孫 弦 劉 睿 高 虎 胡 珍 吳 庭

(武漢市第三醫(yī)院皮膚科,湖北省武漢市 430000)

馬爾尼菲籃狀菌病(Talaromycesmarneffeidisease,TSM)常見(jiàn)于免疫功能低下人群,尤其是艾滋病患者。有報(bào)告顯示,在廣西艾滋病合并馬爾尼菲籃狀菌感染患者約占全部艾滋病患者的20%[1]。但近年來(lái)TSM在正常人群中的發(fā)病率逐漸增高[2]。TSM起病初期無(wú)顯著特征,容易漏診、誤診,而該病的病死率達(dá)80%及以上[3],早期診斷、早期治療可降低該病的病死率。目前對(duì)馬爾尼菲籃狀菌的檢測(cè)方法主要以免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)為主,但真菌的抗原弱,且機(jī)體的免疫狀態(tài)影響抗體的產(chǎn)生,導(dǎo)致其診斷的準(zhǔn)確性不高。研究表明,馬爾尼菲籃狀菌的實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)擴(kuò)增產(chǎn)物與Pm3雜交有較高的特異性,PCR技術(shù)診斷馬爾尼菲籃狀菌具有較高的敏感度及特異度[4]。序列特異性核酸體外擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)是一種新型的RNA擴(kuò)增技術(shù),可在短時(shí)間內(nèi)迅速擴(kuò)增RNA,且無(wú)需特殊檢測(cè)儀器[5]。本研究探討NASBA與RT-qPCR技術(shù)對(duì)馬爾尼菲籃狀菌的檢測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 樣本來(lái)源 收集2017年12月至2020年1月我院收治的40例HIV陰性TSM患者的臨床資料,其中男性27例、女性13例,年齡24～53(43.24±11.24)歲,所有患者均存在肩部病灶。40例患者中,合并β型地中海貧血8例,臨床表現(xiàn)為右髖關(guān)節(jié)痛2例、發(fā)熱3例、脛骨前皮膚出現(xiàn)膿點(diǎn)1例、右上肢皮膚圓形紅斑2例,TSM確診依據(jù)為血培養(yǎng)陽(yáng)性;合并分枝桿菌感染7例,臨床表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、氣喘4例,四肢、軀干散在皮疹2例,皮疹伴脫屑1例,TSM確診依據(jù)為血培養(yǎng)陽(yáng)性;合并分枝桿菌/敗血癥感染患者8例,臨床表現(xiàn)為胸痛1例、發(fā)熱2例、咳嗽2例、皮疹3例,TSM確診依據(jù)為血培養(yǎng)陽(yáng)性;合并肺結(jié)核感染者1例,臨床表現(xiàn)為慢性咳嗽、咳痰急性加重,TSM確診依據(jù)為血培養(yǎng)陽(yáng)性;16例患者無(wú)合并感染,臨床表現(xiàn)為全身紅斑、丘疹6例,紅色丘疹、小結(jié)節(jié)7例、發(fā)熱2例,以及發(fā)熱伴咳嗽、咳痰、淋巴結(jié)腫大1例,TSM確診依據(jù)為皮疹培養(yǎng)陽(yáng)性13例、臨床診斷陽(yáng)性3例。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 提取病理組織RNA:采集患者肩部病灶組織樣本,加入1 200 μL無(wú)水乙醇,震蕩后以3 000 r/min離心5 min,棄上清液,用乙醇清洗沉淀物后于常溫孵育至乙醇全部蒸發(fā),然后加入180 μL組織裂解緩沖液。嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司,批號(hào):wlb1384)說(shuō)明書提取RNA,置于-80 ℃冰箱備用。

表1 引物和探針序列

1.2.3 NASBA檢測(cè):取1.2.1提取的RNA。NASBA擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表2。利用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成引物,按照NASBA Lyophilized試劑盒[普瑞麥迪(北京)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司,批號(hào):LEM-5]說(shuō)明書解凍反應(yīng)緩沖液,混勻后裝入PCR管。取10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL, 與2 μL 無(wú)菌去離子水混勻后裝入PCR管, 再加入2 μL RNA模板。放入ABI7500型定量PCR(Applied Biosystems公司),65 ℃反應(yīng)2 min、41 ℃反應(yīng)10 min后,每個(gè)PCR管中加入預(yù)冷的凍干酶混合液5 μL,混勻后41 ℃繼續(xù)反應(yīng)90 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。RT-qPCR與NASBA檢測(cè)方法的詳細(xì)參數(shù)見(jiàn)表3。

表2 引物序列

表3 RT-qPCR與NASBA檢測(cè)方法參數(shù)的對(duì)比

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。真菌載量拷貝數(shù)以對(duì)數(shù)值(log/mL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);采用Pearson檢驗(yàn)分析兩種方法檢測(cè)TSM患者真菌載量的相關(guān)性,采用Bland-Altman法分析兩種方法檢測(cè)TSM患者真菌載量的一致性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RT-qPCR、NASBA檢測(cè)TSM患者馬爾尼菲籃狀菌載量的比較 RT-qPCR檢測(cè)的真菌載量為3.24～6.18(5.24±0.67)log/mL,NASBA檢測(cè)的真菌載量為3.01～6.62(5.33±0.87)log/mL,兩種方法檢測(cè)的真菌載量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.518,P=0.606)。其中1例TSM患者的真菌載量用RT-qPCR方法和NASBA方法檢測(cè)分別為6.09 log/mL和4.74 log/mL,差值為1.35 log/mL。

2.2 RT-qPCR、NASBA檢測(cè)TSM患者馬爾尼菲籃狀菌載量的相關(guān)性分析 RT-qPCR與NASBA兩種方法檢測(cè)的真菌載量呈正相關(guān)(r=0.582,P=0.008)。

2.3 RT-qPCR、NASBA檢測(cè)TSM患者馬爾尼菲籃狀菌載量的一致性分析 以兩種方法檢測(cè)的真菌載量均值為橫軸,以差值為縱軸做Bland-Altman圖,見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示,全部數(shù)據(jù)差值為(-0.18±0.88)log/mL,95%一致性界限為(-0.88,0.88)log/mL,95%一致性界限內(nèi)存在90%(36/40)的點(diǎn),提示兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性。

圖1 Bland-Altman圖

2.4 RT-qPCR 、NASBA技術(shù)方法學(xué)的對(duì)比 在馬爾尼菲籃狀菌載量為2.81×1010拷貝/μL時(shí)NASBA可測(cè)出目的片段,而RT-qPCR隱約能看到條帶,提示 NASBA 的靈敏度稍高,見(jiàn)圖2。

圖2 RT-qPCR、NASBA檢測(cè)靈敏度的對(duì)比

3 討 論

馬爾尼菲籃狀菌侵入機(jī)體后引起機(jī)體感染,可影響機(jī)體內(nèi)多個(gè)器官的功能,導(dǎo)致TSM,其常見(jiàn)癥狀為發(fā)熱、淋巴結(jié)及肝臟腫大、呼吸道異常等。由于該病初期無(wú)特異性特征,因此確診困難,影響治療效果[6]。研究表明,TSM患者的病理改變與機(jī)體免疫功能關(guān)系密切,免疫功能正常的馬爾尼菲籃狀菌感染者體內(nèi)馬爾尼菲籃狀菌的數(shù)量較少,主要表現(xiàn)為炎性肉芽腫等,而免疫功能低下的患者體內(nèi)存在大量馬爾尼菲籃狀菌,表現(xiàn)為無(wú)菌性壞死[7-9]。目前,主要以基于血標(biāo)本、活檢組織等樣本的真菌涂片和培養(yǎng)作為診斷TSM的金標(biāo)準(zhǔn),以病理學(xué)檢查、血清學(xué)檢測(cè)為輔助診斷方法[10-11]。由于TSM患者的病理特征與臨床特點(diǎn)與結(jié)核分枝桿菌、莢膜組織胞漿菌較為相近,因此鑒別診斷困難。同時(shí),馬爾尼菲籃狀菌與莢膜組織胞漿菌在感染組織中的形態(tài)、大小、染色相似,須進(jìn)行真菌培養(yǎng)才可鑒別,但真菌培養(yǎng)的時(shí)間較長(zhǎng),導(dǎo)致患者的診斷時(shí)間延長(zhǎng),延誤治療[12-13]。血清半乳甘露聚糖試驗(yàn)是診斷TSM的常用方法之一,具有便捷、快速、無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn),但其敏感性低,容易受多種因素影響而出現(xiàn)假陽(yáng)性與假陰性的結(jié)果[14]。因此,尋找高效、便捷的診斷方法,以提高TSM的診斷準(zhǔn)確性具有重要的臨床意義。

RT-qPCR與NASBA均屬于靶核酸擴(kuò)增技術(shù)。RT-qPCR檢測(cè)主要是在PCR的反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè),最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行分析,該方法具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。有研究表明,RT-qPCR可有效地診斷由結(jié)核分枝桿菌感染、曲霉菌感染等疾病[15-16]。NASBA是以RNA為模板的一種酶促反應(yīng)過(guò)程,可實(shí)時(shí)觀察診斷結(jié)果[17]。雖然兩種方法檢測(cè)馬爾尼菲籃狀菌載量的下限不同,但均可準(zhǔn)確地檢測(cè)載量在50～1 000拷貝/mL范圍內(nèi)的樣本[18]。鄭艷青等[19]的研究結(jié)果顯示,RT-qPCR能高效檢測(cè)出皮膚病理組織及淋巴結(jié)活檢組織中馬爾尼菲籃狀菌的載量,對(duì)馬爾尼菲籃狀菌感染的診斷有一定的價(jià)值。 嚴(yán)亞軍等[20]發(fā)現(xiàn), 在HIV-1型感染者病毒載量的檢測(cè)中,RT-qPCR與NASBA的檢測(cè)結(jié)果具有較好的相關(guān)性及一致性。本研究同時(shí)采用RT-qPCR、NASBA技術(shù)對(duì)TSM患者的肩部病灶組織進(jìn)行馬爾尼菲籃狀菌載量的檢測(cè),結(jié)果顯示兩種方法檢測(cè)的真菌載量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),且兩種方法檢測(cè)馬爾尼菲籃狀菌的載量呈正相關(guān),并具有較好的一致性,但NASBA的靈敏度稍高,這提示兩種方法均可準(zhǔn)確地檢測(cè)出TSM患者的馬爾尼菲籃狀菌載量,或可用于TSM的診斷。

本研究中,采用RT-qPCR與NASBA技術(shù)檢測(cè)時(shí)有1例患者的真菌載量差值>1個(gè)log/mL,分析原因可能與兩種方法檢測(cè)的靶點(diǎn)不同有關(guān),RT-qPCR的檢測(cè)靶點(diǎn)為馬爾尼菲籃狀菌感染患者的LTR區(qū)域,而NASBA的檢測(cè)靶點(diǎn)為HIV-1 Gag區(qū)域。另外,可能也與患者感染的馬爾尼菲籃狀菌的亞型及序列存在差異,以及RNA提取及擴(kuò)增系統(tǒng)的自動(dòng)化程度有關(guān),RT-qPCR檢測(cè)屬于完全自動(dòng)化,而NASBA為半自動(dòng)化[21-22]。因此,為了保證馬爾尼菲籃狀菌載量檢測(cè)的準(zhǔn)確性,建議檢測(cè)同一患者在不同時(shí)間的真菌載量時(shí)采用同一種技術(shù)。

綜上所述,RT-qPCR與NASBA檢測(cè)HIV陰性TSM患者病灶組織的馬爾尼菲籃狀菌載量具有較好的相關(guān)性及一致性,但在相同的拷貝濃度下NASBA技術(shù)的靈敏度更高。