu)勢地位， 而片球菌屬 （2.38%） 和鞘氨醇單胞菌屬（1.87%） 的相對(duì)豐度在各組之間具有較大的變異。 在種水平上，韋恩圖分析（Venn analysis）結(jié)果顯示，共有60 個(gè)細(xì)菌類群可在所有的處理組中得到鑒定（圖3B）。

圖3 不同類型復(fù)合添加劑處理的全株玉米青貯中細(xì)菌群落在門（A）、屬（C）和種（B）水平上的組成概況

LEfSe 分析表明，凱斯特亞菌屬（Kaistia）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、沙雷氏菌屬（Serratia）和德沃斯菌屬（Devosia）等在對(duì)照組青貯玉米細(xì)菌群落中相對(duì)豐度較高 （P＜0.05 且LDA score＞2），片球菌屬（Pediococcus）在CLB 接種青貯中含量較為豐富（P＜0.05 且LDA score＞2），而魏斯氏菌屬 （Weissella） 和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）在MS 處理組青貯玉米中含量較為豐富（P＜0.05 且LDA score＞2）（圖4）。

圖4 LEfSe 分析得到的不同處理間相對(duì)豐度具有顯著差異的菌群

3 討論

本研究所有處理組全株玉米青貯的pH 均低于4.0，42 d 干物質(zhì)損失均低于3.07%，氨態(tài)氮濃度均低于0.39 g/kg，乳酸和乙酸含量較高，且未檢測到丙酸和丁酸的存在，因此均獲得了良好的青貯效果（Kung 等，2018）。 盡管如此，各處理組發(fā)酵指標(biāo)間仍存在較為顯著的差異，說明復(fù)合添加劑處理對(duì)全株玉米青貯過程仍產(chǎn)生了較為顯著的影響。

理論上， 同型或兼性異型發(fā)酵乳酸菌在青貯早期階段的活性更高， 可使青貯飼料pH 迅速下降至較低水平，從而抑制腸桿菌、梭菌和其他微生物的活性， 降低蛋白質(zhì)降解和不良微生物發(fā)酵導(dǎo)致的DM 損失（Muck，2013）。 隨后，更為耐酸的專性異型發(fā)酵乳酸菌（如布氏乳桿菌）可將乳酸緩慢地轉(zhuǎn)化為乙酸、丙二醇和乙醇等，可能導(dǎo)致pH 略微升高， 但可顯著提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性（Borreani 等，2018）。 然而， 本試驗(yàn)結(jié)果表明，除pH 顯著降低外，CLB 處理組全株玉米青貯的乳酸、乙酸和氨態(tài)氮含量盡管在數(shù)值上有所降低，但與對(duì)照組相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明CLB 處理并不能顯著改善全株玉米青貯的發(fā)酵品質(zhì)。 同時(shí)，CLB 處理組青貯飼料的有氧穩(wěn)定性在數(shù)值上較對(duì)照組甚至有一定的下降， 這可能與其pH 下降過快導(dǎo)致發(fā)酵酸產(chǎn)量相對(duì)較低有關(guān)。 這些結(jié)果還說明， 復(fù)合乳酸菌劑中的乳酸菌尤其是布氏乳桿菌可能并未成為青貯過程中的優(yōu)勢菌群。 這一推測也被細(xì)菌群落組成分析所證實(shí)， 后者顯示在所有經(jīng)過CLB 接種的玉米青貯樣品 （CLB 組和CLBMS 組）中均未檢測到腸球菌屬以及布氏乳桿菌和植物乳桿菌的存在。 然而，有49.97%的特征序列被歸類到未分類乳桿菌屬下， 且本研究僅對(duì)42 d 青貯樣品進(jìn)行了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析， 結(jié)合CLB 處理后青貯pH 顯著下降的結(jié)果， 故目前尚不能確定添加劑中的植物乳桿菌和布氏乳桿菌是否能夠成功在青貯發(fā)酵過程中定植并成為優(yōu)勢菌群。 值得注意的是，LEfSe 分析顯示，CLB 處理組乳酸片球菌屬（Pediococcus）的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，且數(shù)值上約為對(duì)照組的2 倍。乳酸片球菌為同型發(fā)酵乳酸菌， 其發(fā)酵六碳糖幾乎專一性的產(chǎn)生乳酸而不生成二氧化碳（Vos 等，2009），具有更高的產(chǎn)乳酸效率， 有助于青貯過程中pH 的快速下降。綜合上述結(jié)果，盡管很難解釋添加不含乳酸片球菌的復(fù)合乳酸菌劑為何會(huì)增加其在全株玉米青貯中的豐度， 但含量豐富的乳酸片球菌可能是CLB 處理組乳酸和乙酸產(chǎn)量較低而pH 卻顯著下降的原因之一。

影響復(fù)合乳酸菌劑應(yīng)用效果的因素很多，如菌株類型、發(fā)酵時(shí)間等（Muck 等，2018）。復(fù)合乳酸菌劑在不同貯藏時(shí)間可能表現(xiàn)出不同的效果，通常認(rèn)為其可以促進(jìn)發(fā)酵早期階段的乳酸發(fā)酵，使青貯飼料pH 迅速下降； 而布氏乳桿菌轉(zhuǎn)化乳酸生成乙酸進(jìn)而改善青貯飼料有氧穩(wěn)定性則通常在發(fā)酵30 ～60 d 時(shí)才會(huì)普遍進(jìn)行（Johanningsmeier和McFeeters，2013；Schmidt 等，2009）。 本研究青貯飼料貯藏時(shí)間為42 d，此時(shí)布氏乳桿菌等專性異型發(fā)酵乳桿菌可能尚未成為優(yōu)勢菌種， 進(jìn)而生成足夠的乙酸來改善有氧穩(wěn)定性， 同時(shí)發(fā)酵早期pH 的快速下降則可能導(dǎo)致乳酸總產(chǎn)量降低，這也解釋了本研究中復(fù)合乳酸菌劑接種組玉米青貯有氧穩(wěn)定性數(shù)值上低于對(duì)照組的原因。另一方面，不同的兼性異型發(fā)酵乳酸桿菌與布氏乳桿菌搭配使用，也可能會(huì)產(chǎn)生不同的效果（Muck 等，2018），這可能與青貯表面附著的微生物類群有關(guān)。 某些乳酸菌株可能會(huì)與青貯原料表面附著的微生物發(fā)生競爭或拮抗作用，致使其無法成功定植，這可能是本試驗(yàn)使用的復(fù)合乳酸菌劑中的糞腸球菌在所有樣品中均沒有檢出的主要原因。

研究表明， 以苯甲酸鈉和山梨酸鉀為活性成分的復(fù)合有機(jī)酸鹽處理可以顯著降低全株玉米青貯的干物質(zhì)損失（Kung 等，2018），但本研究并未觀察到MS 處理組和對(duì)照組的干物質(zhì)損失具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。究其原因，可能是本試驗(yàn)中MS 的添加量只有0.1 g/kg，遠(yuǎn)低于先前報(bào)道的1 ～2 g/kg。此外， 研究顯示苯甲酸鈉和山梨酸鉀的復(fù)合物對(duì)干物質(zhì)損失的改善和氨態(tài)氮產(chǎn)量的降低具有劑量學(xué)效應(yīng)， 其作用效果隨著添加量的減少而逐漸下降（Zhang 等，2020；Bernardes 等，2015）。 本研究MS處理組與對(duì)照組間氨態(tài)氮濃度沒有顯著差異同時(shí)也表明， 低劑量的復(fù)合有機(jī)酸鹽并不能有效抑制玉米青貯中蛋白降解菌的活性。然而，與對(duì)照組相比，MS 處理組的全株玉米青貯的pH 和乳酸產(chǎn)量均顯著下降， 而乙酸產(chǎn)量有升高的趨勢， 導(dǎo)致乳酸/乙酸比顯著降低，說明復(fù)合有機(jī)酸鹽處理使玉米青貯發(fā)酵模式從乳酸型發(fā)酵向乙酸型發(fā)酵轉(zhuǎn)變。相應(yīng)地，細(xì)菌群落豐度LEfSe 分析顯示，MS 處理組玉米青貯中魏斯氏菌屬的相對(duì)豐度要顯著高于對(duì)照組。魏斯氏菌是革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、不產(chǎn)孢子、兼性厭氧型乳酸菌，它通過己糖-單磷酸和磷酸轉(zhuǎn)酮酶通路對(duì)碳水化合物進(jìn)行異型發(fā)酵，終產(chǎn)物主要為乳酸、二氧化碳、乙酸和/或乙醇（Vos 等，2009）。 因此，添加MS 導(dǎo)致的青貯發(fā)酵模式的改變可能與魏斯氏菌屬相對(duì)豐度的增加有關(guān)。 該結(jié)果還說明添加MS 可能有助于魏斯氏菌屬的增殖， 這與先前的研究結(jié)果相似（Zhang等，2020）。 此外， 盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著， 但是MS 處理的全株玉米青貯中片球菌的相對(duì)豐度（2.94%）約為對(duì)照組（1.51%）的2 倍，再一次證實(shí)了山梨酸鉀和苯甲酸鈉的復(fù)合物可能會(huì)促進(jìn)玉米青貯中片球菌的增殖（Zhang 等，2020）。 類似地，MS 處理組玉米青貯中克雷伯氏菌的相對(duì)豐度在數(shù)值上也比對(duì)照組低， 其原因可能是本研究中MS 的添加量較低所致。

另外，盡管MS 處理組玉米青貯的有氧穩(wěn)定性較對(duì)照組在數(shù)值上有所升高（65.3 h Vs.60.2 h），但二者并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 其原因可能是本試驗(yàn)中MS的添加量較低，而有氧穩(wěn)定性隨MS 添加量的增加而呈二次曲線規(guī)律增加（Zhang 等，2020），因此有氧穩(wěn)定性增加不顯著；本試驗(yàn)中MS 處理組玉米青貯中鞘氨醇單胞菌的相對(duì)豐度（3.28%）較對(duì)照組（2.01%）顯著升高，而鞘氨醇單胞菌屬對(duì)芳香族化合物具有極為廣泛的代謝能力（White 等，1996），因此MS 中的苯甲酸鈉可能被鞘氨醇單胞菌代謝，從而導(dǎo)致有氧穩(wěn)定性增加不顯著。

CLBMS 處理組玉米青貯的化學(xué)成分和發(fā)酵指標(biāo)與MS 處理組非常相似，但pH、乳酸產(chǎn)量和乳酸/乙酸比在數(shù)值上進(jìn)一步降低，而有氧穩(wěn)定性在數(shù)值上進(jìn)一步升高，并顯著大于CLB 組玉米青貯的有氧穩(wěn)定性。 這種變化表明復(fù)合接種劑和山梨酸鉀/苯甲酸鈉復(fù)合有機(jī)酸鹽在青貯過程中可能產(chǎn)生了協(xié)同增效作用。同時(shí)，該結(jié)果還表明在聯(lián)合使用復(fù)合接種劑和復(fù)合有機(jī)酸鹽時(shí)， 有機(jī)酸鹽似乎起到了更為主要的作用。然而，細(xì)菌群落組分差異豐度分析表明，CLBMS 和MS 處理組青貯玉米的細(xì)菌區(qū)系組成存在相當(dāng)大的差異， 表現(xiàn)在CLBMS 處理組的魏斯氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬的相對(duì)豐度均顯著低于MS 組， 而與對(duì)照組沒有顯著差異； 同時(shí)乳桿菌屬的相對(duì)豐度較MS 組高出約10%。 這些結(jié)果表明，青貯發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化過程， 許多不同的細(xì)菌類群占據(jù)著相同的生態(tài)位，行使著相同或相似的代謝特性和功能，而某種微生物群體數(shù)量的改變并不一定會(huì)引起玉米青貯表觀性狀（如發(fā)酵參數(shù)）的顯著變化。此外，這些結(jié)果還說明乳桿菌屬菌株可能包含許多代謝特性差異顯著的菌種， 因而細(xì)菌屬水平的分類學(xué)鑒定很難解釋菌群數(shù)量與表觀性狀之間的關(guān)系。因此隨著更多的乳酸菌品種被分離、培養(yǎng)和鑒定，更深一級(jí)的種水平的分類學(xué)分析可能可以更好的理解細(xì)菌類群與青貯發(fā)酵品質(zhì)之間的聯(lián)系， 以及青貯添加劑與青貯微生物之間的交互作用， 從而開發(fā)更加有效的新型青貯添加劑或?qū)ΜF(xiàn)有的添加劑進(jìn)行有效地組合使用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，由植物乳桿菌、布氏乳桿菌和糞腸球菌組成的復(fù)合乳酸菌劑可以提高全株玉米青貯pH 的下降速度和程度，但并不能確定是否由接種菌株的增殖所引起，且該過程引起的有機(jī)酸產(chǎn)量下降可能會(huì)損害全株玉米青貯的有氧穩(wěn)定性。以苯甲酸鈉和山梨酸鉀為主要活性成分的復(fù)合有機(jī)酸鹽也可以增加全株玉米青貯pH 的下降速度和程度，且能使青貯發(fā)酵模式從乳酸型發(fā)酵向乙酸型發(fā)酵轉(zhuǎn)變， 從而使玉米青貯有氧穩(wěn)定性略有增加， 而該過程可能與魏斯氏菌屬豐度的增加有關(guān)。復(fù)合乳酸菌劑和復(fù)合有機(jī)酸鹽聯(lián)合使用表現(xiàn)出一定的協(xié)同增效作用，對(duì)玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)影響與單獨(dú)應(yīng)用復(fù)合有機(jī)酸處理非常相似，但二者的細(xì)菌群落組成相差較大，其機(jī)制需要進(jìn)一步研究。