吳雨桐,賈英

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,由于其特殊的解剖位置,發(fā)病早期通常無癥狀,難以被發(fā)現(xiàn),大多數(shù)發(fā)現(xiàn)即為晚期,易發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移,死亡率高,預(yù)后差[1]。70%～80%的卵巢癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí),腫瘤已轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到盆腹腔臟器,5年生存率低于50%,而早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者的生存率可達(dá)90%[2-3]。手術(shù)聯(lián)合化療是卵巢癌患者目前的主要治療手段,對(duì)于病變晚期的卵巢癌患者來說,其手術(shù)范圍廣、難度高且病灶難以完全清除[4]。大量文獻(xiàn)報(bào)道,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在多種疾病及癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中存在異常調(diào)控,在細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期阻滯、轉(zhuǎn)移、侵襲和化療耐藥中起著重要作用[5-6],本文對(duì)lncRNA在卵巢癌癌基因異常調(diào)控分子機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 LncRNA的特點(diǎn)

人類基因組中約有21 000個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、9 000個(gè)小RNA、10 000個(gè)lncRNA位點(diǎn)和11 000個(gè)假基因[7],其RNA轉(zhuǎn)錄物中大部分都是非編碼RNA(ncRNA),ncRNA包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、lncRNA和microRNA等,它們不能翻譯成蛋白質(zhì),卻廣泛參與人體多種生理、病理過程,尤其是癌癥病變過程,通過調(diào)控基因表達(dá)參與多種分子遺傳學(xué)和細(xì)胞過程,包括細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生等[8-9]。

lncRNA是一類長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的RNA分子,覆蓋了98%的轉(zhuǎn)錄組[10],在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及表觀遺傳學(xué)水平上發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄沉默、轉(zhuǎn)錄激活、染色體修飾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)戎匾{(diào)控作用,因其序列缺乏開放閱讀框,因此不能翻譯蛋白質(zhì)。主要包括反義lncRNA、內(nèi)含子非編碼RNA、基因區(qū)間的lncRNA、啟動(dòng)子相關(guān)lncRNA以及非翻譯區(qū)lncRNA在內(nèi)的5種lncRNA。細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、微循環(huán)及循環(huán)體液中均可檢測(cè)到lncRNA的存在,廣泛地參與腫瘤形成、轉(zhuǎn)移、侵襲、耐藥、復(fù)發(fā)及預(yù)后等過程[11],執(zhí)行包括基因轉(zhuǎn)錄、基因印記、X染色體失活、核結(jié)構(gòu)組織和表觀遺傳染色質(zhì)修飾在內(nèi)的多種復(fù)雜功能。就lncRNA的功能來說,① lncRNA起到miRNA海綿作用,調(diào)控靶基因表達(dá);② lncRNA與蛋白結(jié)合,調(diào)控蛋白功能;③ 作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體,如lncRNA與蛋白復(fù)合物結(jié)合到基因啟動(dòng)子區(qū),調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄;④ 干擾鄰近蛋白編碼基因的表達(dá);⑤ 抑制RNA聚合酶II,介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾,從而影響基因表達(dá);⑥ lncRNA與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈,在Dicer酶作用下產(chǎn)生內(nèi)源性的siRNA,調(diào)控基因的表達(dá)水平;⑦ 結(jié)合在特定蛋白上從而改變?cè)摰鞍椎陌|(zhì)定位。

單一lncRNA參與多種疾病癌變過程的調(diào)控,研究發(fā)現(xiàn),lncRNA TLR8-AS1在卵巢癌中表達(dá)上調(diào),被認(rèn)為是卵巢癌的致癌基因,可通過穩(wěn)定TLR8 mRNA上調(diào)TLR8激活NF-kB信號(hào)通路,促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及化療的耐藥性[5];在肝癌中也表達(dá)上調(diào),但TLR8-AS1過表達(dá)可抑制miR-34的成熟,從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[12]。此外,MIR99AHG在胰腺癌中明顯過表達(dá),轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒A1(FOXA1)可誘導(dǎo)MIR99AHG上調(diào),分泌miR-3129-5p并募集ELAVL1調(diào)節(jié)NOTCH2/Notch通路信號(hào)從而加速胰腺癌的進(jìn)展[13],還可通過miR577/FOXP1軸抑制凋亡促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展[14]。

2 LncRNA在競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用

組織癌變過程中存在蛋白編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄物的異常表達(dá),非編碼轉(zhuǎn)錄組中包括lncRNA和假基因,均含有microRNA(miRNA)反應(yīng)元件(microRNA response element,MRE),研究表明lncRNA可作為天然的miRNA分子海綿調(diào)節(jié)基因表達(dá),這些非編碼RNA參與的競(jìng)爭(zhēng)性相互作用調(diào)節(jié)稱為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)中分子間的功能是相互作用的,任一分子受到干擾出現(xiàn)異常表達(dá),均可能造成龐大復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)障礙,從而誘發(fā)疾病[15]。近期的研究證實(shí)lncRNA SND1-IT1可競(jìng)爭(zhēng)吸附與miR-1245b-5p結(jié)合,從而促進(jìn)泛素特異性蛋白酶3(USP3)信使RNA(mRNA)表達(dá),USP3可介導(dǎo)蝸牛家族轉(zhuǎn)錄阻遏物1(SNAIL1)去泛素化,從而增強(qiáng)GSE-1細(xì)胞出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化[16];Liu W等[17]通過雙熒光素報(bào)告分析、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)和生物素化RNA下拉分析等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LINC00974的過表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,敲除miR-33a可在一定程度上抑制LINC00974的作用,利用數(shù)據(jù)庫(kù)明確高遷移率族框2(HMGB2)為miR-33a的直接靶基因,LINC00974可作為ceRNA直接與miR-33a結(jié)合,上調(diào)HMGB2,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT);此外,?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)也可作為ceRNA吸附miR-1-3p,促進(jìn)IGF1的表達(dá),從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化和侵襲[18]。

3 LncRNA在卵巢癌中的相關(guān)研究

3.1 卵巢癌致癌相關(guān)lncRNA

卵巢癌發(fā)生是多步驟的基因突變、多種內(nèi)外因素作用以及代謝調(diào)控紊亂等多種因素共同作用的結(jié)果,lncRNA在卵巢癌癌變過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮著不可忽視的致癌基因的作用。Xie X等[19]通過RT-qPCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與正常組織相比,卵巢癌組織中KTN1-AS1的表達(dá)增加,并通過流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證,經(jīng)USSC數(shù)據(jù)庫(kù)、CHIP法證實(shí)H3K27ac可誘導(dǎo)KTN1-AS1,而后通過starBase數(shù)據(jù)庫(kù)、RT-qPCR法、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)KTN1-AS1在卵巢癌中與miR-505-3p相互作用(P<0.05),ZNF326是miR-505-3p的靶基因(P<0.05),通過集落形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證KTN1-AS1通過增加ZNF326水平促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)。最終得出結(jié)論:H3K27ac可誘導(dǎo)KTN1-AS1的表達(dá),基于ceRNA網(wǎng)絡(luò)KTN1-AS1/miR-505-3p/ZNF326軸發(fā)揮促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲轉(zhuǎn)移等致癌過程。研究揭示LINC00665在人卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3細(xì)胞系中表達(dá)水平增高,Western blot實(shí)驗(yàn)、傷口愈合實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)及transwell分析顯示敲除LINC00665可降低SKOV-3和OVCAR-3細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá),增加p21的表達(dá),抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡(P<0.01),利用LncBase數(shù)據(jù)庫(kù)、Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到LINC00665的靶基因miR-181a-5p、FHDC1,并通過體外實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證,最終證實(shí)LINC00665基因可通過miR-181a-5p/FHDC1軸促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生[20]。

癌癥易感候選基因15(CASCA15)是一種新發(fā)現(xiàn)的致癌lncRNA, Lin H等[21]通過TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)以及將CASC15特異性的短干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞系中證實(shí)CASCA15高表達(dá)的卵巢癌患者的總體生存率(OS)比低表達(dá)的患者差,表明過表達(dá)CASCA15將降低卵巢癌患者的生存時(shí)間。DICER是一種可將miRNA切割成成熟形式的關(guān)鍵RNase III酶,對(duì)其進(jìn)行RIP-seq分析,將得到的lncRNA命名為卵巢DICER相關(guān)T轉(zhuǎn)錄物1(DATOC-1),通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)DATOC-1高表達(dá)可促進(jìn)上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)的進(jìn)展,并設(shè)置體內(nèi)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建異種移植瘤模型加以驗(yàn)證,利用AnnoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能的靶向miRNA,最終證實(shí)DATOC-1可能與DICER作用從而影響miR7促進(jìn)EOC的進(jìn)展[22]。Li B等[23]通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)PART1在卵巢癌組織中過度表達(dá)(P<0.001),FIGO分期越高、組織轉(zhuǎn)移越多者PART1的表達(dá)量越高(均P<0.01),由StarBase軟件預(yù)測(cè)下游靶基因miR-503-5p(P<0.001,R2=0.665)和FOXK1(P<0.001,R2=0.6138),最后進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低表達(dá)PART1可通過miR-503-5p/FOXK1軸抑制卵巢癌的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。

3.2 卵巢癌抑癌相關(guān)lncRNA

在卵巢癌病變過程中,并不是所有l(wèi)ncRNA的突變都會(huì)造成其轉(zhuǎn)移、促進(jìn)癌細(xì)胞增長(zhǎng),一些特殊lncRNA的異常表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增長(zhǎng)和侵襲。研究表明LINC00261在高級(jí)別漿液性卵巢癌(high-grade serous ovarian cancer,HGSOC)中表達(dá)上調(diào)[24],敲除卵巢癌細(xì)胞系中的LINC00261基因可使miR-552顯著上調(diào),miR-552作用于ATG10誘導(dǎo)EMT表型從而促進(jìn)HGSOC進(jìn)展,因此,LINC00261的過表達(dá)可通過miR-552/ATG10/EMT軸抑制HGSOC細(xì)胞的增殖、遷移能力;lncRNA生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄物5(GAS5)被認(rèn)為是卵巢癌抑癌基因的一種,生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報(bào)告基因分析等實(shí)驗(yàn)表明,miR-96-5p可以特異性地結(jié)合GAS5,GAS5的過表達(dá)可抑制miR-96-5p的表達(dá)從而顯著降低卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[25]。

3.3 卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)lncRNA

卵巢癌細(xì)胞的廣泛轉(zhuǎn)移是造成臨床治療及預(yù)后差的主要原因之一,充分探索卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制可進(jìn)一步提高患者的5年生存率。Lu Y等[26]明確BC041954 基因在卵巢癌組織中存在高表達(dá),根據(jù)BC041954的中位表達(dá)水平將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,發(fā)現(xiàn)BC041954基因高表達(dá)的患者在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中更為常見(P=0.031)。研究表明,過表達(dá)CASCA15將降低卵巢癌患者的生存時(shí)間,向小鼠腹腔內(nèi)注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CASCA15的SKOV3細(xì)胞,在第5周時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行生物發(fā)光成像,敲除CASCA15基因組全身發(fā)光信號(hào)比對(duì)照組大約低6倍,小鼠模型實(shí)驗(yàn)顯示CASCA15基因敲除可顯著降低腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量,強(qiáng)烈支持CASCA15作為卵巢癌轉(zhuǎn)移啟動(dòng)子的作用[21]。

3.4 卵巢癌放化療耐藥性相關(guān)lncRNA

多數(shù)卵巢癌患者放化療后期均會(huì)出現(xiàn)不同程度的耐藥現(xiàn)象,導(dǎo)致治療效果欠佳。研究發(fā)現(xiàn),順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞中HOXA11-AS 基因表達(dá)顯著上調(diào),qRT-PCR、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法敲除HOXA11-AS 基因可導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞周期的停滯,誘導(dǎo)晚期凋亡和自噬,進(jìn)一步增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,自噬調(diào)節(jié)因子P62、Beclin1和LC3的水平發(fā)生變化可影響卵巢癌患者的進(jìn)展及預(yù)后[27]。Lin C等[28]發(fā)現(xiàn)ACTA2-AS1在順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞和組織中表達(dá)增加,利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除ACTA2-AS1可降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥,雙熒光素酶報(bào)告基因分析、CCK-8、Elisa分析表明ACTA2-AS1的低表達(dá)可增強(qiáng)miR-378a-3p的表達(dá),并觀察到卵巢癌細(xì)胞中Wnt5a顯著增加,最終確定lncRNA ACTA2-AS1可通過ACTA2-AS1/miR-378a-3p/Wnt5a軸發(fā)揮在卵巢癌細(xì)胞中的順鉑耐藥作用。通過對(duì)包括TCGA數(shù)據(jù)集、癌癥基因組圖譜、11例卵巢癌樣本在內(nèi)的外部數(shù)據(jù)集和39例卵巢癌樣本的內(nèi)部數(shù)據(jù)集篩選出與卡鉑耐藥性相關(guān),且存在差異基因CpG位點(diǎn)(DMP)的基因SNHG12(P<0.05),對(duì)SNHG12進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)下調(diào)SNHG12可增加卵巢癌IGROV1、OVC316和OVCAR8細(xì)胞系對(duì)卡鉑的敏感性,是卵巢癌一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[29]。

3.5 卵巢癌預(yù)后相關(guān)lncRNA

Wang X等[30]從ImmPort數(shù)據(jù)庫(kù)獲取免疫相關(guān)lncRNA,構(gòu)建基于8個(gè)免疫相關(guān)lncRNA的卵巢癌預(yù)后預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)模型,并通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)試集驗(yàn)證模型的穩(wěn)定性,分析1年、3年和5年的預(yù)后預(yù)測(cè)分類效果,得出該預(yù)后預(yù)測(cè)模型可以更好地評(píng)估卵巢癌患者的預(yù)后,還可以評(píng)估高、低風(fēng)險(xiǎn)人群中不同藥物的治療效果。qRT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與正常卵巢組織相比,BC041954在卵巢癌組織中的表達(dá)增加(P<0.001),Kaplan-Meier分析表明BC041954高表達(dá)的患者總體生存期較正常表達(dá)或低表達(dá)的患者顯著降低(P=0.008),且在多變量Logistic回歸分析中,BC041954基因的高表達(dá)為卵巢癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[26]。Nie X等[31]使用最優(yōu)密度算法確定TCGA-OV數(shù)據(jù)集及21個(gè)N6甲基腺苷(m6A)相關(guān)基因表達(dá)譜,確定差異表達(dá)的lncRNA,使用單因素cox回歸分析、LASSO回歸、多因素cox回歸構(gòu)建與卵巢癌患者相關(guān)基于m6A和lncRNA的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型,并利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE26193和GSE9891數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證,證實(shí)基于13個(gè)與m6A相關(guān)lncRNA構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型在預(yù)測(cè)卵巢癌患者的總體生存期中具有良好的能力及穩(wěn)定性。

3.6 與lncRNA有關(guān)的卵巢癌的藥物治療

探索卵巢癌致病分子機(jī)制的目的是為尋找有效的靶向藥物,提升患者的5年生存率。目前,針對(duì)卵巢癌病變過程中l(wèi)ncRNA PVT1的過表達(dá),氯胺酮處理后可顯著降低其表達(dá),通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞周期阻滯、凋亡抑制其克隆形成能力,明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和生存[32];抗瘧原蟲藥物伊維菌素最近發(fā)現(xiàn)可用于抑制卵巢癌的進(jìn)展,濃度20μm～30μm的伊維菌素可通過調(diào)節(jié)lncRNA-EIF4A3-mRNA軸顯著抑制卵巢癌細(xì)胞系的細(xì)胞遷移[33];結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物2(CCAT2)被發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中擴(kuò)增過為頻繁,骨化三醇與維生素D受體(VDR)蛋白相互作用,骨化三醇可抑制CCAT2過表達(dá)從而阻礙與轉(zhuǎn)錄因子TCF4相互作用來激活MYC基因的啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)MYC的表達(dá),從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移[34],維生素D有望成為一種便宜且有效的新型抗卵巢癌藥物。

4 小結(jié)與展望

近年來,越來越多的lncRNA在癌癥中表達(dá)水平存在異常被逐漸探索證實(shí),lncRNA在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞自噬與凋亡、干細(xì)胞維持與分化、胚胎發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用,在不同細(xì)胞類型和物種間的流行度、豐度、生物發(fā)生和生物功能方面的研究取得了重大進(jìn)展[35],但由于基因調(diào)控的復(fù)雜性,其具體的作用機(jī)制仍較為模糊。迄今為止,包括卵巢癌在內(nèi)的多種癌癥病變過程中,lncRNA發(fā)揮的作用正在逐漸被揭露,包括lncRNA參與調(diào)節(jié)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)研究、甲基化研究,是目前的研究熱點(diǎn)。lncRNA的表達(dá)具有組織及細(xì)胞特異性,參與卵巢癌的致癌、抑癌、轉(zhuǎn)移、放化療抗性、診斷、預(yù)后及復(fù)發(fā)的全部過程,探索lncRNA對(duì)卵巢癌的診治具有重要的臨床意義,可用于開發(fā)新療法、新型靶向藥物以及更具有診斷意義和預(yù)后生存評(píng)估的指標(biāo),lncRNA在癌癥研究中的臨床轉(zhuǎn)化會(huì)在未來發(fā)揮更重要的作用。