趙威 魏廣友

1安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院 安徽淮南 232000;2亳州市人民醫(yī)院兒科

幼年皮肌炎(juvenile dermatomyositis,JDM)是一種罕見的慢性自身免疫性疾病,是特發(fā)性炎癥性肌病之一。本病發(fā)病于兒童期,又稱為兒童皮肌炎,發(fā)病率約為2.5/100萬,患病率為2.5/10萬［1］,平均發(fā)病年齡為81.97個月,以女童為主［2］。JDM特征是對稱性近端肌肉無力,血清肌酶濃度升高,以及病理性皮疹［1］。JDM皮膚病表現(xiàn)出更大的活動性,比肌肉病更難治療,并且兒童鈣質(zhì)沉著癥和潰瘍的風(fēng)險較高［3］。JDM可導(dǎo)致嚴重的后遺癥,包括營養(yǎng)不良性鈣化、持續(xù)性皮膚炎癥和功能受限的器官受累［4］。有研究表明,皮肌炎診斷后5年內(nèi)發(fā)生腫瘤的風(fēng)險很高,26%～70%的患兒在診斷皮肌炎后1年內(nèi)發(fā)生腫瘤［5］。然而,JDM發(fā)病機制在很大程度上仍然是未解之謎,包括易感基因、環(huán)境應(yīng)激源、免疫和非免疫介導(dǎo)機制在內(nèi)的一系列因素,被認為可能與JDM的發(fā)病機制有關(guān)［6］。

近幾年,隨生物信息學(xué)發(fā)展,探索基因表達譜在疾病發(fā)病機制中的作用是一種有效的方法。JDM隊列的基因表達譜和臨床信息從NCBI基因表達綜合數(shù)據(jù)庫［7］下載(GEO;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。此外,為了確定與JDM相關(guān)的中樞基因,對患者和健康對照樣本中的差異表達基因( differentially expressed gene,DEG)進行了比較。免疫系統(tǒng)參與疾病發(fā)展已為人所知多年,JDM由自身免疫結(jié)締組織病變引起的,因此,本研究試圖通過生物信息與免疫分析鑒定JDM的相關(guān)基因,把免疫系統(tǒng)分為免疫細胞和免疫功能兩部分,并使DEG與其進行免疫評分及相關(guān)性分析,隨后運用PPI網(wǎng)絡(luò)選出hub基因,最后篩選出與免疫最為相關(guān)的基因。運用選出的基因做風(fēng)險列線圖、預(yù)測模型及驗證,從而探索相關(guān)基因在診斷及治療JDM的潛在價值［8］。

1 對象與方法

1.1研究對象 GEO是目前全球最大最全面的公開可用的基因表達數(shù)據(jù)庫,保存著世界各國研究機構(gòu)上傳的高通量測序數(shù)據(jù)。在本研究中,通過替代變量分析方法將兩個數(shù)據(jù)集(GSE11083和GSE11971)合并為一個集成數(shù)據(jù)集,來消除批次差異。GSE11083使用GPL570平臺(基于:Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)生成,GSE11971使用GPL96平臺(基于:Affymetrix Human Genome U133A Array)生成。另外一組數(shù)據(jù)集GSE100152使用GPL6884平臺(基于:Illumina HumanWG-6 v3.0 expression beadchip)生成,用來進行預(yù)測模型的驗證。GSE11083數(shù)據(jù)集包括28例健康對照兒童血液樣本和27例JDM患者血液樣本。GSE11971數(shù)據(jù)集包括4例健康對照兒童肌肉組織樣本和19例JDM患者肌肉組織樣本。GSE100152數(shù)據(jù)集包括9例健康對照兒童血液樣本和40例JDM患者血液樣本。所有數(shù)據(jù)集樣本年齡均<18歲,且符合 1975年 Bohan / Peter提出的多發(fā)性肌炎、皮肌炎診斷標準［9］。

1.2研究方法

1.2.1差異基因的篩選 數(shù)據(jù)集GSE11083和GSE11971在R軟件中進行預(yù)處理,包括背景校準、歸一化和log2轉(zhuǎn)換。如果預(yù)處理多個探針對應(yīng)于共同基因,則使用平均值當(dāng)做相應(yīng)的表示值。此外,Bioconductor的替代變量分析(SVA)軟件包用于消除批次效應(yīng)。然后,運用Limma軟件包選擇篩選JDM和健康對照兒童之間的DEG,并設(shè)置DEGs的倍數(shù)變化| log2Fold change(FC)|>1和P值<0.05為篩選條件。最后,分別使用 R語言pheatmap軟件包和gglot軟件包繪制熱圖和火山圖。

1.2.2ssGSEA計算免疫評分 單樣本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA)。首先對上述所得DEG進行秩次標準化,然后利用經(jīng)驗累積分布函數(shù)計算富集分數(shù)(ES)。運用R語言GSVA包實現(xiàn)ssGSEA分析,即可得到每個樣本基于ssGSEA算法的基因集。結(jié)合免疫細胞與免疫功能的數(shù)據(jù)分析,使用R語言pheatmap軟件包繪制數(shù)據(jù)集與免疫細胞及免疫功能的熱圖。

1.2.3疾病組與正常組之間免疫評分的差異分析 首先對疾病組樣本與對照組樣本進行免疫細胞之間的差異性分析,然后再進行免疫功能之間的差異性分析。P<0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義,使用ggpubr軟件包比較和可視化JDM和對照樣本之間14個免疫細胞的水平,13個免疫功能的水平。

1.2.4PPI網(wǎng)絡(luò)及篩選Hub基因 使用檢索相互作用基因數(shù)據(jù)庫(String)的搜索工具(版本11.5;www.String-db.org)［10］和最小相互作用分數(shù)構(gòu)建DEG的PPI相互作用網(wǎng)絡(luò),≥ 0.4定義為截止值。通過Cytoscape可視化PPI網(wǎng)絡(luò),最后運用cytoHubba插件中的MCC算法來篩選10個Hub基因［11］。

1.2.5篩選免疫最相關(guān)基因 上述方法選出10個Hub基因,運用ggcorrplot軟件包,使其與免疫細胞及免疫功能進行相關(guān)性熱圖分析,最后篩選出5個與免疫最為相關(guān)的基因。

1.2.6構(gòu)建預(yù)測模型與模型驗證 利用上述步驟選出的5個與免疫最相關(guān)基因構(gòu)建預(yù)測模型,使用rms軟件包建立疾病與5個基因的列線圖來預(yù)測發(fā)病風(fēng)險,并利用校準曲線評估列線圖的可靠性。使用ROCR軟件包分別繪制出整體和單獨5個基因與JDM的ROC曲線圖來預(yù)測診斷價值,并計算出ROC曲線下面積(Area under the ROC,AUC)及其95%可信區(qū)間。選取另外一組獨立數(shù)據(jù)集GSE100152用于預(yù)測模型的驗證。再次使用上述5個基因,通過ROCR軟件包繪制整體和單獨5個基因ROC曲線,并計算出AUC及其95%可信區(qū)間。AUC越大,說明預(yù)測性能越好。

2 結(jié)果

2.1DEGs的篩選鑒定 將GSE11083和GSE11971兩個數(shù)據(jù)集結(jié)合起來,以消除批量效應(yīng),共獲得29個基因差異表達,其中22個基因上調(diào),7個基因下調(diào)。前5位上調(diào)基因為ISG15、IFIT5、IFI44L、OAS2和LGALS3BP,前5位下調(diào)基因是(EIF1AY)、DDX3Y, USP9Y, KDM5D, RPS4Y1。DEGs的熱圖和火山圖見圖1。

圖1 DEGs的熱圖和火山圖

2.2ssGSEA算法計算免疫評分 使用ssGSEA來評估免疫與基因之間的關(guān)聯(lián),計算出的29個DEG與14種免疫細胞以及13種免疫功能的相關(guān)性熱圖,見圖2。

圖2 DEG與免疫細胞及免疫功能分析熱圖

2.3免疫評分的差異分析 免疫細胞的差異分析箱型圖顯示,與對照組相比,JDM患者的激活樹突狀細胞(activate dendritic cells,aDCS)表達水平較高,見圖3。免疫功能的差異分析箱型圖顯示,與對照組相比,JDM患者的樹突狀細胞的抗原提呈細胞(antigenpresentingcell,APC)、非經(jīng)典炎癥(Parainflammation)、I型干擾素反應(yīng)(T1- IFN),這三種免疫功能表達水平較高,見圖4。

圖3 JDM與對照組的免疫細胞差異分析

圖4 JDM與對照組的免疫功能差異分析

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)及篩選Hub基因 去除孤立節(jié)點后,構(gòu)建了由25個節(jié)點和84條邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò),由Cytoscape可視化PPI網(wǎng)絡(luò),見圖5。PPI網(wǎng)絡(luò)中通過MCC算法得到的10個DEG被定義為hub基因,分別為IFI27、IFIT3、IFI44L、ISG15、IFIT1、MX1、MX2、OAS2、OAS1、GBP1,見圖6。

圖5 DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖6 PPI網(wǎng)絡(luò)的Hub基因

2.5篩選免疫最相關(guān)基因 由上述選出的10個Hub基因,根據(jù)與免疫相關(guān)性,最終篩選出5個最為相關(guān)的基因,分別為GBP1、IFIT1、IFIT3、OAS2、MX2,見圖7。

圖7 10個Hub基因與免疫細胞及免疫功能的相關(guān)性

2.6構(gòu)建預(yù)測模型與驗證 隊列中基因的列線圖表明模型具有較高的發(fā)病率,見圖8A;列線圖校準曲線在該隊列中顯示出良好的一致性,見圖8B。ROC曲線整體預(yù)測模型的AUC為0.825(95%CI:0.730～0.920)。各基因AUC分別為:GBP1為0.783(95%CI:0.677～0.889)、IFIT1為0.757(95%CI:0.648～0.866)、IFIT3為0.733(95%CI:0.621～0.845)、OAS2為0.790(95%CI:0.692～0.888)、MX2為0.773(95%CI:0.671～0.874),見圖8C。通過另一組樣本驗證整體模型的AUC為0.889(95%CI:0.758～1.000),單各基因的AUC分別為:GBP1為0.622(95%CI:0.471～0.773)、IFIT1為0.467(95%CI:0.296～0.638)、IFIT3為0.486(95%CI:0.314～0.658)、OAS2為0.828(95%CI:0.659～0.996)、MX2為0.535(95%CI:0.347～0.722),見圖8D。最終得出OAS2基因可能具有較高的預(yù)測診斷價值。

圖8 預(yù)測模型與驗證圖

3 討論

JDM由自身免疫結(jié)締組織病變引起,通常包括自身抗體陽性和免疫異常等疾病,其特征是皮膚損傷、肌痛或及進行性肌肉無力,導(dǎo)致嚴重的皮疹,其并發(fā)癥甚至可能危及生命。然而,JDM的確切發(fā)病機制尚未明確描述。在本研究中我們通過2個數(shù)據(jù)集進行整合后,得到JDM的差異基因。運用DEGs與免疫細胞及免疫功能做相關(guān)性分析,得出DCS、APC、T1-IFN及非典型炎癥有較強的差異性。通過PPI網(wǎng)絡(luò)選出10個hub基因,運用hub基因再次篩選出與免疫最相關(guān)的5個關(guān)鍵基因:GBP1、IFIT1、IFIT3、OAS2、MX2,所繪制列線圖表明模型具有較高的發(fā)病率。且校準圖顯示具有良好的一致性。通過預(yù)測模型及驗證分析,最后認為OAS2基因可能具有較高診斷JDM的潛在價值。

JDM是一種具有干擾素(IFN)特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,發(fā)病機制及其干擾素特征的病因尚不清楚［12］。有研究表明該機制可能通過干擾素途徑引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的上調(diào)［13］。Brian等［1］研究學(xué)者發(fā)現(xiàn),肌肉和外周血中I型干擾素(α)誘導(dǎo)的DCS基因上調(diào)似乎是疾病發(fā)病的核心?？?MDA5抗體陽性的JDM在血清和受損皮膚中表現(xiàn)出高T1-IFN特征。MDA5抗體陽性DM患者血清和血管中的高T1-IFN特征表明,T1-IFN可能在這些患者的血管病變中起重要作用［14］。Emily等［15］發(fā)現(xiàn)JDM的外周血單核細胞中I型干擾素信號增加;Roberson等［16］研究發(fā)現(xiàn),臨床上JDM患者的外周血單核細胞具有持續(xù)的免疫激活作用,并富含IL-1信號,JDM皮膚和肌肉都顯示了I型干擾素激活的證據(jù),以及與抗原提呈和細胞呼吸基因表達降低相關(guān)的基因。血液中的I型干擾素途徑標志性生物標記物與JDM患者的皮膚皮肌炎病區(qū)和嚴重程度指數(shù)評分高度相關(guān)［17］。結(jié)合我們所得到的免疫功能分析顯示,JDM樣本與健康組樣本中I型干擾素差異有統(tǒng)計學(xué)意義。綜上表明T1-IFN可能是JDM的潛在特異性分子途徑。

OAS2即寡腺苷酸合成酶2,其屬于OAS基因家族。OAS2是一個核苷酸結(jié)合的寡聚結(jié)構(gòu)域,包含蛋白質(zhì)2(NOD2)結(jié)合伙伴,導(dǎo)致RNAse-L活性增強,提示OAS2和其他先天免疫信號通路之間可能存在必要相關(guān)性［18］。干擾素誘導(dǎo)的雙鏈RNA激活酶是OAS蛋白。OAS基因家族的表達在JDM中受到高度調(diào)節(jié),類似于對dsRNA病毒感染的免疫反應(yīng),有研究報道發(fā)現(xiàn)JDM肌肉活檢增加了OAS家族基因的表達,特別是OAS1、OAS2、OAS3和OAS4［19］。較早有研究表明過度角化的細胞可能是皮肌炎患者皮損形成的原因,其中OAS基因可能激活一種凋亡細胞死亡機制［20］。同時,Ouyang等［21］研究發(fā)現(xiàn),JDM的所有OAS基因都受到調(diào)節(jié),并且99%的OAS基因家族網(wǎng)絡(luò)顯著上調(diào)。因此,篩選的OAS2基因可能為JDM的一個重要發(fā)病基因。

綜上所述,本研究通過生物信息聯(lián)合免疫分析鑒定了OAS2基因可能成為JDM診斷的生物標記物及潛在的治療靶點,并提出T1-IFN可能是調(diào)節(jié)JDM的潛在分子途徑。此次研究為JDM發(fā)病機制的探索提供新的思路,并且可能挖掘出相關(guān)基因在診斷及治療JDM的潛在價值。然而,該研究存在一些局限性。首先,我們只關(guān)注了免疫分析相關(guān)的基因,可能忽略了其他與JDM相關(guān)的潛在基因。此外,本研究是基于生物信息分析與解讀,還需體內(nèi)外實驗來進一步驗證。