楊 滴

（大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧大連 116600）

大腸埃希氏菌O157:H7（E.coliO157:H7）是腸出血型大腸埃希氏菌的一種主要血清型，是一種危害嚴(yán)重的食源性病原微生物，其廣泛分布于自然界，嚴(yán)重威脅公眾健康[1-3]。近年來，由致病性微生物引起的食品污染事件呈上升趨勢(shì)。肉及肉制品營(yíng)養(yǎng)豐富，可滿足人們的需求，但極易滋生各類有害細(xì)菌[4]。相關(guān)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肉及肉制品受致病菌的污染最為嚴(yán)重，而E.coliO157:H7 污染占比很大[5]。

現(xiàn)階段E.coliO157:H7 的主要檢驗(yàn)方法為微生物分離培養(yǎng)鑒定，其過程煩瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、易產(chǎn)生假陽(yáng)性[6]?；赥aqMan 探針的實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)是微生物檢驗(yàn)的主要輔助手段，具有高效、特異、精準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)。本研究旨在以E.coliO157:H7 菌體抗原基因rfbE為對(duì)象，研發(fā)一種肉制品中E.coliO157:H7實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)方法，為肉制品中E.coliO157:H7 的檢測(cè)提供技術(shù)支持，為市場(chǎng)監(jiān)管提供保障。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究使用11 株標(biāo)準(zhǔn)菌株，均購(gòu)于CICC。所有標(biāo)準(zhǔn)菌株信息見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)菌株信息

1.2 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒；Premix Ex Taq PCR 試劑盒。

1.3 主要儀器

ABI QS7 Flex 熒光定量PCR 儀；超低溫離心機(jī)；DNA 分析儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 引物與探針

根據(jù)E.coliO157:H7 菌體抗原基因rfbE序列，使用Primer express 3.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan MGB 探針，引物探針由上海生工公司合成，引物及探針序列見表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR 引物及探針序列

1.4.2 DNA 模板制備

將E.coliO157:H7 和其他10 株標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)24 h。取100 μL 增菌液，提取DNA 作為實(shí)時(shí)熒光PCR 模板。

1.4.3 實(shí)時(shí)PCR 的反應(yīng)體系及條件

實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增采用20 μL 反應(yīng)體系，具體各種試劑濃度、體積見表3。

表3 實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)程序參考試劑盒說明書為95 ℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)，即95 ℃變性5 s、60 ℃退火和延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。

1.4.4 特異性研究

將E.coliO157:H7 等11 株標(biāo)準(zhǔn)菌株按照1.4.2制備DNA 模板，并用無菌水作為無模板對(duì)照，實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系和條件按優(yōu)化結(jié)果設(shè)置，驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)E.coliO157:H7 的特異性。

1.4.5 靈敏性研究

將E.coliO157:H7 標(biāo)準(zhǔn)菌株增菌液進(jìn)行倍比梯度稀釋，形成梯度含菌量為1×106CFU·mL-1至1×101CFU·mL-1的6 個(gè)濃度的菌懸液。每個(gè)稀釋度取1 mL 菌懸液，按照1.4.2 制備DNA，探討實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)E.coliO157:H7 的靈敏性。

1.4.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

選取市售鮮豬肉、鮮牛肉、鮮羊肉、雞胸肉、烤鴨、熟豬頭肉、醬牛肉、牛肉干、醬豬耳和醬牛蹄筋共10 個(gè)樣品，分別取上述樣品25 g 放入裝有225 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)基中，于36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取增菌液1 mL 提取DNA 后，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)，探討本研究的實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性結(jié)果

本試驗(yàn)以CICC 10907E.coliO157:H7 為目標(biāo)菌株，以金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌等10 株標(biāo)準(zhǔn)菌株為非目標(biāo)菌株，高純水為無模板對(duì)照，驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測(cè)大腸埃希氏菌O157:H7 的特異性。擴(kuò)增結(jié)果見圖1，只有目標(biāo)菌株具有擴(kuò)增曲線，其他10 株非目標(biāo)菌株無擴(kuò)增曲線。結(jié)果表明，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)法具有較強(qiáng)的特異性。

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)大腸埃希氏菌O157:H7 特異性試驗(yàn)

2.2 靈敏性結(jié)果

分別吸取1×106CFU·mL-1、1×105CFU·mL-1、1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1、1×102CFU·mL-1和1×101CFU·mL-1的E.coliO157:H7 菌懸液1 mL 進(jìn)行DNA 提取，提取的DNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 試驗(yàn)。E.coliO157:H7 靈敏性試驗(yàn)結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，大腸埃希氏菌O157:H7 濃度為1×106CFU·mL-1、1×105CFU·mL-1、1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1、1×102CFU·mL-1時(shí)均有擴(kuò)增曲線濃度低于1×102CFU·mL-1時(shí)無擴(kuò)增曲線，該方法檢測(cè)的低限為1×102CFU·mL-1。

圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)大腸埃希氏菌O157:H7 靈敏性試驗(yàn)

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)鮮豬肉、鮮牛肉、鮮羊肉、雞胸肉、烤鴨、熟豬頭肉、醬牛肉、牛肉干、醬豬耳、醬牛蹄筋共10 個(gè)樣品的營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌液進(jìn)行DNA 提取，以大腸埃希氏菌O157:H7 為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)，擴(kuò)增結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，鮮豬肉、鮮牛肉、鮮羊肉中檢測(cè)出含有E.coliO157:H7。

圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)實(shí)際樣品試驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

研發(fā)一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的快速檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)中肉與肉制品安全監(jiān)測(cè)發(fā)展的必然趨勢(shì)[7]。長(zhǎng)期以來，肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7 檢測(cè)主要依據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定，該方法步驟煩瑣，且耗時(shí)長(zhǎng)。實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好、反應(yīng)高效、準(zhǔn)確性高、檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)[8]，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域[9]。本研究以rfbE基因?yàn)槟繕?biāo)基因，通過反復(fù)摸索，建立了一種特異性強(qiáng)、靈敏性高、切實(shí)可行的檢測(cè)肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7 的實(shí)時(shí)熒光PCR 方法。本研究設(shè)計(jì)含有不同濃度的大腸埃希氏菌O157:H7（1×106CFU·mL-1、1×105CFU·mL-1、1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1和1×102CFU·mL-1）菌液樣品，試驗(yàn)得到該檢測(cè)方法的低限為1×102CFU·mL-1。本檢測(cè)方法具有特異、快速的特點(diǎn)，能夠滿足檢測(cè)要求，為肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7 的快速檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。