黃春花

（四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院 教育與體育學(xué)院，四川 自貢 643000）

0 引 言

枸杞作為我國目前最常使用的一種名貴中藥材，具有清熱、名目等功效。在枸杞中，最主要的活性成分為枸杞多糖。因此，對枸杞中的多糖含量進(jìn)行測定是檢驗(yàn)枸杞藥用性能的重要方式，但目前采用的傳統(tǒng)測定方法測定的準(zhǔn)確度不高，尋找一種更適合的枸杞多糖檢測方法是目前研究的熱點(diǎn)。對此，王梓軒通過建HPAEC-PAD 法對枸杞多糖含量進(jìn)行測定，解決了傳統(tǒng)方法測定枸杞多糖含量時(shí)，分離效果不佳和靈敏度低的問題，但該方法對檢測條件的要求高，難以進(jìn)行普及[1]。頡東妹則通過建立微波消解-離子色譜法測定枸杞多糖含量及組成。結(jié)果表明，該方法能有效縮短多糖的消解時(shí)間，快速檢測枸杞內(nèi)多糖含量，但準(zhǔn)確率還有待提高[2-3]?；诖耍驹囼?yàn)嘗試建立凝膠滲透色譜（GPC）法對枸杞內(nèi)多糖含量進(jìn)行測定，從而為枸杞內(nèi)多糖含量的測定提供一種新的參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與設(shè)備

主要材料：枸杞粉（標(biāo)準(zhǔn)品 聯(lián)峰生物科技）；硫酸鈉（AR 邦澤化工）；無水乙醇（啟源化工）；磷酸二氫鉀（AR 鑫勝化工）。

主要設(shè)備：TGL16M 型離心機(jī)（凱特儀器）；SHJ-6 型恒溫水浴鍋（捷呈儀器）；101 型烘箱（華恒試驗(yàn)儀器）；TSKgel G5000 PWXL 色譜柱、TSKgel G5000 PWXL 色譜柱（東曹（上海）生物科技有限公司）;PL-GPC50 型凝膠色譜儀（獅山輝研測試）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

（1）將3 g 枸杞粉按照一定料液比溶于熱水中，然后在SHJ-6 型恒溫水浴鍋的作用下保持一定溫度進(jìn)行浸提。

（2）對混合物以3000 r/min 的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心處理20 min。離心結(jié)束后取溶液上清液，放入3 倍體積的無水乙醇，然后放入冰箱進(jìn)行冷凍沉淀，冷凍溫度和時(shí)間分別為4 ℃和6 h。

（3）按照步驟（2）同等的離心條件再次進(jìn)行離心處理，然后將上清液去除后，在60 ℃的烘箱內(nèi)低溫烘干，最后用去離子水定容至100 mL 容量瓶中，測定枸杞多糖。

1.2.2 GPC 檢測方法

將TSKgel G5000 PWXL 色譜柱與 TSKgel G5000 PWXL 色譜柱串聯(lián)，然后在一定流速條件下將20 μL 待測液泵進(jìn)色譜柱中進(jìn)行枸杞多糖分析，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.3 性能分析

1.3.1 多糖含量

多糖含量的計(jì)算表達(dá)式為：

式中，X：樣品多糖含量，%；V：多糖定容體積，mL；P：比色樣液稀釋倍數(shù)；K1、K2：分別為樣液、0.02 mg/mL 葡萄糖標(biāo)液吸光值；M：樣品的質(zhì)量。

1.3.2 線性關(guān)系考察

通過對不同濃度的標(biāo)液進(jìn)行測試并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]。

1.3.3 檢測限和定量限

通過GPC 色譜柱對稀釋后的葡聚糖標(biāo)液進(jìn)行檢測，得到基線噪聲值，以3 倍信噪比為檢測限，以10 倍信噪比為定量限[5-6]。

1.3.4 穩(wěn)定性

通過同一操作人員每隔4 h 進(jìn)行檢測和不同操作人員進(jìn)行檢測，確定該方法的出峰時(shí)間和峰面積，進(jìn)而表征方法的穩(wěn)定性[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 浸提溫度優(yōu)化

圖1 為浸提溫度的影響。由圖1 可知，待測液內(nèi)的多糖含量隨浸提溫度的升高而增加。這是因?yàn)殍坭絻?nèi)的多糖為不同聚合程度的混合物，其中除親水率較高的分子外，還存在疏水性的大分子多聚物，這些多聚物在溶液中易形成無規(guī)則線團(tuán)，分子與分子間的碰撞增加，增加了溶液黏度，在溶液中表現(xiàn)為凝膠狀態(tài)，這就降低了該類分子的溶解度[8-9]。當(dāng)體系溫度增加，水分子的流動(dòng)性也隨之增加，這就增大了大分子多糖的溶解度，因此提取出來的多糖含量也較高。因此，浸提溫度選擇為100℃。

2.1.2 浸提時(shí)間的優(yōu)化

圖2 為浸提時(shí)間優(yōu)化結(jié)果。由圖2 可知，浸提4h 時(shí)，浸提液中多糖含量最高。出現(xiàn)這個(gè)變化的主要原因在于，枸杞中含有的部分多糖溶解速度較慢，需要較長的時(shí)間才能在水中溶解，因此浸提液中多糖含量隨浸提時(shí)間的增加，也在緩慢增加。但過長的浸提時(shí)間會(huì)導(dǎo)致浸提液體系內(nèi)蛋白質(zhì)等可溶物質(zhì)含量過多，進(jìn)而對多糖的溶解產(chǎn)生抑制作用，使得浸提液體系內(nèi)的多糖含量有一定下降[10]。因此，選擇適合的浸提時(shí)間為4 h。

圖2 浸提時(shí)間優(yōu)化結(jié)果Fig. 2 The optimization results of extraction time

2.1.3 浸提料液比優(yōu)化

圖3 為料液比優(yōu)化結(jié)果。由圖3 可知，當(dāng)料液比為1∶30 時(shí)，浸提液內(nèi)多糖含量最高。這是因?yàn)?，料液比的增加，使得溶劑水的用量隨之增加，這就增加了多糖在溶液中的飽和容量，可以提取出更多的枸杞多糖。但枸杞中可溶解的多糖數(shù)量有限，當(dāng)料液比過大，溶劑水的用量過多，單位體積溶劑水內(nèi)含有的多糖量有一定下降[11-12]。同時(shí)，過多的溶劑水會(huì)對后續(xù)濃縮工藝產(chǎn)生影響，因此在提取過程中，選擇適合的料液比為1∶30。

圖3 料液比優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 The optimization result of ratio of material to liquid

2.1.4 浸提次數(shù)的影響

圖4 為浸提次數(shù)優(yōu)化結(jié)果。由圖4 可知，浸提3次浸提液內(nèi)的多糖含量最多。出現(xiàn)這個(gè)變化的原因與料液比對提取液內(nèi)多糖含量的影響一致，過多的浸提次數(shù)反而對提取枸杞內(nèi)的多糖產(chǎn)生不良影響。因此可認(rèn)定適合的浸提次數(shù)為3 次。

圖4 浸提次數(shù)優(yōu)化結(jié)果Fig. 4 The optimization results of extraction times

2.2 方法檢測條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相優(yōu)化

通過GPC 檢測枸杞內(nèi)多糖含量時(shí)，流動(dòng)相的選擇是影響數(shù)據(jù)的關(guān)鍵因素。本試驗(yàn)選擇Na2SO4和KH2PO4、水作為流動(dòng)相，濃度均為0.02 mol/L），觀察不同流動(dòng)相的影響，結(jié)果見圖5。由圖5 可知，以純凈水作為GPC 流動(dòng)相時(shí)，基線漂移，分離效果不理想，當(dāng)水流速為0.6 mL/min 時(shí)，產(chǎn)生的柱壓明顯高于規(guī)定柱壓，因此不考慮純凈水作為流動(dòng)相。而KH2PO4和Na2SO4流動(dòng)相產(chǎn)生的色譜圖峰的個(gè)數(shù)和峰型沒有太大的差別，但KH2PO4的柱壓相對較低，同時(shí)基線也更為平整，這就說明以KH2PO4作為流動(dòng)相時(shí)，表現(xiàn)出更好的分離效果，因此在后續(xù)試驗(yàn)中，選擇0.02 mol/L 的KH2PO4作為流動(dòng)相。

圖5 流動(dòng)相優(yōu)化結(jié)果Fig. 5 The optimization results of mobile phase

2.2.2 流速的優(yōu)化

流動(dòng)相流速的優(yōu)化見圖6。由圖6 可知，兩種流速條件下產(chǎn)生的色譜圖峰峰面積和峰型沒有太大差別，僅在出峰時(shí)間上有一些差異。當(dāng)流速為0.6 mL/min 時(shí)，出峰時(shí)間明顯較短，則檢測分析時(shí)間越短，檢測效率越高[13-14]，因此選擇流速為0.6 mL/min。

圖6 流速優(yōu)化結(jié)果Fig. 6 The optimization results of flow rate

2.2.3 柱溫的優(yōu)化

柱溫也是影響GPC 色譜柱檢測的重要因素，根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)，選擇35 ℃和40 ℃柱溫條件進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖7。由圖7 可知，在兩種柱溫條件下，得到的色譜圖峰型基本一致，也就是說在這兩種柱溫條件并不對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響?？紤]柱溫對檢測柱使用壽命的影響，選擇適合的柱溫為35 ℃。

圖7 柱溫優(yōu)化結(jié)果Fig. 7 The optimization results of column temperature

2.3 方法考查

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

圖8 為方法標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖8 可知，多糖含量測定與線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2超過0.99，枸杞多糖含量檢測與線性回歸方程表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，可以用該方法進(jìn)行枸杞多糖含量檢測。

圖8 多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 8 The standard curve of polysaccharide content

2.3.2 檢測限和定量限分析

通過GPC 色譜柱對稀釋后的葡聚糖標(biāo)液進(jìn)行檢測，得到基線噪聲值，以3 倍信噪比為檢測限，以10 倍信噪比為定量限，確定檢測限和定量限分別為0.50 μg 和1.67 μg。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

用同一濃度進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣，表征方法的精密度，結(jié)果見表1。由表1 可知，同一樣品重復(fù)進(jìn)樣5次后，出峰時(shí)間與峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.08%和2.28%，表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性和精密度。

表1 精密度測試結(jié)果Table 1 The precision test results

2.4 實(shí)際樣品檢測

圖9 為實(shí)際樣品測試結(jié)果。由圖9 可知，同一時(shí)期不同產(chǎn)地的枸杞和同一產(chǎn)地不同時(shí)期的枸杞，其含有的多糖含量也不一致，其中寧夏秋果的多糖含量最高，約為5.5%，青海夏果的多糖含量最低，約為3.2%，與相關(guān)文獻(xiàn)測試的枸杞多糖含量一致，這就說明GPC 檢測結(jié)果符合實(shí)際情況，可以用于枸杞多糖含量的檢測[15]。

圖9 實(shí)際樣品檢測結(jié)果Fig. 9 The test results of actual samples

3 結(jié) 論

通過以上研究，得到以下結(jié)論：

（1）樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化結(jié)果為：浸提溫度為100 ℃；浸提時(shí)間為4 h；浸提料液比為1∶30；浸提次數(shù)為3 次。

（2）GPC 檢測優(yōu)化結(jié)果為：選擇0.02 mol/L 的KH2PO4作為流動(dòng)相；流速為0.6mL/min；柱溫為35℃。

（3）檢測方法驗(yàn)證結(jié)果為：干擾物質(zhì)的色譜峰位置均在保留時(shí)間38 min 左右，而葡聚糖標(biāo)液色譜峰為16~31 min 間。這就說明多糖與干擾物質(zhì)可以很好的分離；線性方程與枸杞多糖含量相關(guān)系數(shù)R2超過0.99，檢測限和定量限分別為0.50 μg 和1.67 μg，同人操作和不同人操作的出峰時(shí)間RSD分別為0.03%和0.02，峰面積RSD 分別為3.48%。和2.5%。重復(fù)進(jìn)樣后，出峰時(shí)間與峰面積的RSD 分別為0.08%和2.28%，表現(xiàn)出良好檢測性能。

（4）寧夏秋果的多糖含量最高，約為5.5%，青海夏果的多糖含量最低，約為3.2%，與相關(guān)文獻(xiàn)測試的枸杞多糖含量一致，這就說明GPC 檢測結(jié)果符合實(shí)際情況。