劉志軒 姜 蕊

湖北省鐘祥市中醫(yī)院腦病科 431900

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)惡性腫瘤是預(yù)后最差的癌癥之一,早在1985年,Westermark B等人發(fā)現(xiàn),表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)基因和膠質(zhì)瘤密切相關(guān)[1]。研究表明EGFR促進膠質(zhì)瘤增長并影響人的生存率[2-4],然而,EGFR對人膠質(zhì)腫瘤預(yù)后的影響卻少有報道,本文利用腫瘤數(shù)據(jù)庫TCGA 數(shù)據(jù)庫,結(jié)合R語言,驗證EGFR是否在膠質(zhì)瘤中高表達,并評估其能否對膠質(zhì)瘤的患者預(yù)后產(chǎn)生影響,為后續(xù)EGFR相關(guān)分子篩選、明星通路的闡明以及膠質(zhì)瘤和EGFR相關(guān)靶點分子的篩選奠定前期基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料的獲取 從癌基因組數(shù)據(jù)庫(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取 GBMLGG(膠質(zhì)瘤)項目中 level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù),將 FPKM (fregments per kilobase per million) 格式的RNAseq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成了TPM (transcripts per million reads) 格式,進而進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化。根據(jù)分子:EGFR[ENSG00000146648],以0%～50% VS 50%～100%進行分組(EGFR低表達組、EGFR高表達組)、利用軟件:R(3.6.3版本)進行統(tǒng)計分析與表格生成[5]。P<0.05表示兩組抑或多組之間的亞組間存在統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2 EGFR在膠質(zhì)瘤中的表達情況 調(diào)取數(shù)據(jù):UCSC XENA (https://xenabrowser.net/datapages/)經(jīng)Toil流程(Vivian J等,2017)[6]統(tǒng)一處理的TCGA和GTEx的TPM格式的RNAseq數(shù)據(jù)。提取TCGA的GBMLGG(膠質(zhì)瘤)和GTEx中對應(yīng)的正常組織數(shù)據(jù),進而分為臨床變量: 膠質(zhì)瘤組 VS 正常組。接著將數(shù)據(jù)按照TPM格式的RNAseq數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化方法進行轉(zhuǎn)化。 在R軟件中利用ggplot2包可視化分子: EGFR[ENSG00000146648] 在兩組中的表達情況。

1.3 ROC曲線分析 利用R(3.6.3版本)中R包: pROC包[1.17.0.1版本](用于分析)、ggplot2包[3.3.3版本] (用于可視化)處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù):UCSC XENA (https://xenabrowser.net/datapages/)經(jīng)Toil流程(Vivian J 等,2017)[6]統(tǒng)一處理的TCGA和GTEx的TPM格式的RNAseq數(shù)據(jù)。提取TCGA的GBMLGG(膠質(zhì)瘤)和GTEx中對應(yīng)的正常組織數(shù)據(jù),進而分為臨床變量: 膠質(zhì)瘤組 VS 正常組。以橫坐標(biāo)為假陽性率(FPR),縱坐標(biāo)為真陽性率(TPR) 預(yù)測分子:EGFR[ENSG00000146648]在鑒定腫瘤中的作用。數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化方法為:TPM格式的RNAseq數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化。

1.4 KM生存分析 從癌基因組數(shù)據(jù)庫(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/ )獲取 GBMLGG(膠質(zhì)瘤)項目中 level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù),將FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成了TPM格式,進而進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化。根據(jù)分子:EGFR[ENSG00000146648],以0%～50% VS 50%～100%進行分組,然后利用R包:survminer包[0.4.9版本](用于可視化)、survival包[3.2-10版本] (用于生存資料的統(tǒng)計分析),利用軟件:R(3.6.3版本)進行統(tǒng)計分析與可視化。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中患者臨床數(shù)據(jù)特征 從 TCGA數(shù)據(jù)庫中納入696例患者臨床信息,男398例,女298例,其中男性相對女性EGFR表達增高(P<0.05)。同時我們也發(fā)現(xiàn)相對年輕的患者EGFR的表達也存在增高現(xiàn)象(P<0.05);相比較前兩者,EGFR在膠質(zhì)瘤亞型中表達差異不顯著(P=0.127)。相比較EGFR的低表達,EGFR的高表達增加死亡率(17.5% VS 21.6%),同時降低生存率(32.5%VS 28.4% )。見表1。

表1 高/低表達EGFR組臨床資料對比

2.2 EGFR在膠質(zhì)瘤中的表達情況 從TCGA數(shù)據(jù)庫中納入1 157例正常組和689例膠質(zhì)腫瘤組患者,從統(tǒng)計描述表中可以看到,正常組的中位數(shù)(上下四分位數(shù))為2.10(1.59～2.57),膠質(zhì)瘤組的中位數(shù)(上下四分位數(shù))為5.68(4.69～6.57),見表2。正態(tài)性檢驗結(jié)果顯示,樣本不滿足正態(tài)性檢驗(P<0.05), Mann-WhitneyU檢驗(Wilcoxon rank sum test)結(jié)果顯示,膠質(zhì)瘤組高于正常組,兩組的差值中位數(shù)為3.573(3.466～3.682),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

表2 正常組和膠質(zhì)瘤組EGFR表達情況統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)

2.3 EGFR分子診斷膠質(zhì)瘤的能力 從圖1可見,EGFR在診斷膠質(zhì)瘤能力方面,變量EGFR在診斷膠質(zhì)瘤的臨床特異性和敏感度有較高準確性(AUC=0.979,95%CI= 0.971～0.986)。

圖1 EGFR在預(yù)測膠質(zhì)瘤的ROC曲線ROC曲線下的面積值在0.5和1之間。AUC越接近于1,說明診斷效果越好。AUC在 0.5～0.7時有較低準確性,AUC在0.7～0.9時有一定準確性,AUC在0.9以上時有較高準確性

2.4 EGFR在膠質(zhì)瘤患者預(yù)后生存中的能力 經(jīng)survminer包計算得到各組的中位生存時間,其中EGFR低表達組的中位生存時間為63.8(46.7～95.8)個月;EGFR高表達組的中位生存時間為41.7(32.5～51.2)個月。從統(tǒng)計檢驗表可得:Log-rank檢驗結(jié)果提示,不同EGFR表達分組的生存時間分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014);Cox回歸結(jié)果提示,不同EGFR表達分組的生存時間分布的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014)。以上結(jié)果提示EGFR高表達組預(yù)后更差。見圖2。

圖2 EGFR高/低表達在膠質(zhì)瘤患者預(yù)后生存中的KM曲線圖

3 討論

膠質(zhì)瘤是臨床中常見的原發(fā)性CNS惡性腫瘤,為了指導(dǎo)臨床實際運用,臨床上常用世界衛(wèi)生組織(WHO)分類系統(tǒng)和 Kernoban 分類系統(tǒng)。上述分類系統(tǒng)在評估神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度上具有優(yōu)勢,但是判斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后上存在明顯短板。因此引入分子病理學(xué)分級進而指導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療具有很強的現(xiàn)實意義。本文基于前期臨床實踐和對腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)的挖掘,肯定了EGFR在膠質(zhì)瘤中高表達,并且EGFR表達量對膠質(zhì)瘤患者臨床預(yù)后存在顯著影響。

臨床資料表中發(fā)現(xiàn)EGFR存在年齡和性別差異,EGFR在男性膠質(zhì)瘤患者中表達增多,本次試驗的結(jié)果和Quinn T Ostrom等人在NEURO-ONCOLOGY雜志上發(fā)表了關(guān)于在男性膠質(zhì)瘤患者中高表達的結(jié)論一致[7],然而目前對男性患者EGFR的生物來源尚不清楚,最近一篇論文論述了關(guān)于男性Y染色中SOX2部位活化,刺激血管生成素樣4蛋白 (ANGPTL4)表達,增加EGFR磷酸化水平,繼而激活磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)促進4E-BP1磷酸化進而級聯(lián)誘導(dǎo)干細胞增殖的報道[3],綜上雖然臨床資料顯示EGFR具有男性化傾向,但具體生物機制尚待研究。此外,在臨床資料中我們還發(fā)現(xiàn)年齡對EGFR的表達存在影響,在資料中可見EGFR表達高峰主要集中在年齡≤60歲的人群中,而年齡>60歲無論EGFR表達高/低均較前者明顯減少,這一結(jié)果可能和膠質(zhì)瘤病情嚴重,患者普遍生存率低有關(guān)。另外一項關(guān)于膠質(zhì)瘤的研究報告稱,EGFR水平高低、OS與年齡分組(≥40歲,<40歲)存在相關(guān)性[8]。本文結(jié)果顯示,低表達與高表達EGFR分組在組織學(xué)類型方面無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.127),本次臨床基線資料中也發(fā)現(xiàn)EGFR表達高低和膠質(zhì)瘤生存率相關(guān)。

表2結(jié)果表明EGFR在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中明顯表達,提示膠質(zhì)瘤中的某種細胞抑或組織經(jīng)由某種機制高表達EGFR。有學(xué)者系統(tǒng)闡述了膠質(zhì)母細胞通過活化EGFRv Ⅲ達到EGFR級聯(lián)放大的作用,并通過激活RAS/MAPK/ERK、PI3K/AKT、JAK/STAT、phospholipase C(PLC)/PKC等通路進一步刺激腫瘤生長,抵抗化療藥物進而達到腫瘤惡性增殖的目的[2]。同時,該結(jié)果和之前臨床基線資料中膠質(zhì)母細胞中EGFR高表達占比高的結(jié)果相一致。

在預(yù)測正常組和膠質(zhì)瘤結(jié)局上,圖1 EGFR的ROC曲線下面積為0.979,顯示出良好的預(yù)測能力。目前關(guān)于EGRF對膠質(zhì)瘤的生物學(xué)預(yù)測功能得到極大的關(guān)注和試驗認證[9-11]。另外一項研究報道了T1加權(quán)動態(tài)對比增強MRI可作為EGFRv Ⅲ狀態(tài)的無創(chuàng)生物標(biāo)志物,用于膠質(zhì)瘤的診斷[12]。圖2展示了EGFR在預(yù)測膠質(zhì)瘤預(yù)后的良好效果,結(jié)果顯示:EGFR低表達組的中位生存時間為63.8(46.7～95.8)個月,EGFR高表達組的中位生存時間為41.7(32.5～51.2)個月。EGFR高表達明顯縮短患者生存期,提示EGFR能作為膠質(zhì)瘤的預(yù)后因素。

本研究也存在一定的局限性:(1)研究數(shù)據(jù)來自TCGA數(shù)據(jù)庫,沒有EGRF相關(guān)的臨床或者動物研究驗證;(2)對EGRF相關(guān)基因和通路機制未做進一步闡明和揭示。本研究利用生物信息技術(shù)對EGFR和膠質(zhì)瘤相關(guān)性進行研究,展示了EGFR對膠質(zhì)瘤患者具有良好的預(yù)測及預(yù)后預(yù)測功能,為將來EGFR相關(guān)制劑運用于臨床,為膠質(zhì)瘤患者的早診斷,預(yù)后評估提供理論線索。