于 淼， 溫 欣， 龐 爽， 董華恒， 陳 營

（煙臺大學(xué)，山東煙臺 264000）

無花果葉是?？崎艑僦参餆o花果（Ficus carica）的葉，具有悠長載種歷史，也是一種開發(fā)應(yīng)用前景廣闊的經(jīng)濟(jì)作物，其果實(shí)營養(yǎng)豐富，葉、根可入藥（劉榮，2019）。 在山東無花果樹種植范圍廣，果樹樹冠大，因此樹葉資源豐富。 研究表明，佛手柑內(nèi)酯、補(bǔ)骨脂索、生物堿以及黃酮等都是無花果葉中廣泛存在的物質(zhì)， 這些物質(zhì)賦予無花果葉很多藥理學(xué)功能，如抗菌、抗氧化、抗癌以及降低血糖等， 因此無花果葉在臨床上具有較廣闊的用途（張慧婧，2011）。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種益生菌， 可在各種條件下生長， 不會對另一種生物體（非致病性）造成傷害，對人類和環(huán)境都是安全的（Horak，2019），常用作食品和動物飼料添加劑。近年來，人們常用枯草芽孢桿菌發(fā)酵中草藥，從而提高中草藥藥效、產(chǎn)生新成分，代替抗生素的使用?？莶菅挎邨U菌是多數(shù)動物腸道內(nèi)存在的菌群，因此被允許在家畜禽類體內(nèi)使用， 用枯草芽孢桿菌發(fā)酵中草藥后與動物飼料混合使用， 能夠調(diào)節(jié)動物腸道內(nèi)菌群平衡， 提高肉質(zhì)水平， 提高免疫力（李繼開，2021）。 有研究證實(shí)，在幼魚的飼料中添加適量枯草芽孢桿菌， 能有效改善腸道內(nèi)抗氧化能力和免疫能力（張冬梅，2022）。

本試驗(yàn)所使用的枯草芽孢桿菌是從無花果葉中分離的內(nèi)生菌， 這種內(nèi)生菌已經(jīng)適應(yīng)了無花果葉的環(huán)境。目前，多見于使用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌進(jìn)行分析， 很少有利用藥用基質(zhì)對其抑菌及抗氧化能力進(jìn)行研究的報(bào)道。 故本試驗(yàn)采用無花果葉作為藥用基質(zhì)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌， 以普通培養(yǎng)基作為對照， 研究無花果葉對枯草芽孢桿菌抗氧化能力的影響， 并通過代謝組學(xué)分析以無花果葉為基質(zhì)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌所產(chǎn)生的代謝物，為其更好地于發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 樣品：9 月份在校園內(nèi)采集青皮無花果的新鮮葉子。菌種：實(shí)驗(yàn)室保存的從無花果葉中分離得到的枯草芽孢桿菌（李莉莉，2021）。培養(yǎng)基：葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基（營養(yǎng)培養(yǎng)基）：葡萄糖5 g，K2HPO47 g，KH2PO43 g，Na3C6H5O70.5 g，Mg-SO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2SO41 g，H2O 1000 mL。

1.2 芽孢桿菌發(fā)酵液的制備 試驗(yàn)組：取清洗干凈的無花果葉15 g， 研磨成汁液后轉(zhuǎn)移至裝有100 mL 的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，121 ℃、20 min 高壓蒸汽滅菌。挑取活化后的枯草芽孢桿菌至培養(yǎng)基內(nèi)，搖晃均勻，35 ℃、130 r/min 搖床培養(yǎng)2 d， 吸取5 mL 接種到新的營養(yǎng)培養(yǎng)基（含無花果葉）中，如此傳代兩次。 對照Ⅰ組：操作同上，不加入枯草芽孢桿菌菌液。對照Ⅱ組：挑取與試驗(yàn)組等量的枯草芽孢桿菌至滅菌完成的100 mL 營養(yǎng)培養(yǎng)基 （不含無花果葉） 內(nèi)，35 ℃、130 r/min 搖床培養(yǎng)2 d，同試驗(yàn)組的處理方法，傳代兩次。

1.3 抑菌性研究 分別取試驗(yàn)組、對照Ⅰ組和對照Ⅱ組中最后一代發(fā)酵液，10000 r/min 離心10 min，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，收集過濾除菌的發(fā)酵液。 將數(shù)個(gè)無菌濾紙片分別在每種發(fā)酵液中浸泡10 s， 然后將每種發(fā)酵液中濾紙片各置于一個(gè)涂布指示菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）的平板上，重復(fù)3 次，30 ℃倒置培養(yǎng)1 ～2 d，觀察。

1.4 抗氧化性測定 抗氧化能力采用南京建成生物研究所的試劑盒測定。

1.5 代謝組學(xué)分析 分別取最后一代試驗(yàn)組接種枯草芽孢桿菌后發(fā)酵零時(shí)的發(fā)酵液 （標(biāo)記為A0）和發(fā)酵24 h 的發(fā)酵液（標(biāo)記為A1），5000 r/min離心10 min，用微孔濾膜過濾，收集過濾除菌的發(fā)酵液2 mL 置于新的無菌離心管中。 對照Ⅱ組操作同上， 將剛接種枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液標(biāo)記為B0，接種后發(fā)酵24 h 的發(fā)酵液標(biāo)記為B1。 將樣品置于干冰中送到南京禾葉蘭生物科技有限公司進(jìn)行代謝組學(xué)檢測分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理 對反饋的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，根據(jù)相對含量、差異倍數(shù)值（fold change）篩選出差異代謝物（DAMs），進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，本試驗(yàn)搜索的數(shù)據(jù)庫為PubChem 數(shù)據(jù)庫與KEGG 庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌性分析 由圖1 可知，對照Ⅰ組無花果葉研磨液，均未表現(xiàn)出抑菌性；對照Ⅱ組營養(yǎng)培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌有抑菌性，抑菌圈平均直徑為19.3 mm；試驗(yàn)組無花果葉枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌有抑菌性，抑菌圈平均直徑為24.3 mm，但沒有發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對大腸桿菌有抑菌效果。

圖1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的抑菌試驗(yàn)

2.2 抗氧化測定 由表1 可知， 試驗(yàn)組清除DPPH 自由基能力顯著高于對照Ⅰ組（P＜0.01）、對照Ⅱ組（P＜0.05），分別是對照Ⅰ組的1.5 倍和對照Ⅱ組的2 倍。 無花果研磨液和枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵液本身均具有清除DPPH 自由基的能力，二者差異顯著。在培養(yǎng)基中加入無花果葉后再發(fā)酵， 枯草芽孢桿菌清除DPPH 自由基的能力顯著增強(qiáng)。 試驗(yàn)組清除超氧陰離子自由基能力略高于對照Ⅱ組（P＜0.01），顯著高于對照Ⅰ組（P＜0.01）。 可知，無花果葉研磨液清除超氧陰離子自由基的能力比較低， 枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵液本身清除超氧陰離子自由基的能力較高，二者差異顯著。 加入無花果葉后再發(fā)酵，枯草芽孢桿菌清除超氧陰離子自由基的能力略有增強(qiáng)。 試驗(yàn)組清除羥自由基能力顯著高于對照Ⅰ組與對照Ⅱ組（P＜0.01），是對照Ⅰ組與對照Ⅱ組的1.5 倍。無花果葉研磨液與枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵液清除羥自由基的能力相近， 兩者差異不顯著。加入無花果葉后再發(fā)酵，枯草芽孢桿菌清除羥自由基的能力有所增強(qiáng)。

表1 抗氧化能力測定結(jié)果

2.3 代謝組學(xué)分析

2.3.1 可信度分析 采用主成分分析對試驗(yàn)組和對照組的發(fā)酵液進(jìn)行差異代謝物分析。通過PCA處理后得到正負(fù)離子模式下的PCA 得分圖，如圖2 所示。 同一組樣品組內(nèi)分布較為集中，表示組間重復(fù)性較好；不同樣品結(jié)果之間較為分散，則說明具有較為顯著的差異代謝物， 具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 PCA 得分圖

2.3.2 不同培養(yǎng)條件枯草芽孢桿菌代謝物分析經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度分析之后，根據(jù)FC＞2，F(xiàn)C＜0.5 的篩選原則， 對發(fā)酵液中的差異代謝物進(jìn)行篩選。如表2 所示， 從以無花果葉為基質(zhì)的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中， 發(fā)酵前后A0v A1篩選到98 個(gè)差異代謝物，營養(yǎng)培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中，發(fā)酵前后B0v B1篩選到53 個(gè)差異代謝物， 兩個(gè)組中差異代謝物主要集中于脂質(zhì)類，其中游離脂肪酸、類固醇、磷脂酰甘油等含量較多。 另外，A0v A1組中生物堿、氨基酸、黃酮、酚類差異代謝物多于B0v B1組中， 使得無花果葉枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中差異代謝物的數(shù)量遠(yuǎn)多于營養(yǎng)培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌發(fā)酵液。

表2 差異代謝物的種類與變化情況

差異代謝物在無花果葉枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中以上調(diào)模式占主導(dǎo)，60 個(gè)代謝物表達(dá)上調(diào)，38個(gè)代謝物表達(dá)下調(diào)； 差異代謝物在營養(yǎng)培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中， 有27 個(gè)代謝物表達(dá)上調(diào)，26 個(gè)代謝物表達(dá)下調(diào)，無明顯差異。

2.3.3 兩種發(fā)酵液差異代謝物分析 對A1v B1組差異代謝物進(jìn)行篩選， 即發(fā)酵后兩種發(fā)酵液中的差異代謝物，得到237 個(gè)代謝物，其中無花果葉枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中優(yōu)勢代謝物有179種，營養(yǎng)培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中有58 種優(yōu)勢代謝物，如圖3。 對這些代謝物進(jìn)行物質(zhì)分類，其中脂質(zhì)類數(shù)量最多，占總數(shù)的11.4%，生物堿類次之，占9.7%，其余依次為抗生素（5.9%）、黃酮（5.5%）、萜類（5.5%）、糖苷（5.5%）、氨基酸（5.1%）、酚類（1.3%）。與營養(yǎng)培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌發(fā)酵液相比， 無花果葉枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中優(yōu)勢代謝物在數(shù)量與種類上明顯更多， 其中生物堿、萜類、黃酮及酚類這些物質(zhì)含量較高，可能在枯草芽孢桿菌發(fā)揮生物活性時(shí)起到重要作用。

圖3 差異代謝物數(shù)量統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論與討論

在植物中存在的內(nèi)生菌， 芽孢桿菌占有很大比例，在植物生長過程中發(fā)揮著很大的作用（Sun，2021）。 植物內(nèi)生菌與宿主長期共存，二者的代謝系統(tǒng)相近，因此，植物共生菌利用宿主植物代謝產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)， 能夠產(chǎn)生與植物化學(xué)成分具有相同活性的代謝產(chǎn)物（任群利，2022）。本試驗(yàn)中從無花果葉中篩選出一株與其共生的枯草芽孢桿菌。無花果葉細(xì)胞壁的存在， 細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)不能直接被利用， 但通過枯草芽孢桿菌分泌產(chǎn)生的纖維素酶分解纖維素， 破壞無花果葉細(xì)胞壁， 枯草芽孢桿菌利用細(xì)胞釋放出的營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖。 此外， 在枯草芽孢桿菌降解無花果葉過程中不僅可以生成豐富的必需氨基酸、 可溶性蛋白、有機(jī)酸等小分子物質(zhì)，還會根據(jù)自身產(chǎn)生的酶產(chǎn)生新的物質(zhì)（王思月，2022）。李國紅等（2005）利用枯草芽孢桿菌對三七根須進(jìn)行發(fā)酵， 在發(fā)酵液中分離出一種新的成分， 經(jīng)鑒定為人參皂苷Rh4。 說明根據(jù)發(fā)酵底物的不同，枯草芽孢桿菌能夠改變自身代謝途徑，產(chǎn)生不同的活性物質(zhì)，從而提高發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)含量（王世榮，2019）。

在枯草芽孢桿菌生長過程中能產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有抗菌活性， 這類抗菌物質(zhì)多為脂肽類抗生素，對病原真菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的拮抗活性，使得枯草芽孢桿菌具有廣譜抗菌活性（曾國洪，2019）。這可能是因?yàn)榧?xì)菌離子通道產(chǎn)生的薄膜可以改變細(xì)胞通透性、氨基酸浸潤并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而易感膜受體在與細(xì)菌素結(jié)合后激活其作用。 也有研究表明， 革蘭氏陽性菌中的細(xì)菌素也可以通過枯草桿菌蛋白酶導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞自溶（Lu，2018）。因此，在無花果葉枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中，脂質(zhì)、抗生素、氨基酸類物質(zhì)含量高，可能與形成抗菌肽有關(guān)。 在無花果葉枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中， 脂質(zhì)與氨基酸表達(dá)上調(diào)的種類明顯較多，尤其是脂肪酸與半胱氨酸兩種， 可能是二者結(jié)合產(chǎn)生了新的抗菌肽， 從而使抑菌能力增強(qiáng)。 抗菌肽能夠打破無花果葉細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的阻礙， 使有效成分分解釋放（何英霞，2020），通過代謝組學(xué)分析這些有效成分很可能是生物堿、黃酮、酚類、萜類物質(zhì)。另外在無花果葉枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中存在的萜類物質(zhì)多為單萜和二萜類化合物， 某些二萜類化合物可以通過抑制細(xì)菌生物膜的形成達(dá)到抗菌活性， 對金黃色葡萄球菌抑制效果更為明顯（楊亞蘭，2019）。

生物堿、黃酮、酚類都是植物中非常重要的次級代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)具有廣泛的藥理活性，雖然具有較強(qiáng)的抑菌能力， 但它們的抗氧化能力更受關(guān)注。 在無花果葉枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中存在的生物堿，以甲麥角林（Metergoline）為例，這是一種從真菌和一些高等植物等類群中提取的麥角堿生物堿（Kulkarni，2021），這類從藥用植物中提取的生物堿，經(jīng)試驗(yàn)證明可以在體外清除DPPH、超氧陰離子和一氧化氮自由基， 具有一定抗氧化活性（Farag，2018）。 無花果葉中含有的黃酮、多酚成分有較強(qiáng)的抗氧化能力， 這兩種物質(zhì)的抗氧化能力遠(yuǎn)高于維生素C，并呈一定的量效關(guān)系，被認(rèn)作是天然的自由基清除劑（趙默涵，2018；徐蔓，2018）。Li 等（2021）發(fā)現(xiàn)，利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵能夠提高降解鷹嘴豆蛋白和釋放活性肽的能力， 而肽水平的增加可能有助于提高抗氧化活性。 Ezraty 等（2017）發(fā)現(xiàn)，某些半胱氨酸的殘基磺?；梢哉{(diào)節(jié)幾種原核和真核蛋白的活性， 并使細(xì)胞能夠?qū)μ囟?xì)胞環(huán)境的氧化還原狀態(tài)作出反應(yīng)， 另外還發(fā)現(xiàn)了氧化應(yīng)激激活的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄因子， 能夠積極調(diào)節(jié)幾種抗氧化基因的表達(dá)， 包括編碼過氧化物酶和過氧化氫酶的基因。 枯草芽孢桿菌在分解無花果葉過程中， 將大多數(shù)大蛋白質(zhì)被降解成小蛋白質(zhì)或肽，或許與提高發(fā)酵液抗氧化能力有關(guān)。

在本研究中利用無花果葉培養(yǎng)其共生菌枯草芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌的抑菌能力、抗氧化能力得到提高，通過代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，可能與脂質(zhì)、抗生素、黃酮、生物堿、萜類、酚類以及氨基酸類物質(zhì)有關(guān)。為今后有效發(fā)揮枯草芽孢桿菌作用，研發(fā)新型動物飼料提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。 但兩種發(fā)酵液中產(chǎn)生差異的代謝途徑及產(chǎn)生差異的原因需要進(jìn)一步研究。