黃 正 趙瑞強(qiáng) 李 平

(1 天長(zhǎng)市人民醫(yī)院感染科,安徽省天長(zhǎng)市 239321;2 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西南寧市 530021)

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性傳染性疾病,以咳嗽、咯血、潮熱、盜汗及消瘦為主要臨床特征。現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病多由正氣不足,感染癆蟲(chóng),侵蝕肺臟而引起,治療當(dāng)以補(bǔ)虛培元和抗結(jié)核殺蟲(chóng)為原則,根據(jù)患者體質(zhì)強(qiáng)弱區(qū)分治療主次,尤其需要重視補(bǔ)虛培元、增強(qiáng)正氣,以提高患者的抗病能力[1]。一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果表明,中西醫(yī)聯(lián)合治療肺結(jié)核可減少西藥毒副作用,提高患者機(jī)體免疫力,改善患者臨床癥狀[2]。貞芪扶正顆粒的主要有效成分為女貞子、黃芪,具有健脾益氣、滋陰補(bǔ)腎、扶正固本的功效,常用于虛損的治療及化療的輔助治療等。臨床研究表明,貞芪扶正顆粒輔助治療肺結(jié)核可以提高臨床療效[3],然而其作用機(jī)制尚未完全明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度闡釋疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,還能從改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度分析藥物與機(jī)體的相互作用并指導(dǎo)新藥研發(fā),目前已被廣泛應(yīng)用于中藥研究。因此,本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù),探討貞芪扶正顆粒輔助治療肺結(jié)核的作用機(jī)制,以期為肺結(jié)核的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 貞芪扶正顆粒的活性化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索貞芪扶正顆粒中女貞子、黃芪兩味中藥的所有化學(xué)成分,設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%、藥物相似性(drug likeness,DL)>0.18以初步篩選活性化學(xué)成分,然后在該平臺(tái)上檢索活性化學(xué)成分的作用靶點(diǎn),獲得貞芪扶正顆粒的活性化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)[4]。在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org)中,將限定物種設(shè)置為人類,對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)基因名轉(zhuǎn)化。

1.2 肺結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 以“tuberculosis”為檢索詞,在GeneCards?數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genecards.org)中檢索肺結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)[5],檢索日期為建庫(kù)至2021年9月。

1.3 貞芪扶正顆粒治療肺結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)的獲取及其蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的建立 將貞芪扶正顆粒活性化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)與肺結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)上傳至VENNY 2.1平臺(tái)(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html),獲取交集靶點(diǎn),即貞芪扶正顆粒治療肺結(jié)核的相關(guān)靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的貞芪扶正顆?；钚曰瘜W(xué)成分導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,構(gòu)建貞芪扶正顆粒治療肺結(jié)核的“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),利用Centiscape插件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析,獲取度值,將度值排名前5的活性化學(xué)成分作為主要活性化學(xué)成分。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org),獲取其蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)數(shù)據(jù)[6],然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,生成PPI網(wǎng)絡(luò),利用Centiscape插件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析,獲取度值、中介值、特征向量值,選取度值排名前10的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.4 貞芪扶正顆粒治療肺結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)的富集分析 分別利用WebGestalt平臺(tái)(http://www.webgestalt.org/)和KOBAS平臺(tái)(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,GO功能富集分析項(xiàng)目包括生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分。按基因比率由大到小進(jìn)行排序,選取排名前10的條目進(jìn)行展示。

1.5 分子對(duì)接分析 將貞芪扶正顆粒治療肺結(jié)核的“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5的主要活性化學(xué)成分作為配體蛋白,從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載其2D結(jié)構(gòu)。將PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)作為受體蛋白,從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)下載其3D結(jié)構(gòu)[7]。利用Chimera 1.15軟件對(duì)受體蛋白進(jìn)行去水、加氫、去除配體等處理,并尋找其對(duì)接口袋。運(yùn)用AutoDock軟件對(duì)受體蛋白及配體蛋白進(jìn)行分子對(duì)接,獲取結(jié)合能。結(jié)合能越小說(shuō)明結(jié)合活性越大,其中結(jié)合能<-5 kcal/mol表示結(jié)合活性良好,<-7 kcal/mol表示具有結(jié)合活性明顯增強(qiáng)。

2 結(jié) 果

2.1 貞芪扶正顆粒的活性化學(xué)成分及作用靶點(diǎn) 通過(guò)檢索獲得黃芪的化學(xué)成分118個(gè),篩選后得到活性化學(xué)成分20個(gè)及對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)180個(gè);獲得女貞子的化學(xué)成分119個(gè),篩選后得到活性化學(xué)成分13個(gè)及對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)177個(gè)。刪除重復(fù)項(xiàng)后,共得到貞芪扶正顆粒的化學(xué)成分201個(gè),其中活性化學(xué)成分31個(gè)及對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)198個(gè)。

2.2 貞芪扶正顆粒治療肺結(jié)核的相關(guān)靶點(diǎn) 共獲得2 415個(gè)肺結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)。將貞芪扶正顆?；钚曰瘜W(xué)成分的作用靶點(diǎn)與肺結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)取交集后,得到101個(gè)交集靶點(diǎn)。利用交集靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的活性化學(xué)成分構(gòu)建貞芪扶正顆粒治療肺結(jié)核的“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)有125個(gè)節(jié)點(diǎn)及273條邊,見(jiàn)圖1。度值排名前5的活性化學(xué)成分依次是槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、芒柄花素。

圖1 貞芪扶正顆粒治療肺結(jié)核的 “中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 貞芪扶正顆粒治療肺結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) 將101個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),并利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖2),該網(wǎng)絡(luò)包含100個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 448條邊,平均度值為34.48。根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果,選取度值排名前10的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn),包括白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase 1,AKT1)、IL-1β、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9、Caspase-3、原癌基因c-Jun(proto-oncogene c-Jun,JUN)、C-X-C基序趨化因子配體8(C-X-C motif chemokine ligand 8,CXCL8)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG),見(jiàn)表1。

表1 核心靶點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

圖2 貞芪扶正顆粒治療肺結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析結(jié)果 GO功能富集分析共得到3 040個(gè)生物過(guò)程條目、143個(gè)細(xì)胞組分條目、270個(gè)分子功能條目,KEGG通路富集分析共得到178條通路。按基因比率由大到小進(jìn)行排序,選取排名前10的條目進(jìn)行展示。生物過(guò)程條目包括機(jī)械刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程等,細(xì)胞組分條目包括細(xì)胞膜、細(xì)胞核、膜封閉管腔等,分子功能條目包括蛋白質(zhì)結(jié)合、核苷酸結(jié)合、離子結(jié)合等,見(jiàn)圖3。KEGG信號(hào)通路包括IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號(hào)通路、利什曼病、Th17分化通路等,見(jiàn)圖4。

圖3 GO功能富集分析氣泡圖

圖4 KEGG信號(hào)通路富集分析炫圖

2.5 分子對(duì)接分析結(jié)果 將“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的主要活性化學(xué)成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,兩者的結(jié)合能見(jiàn)圖5。其中,槲皮素與MMP9的結(jié)合活性最大(結(jié)合能=-9.7 kcal/mol),與MMP9的活性位點(diǎn)MET-247、LEU-188、ALA-189形成氫鍵,見(jiàn)圖6。

圖5 分子對(duì)接的結(jié)合能色階圖

圖6 槲皮素與MMP9的分子對(duì)接結(jié)合圖

3 討 論

目前異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺等抗結(jié)核藥物仍是結(jié)核病的一線治療藥物,其雖然能發(fā)揮良好的藥效,但長(zhǎng)期使用容易導(dǎo)致患者產(chǎn)生耐藥性及發(fā)生肝損傷等不良反應(yīng)。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)針對(duì)364例初治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的隊(duì)列研究表明,相比單純化療,采用化療方案聯(lián)合貞芪扶正顆粒治療的患者,痰菌轉(zhuǎn)陰率、結(jié)核菌素試驗(yàn)轉(zhuǎn)陰率、CD4+T淋巴細(xì)胞/CD8+T淋巴細(xì)胞值升高率均更高,提示貞芪扶正顆?？商岣呋颊叩募?xì)胞免疫功能,促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖并產(chǎn)生特異性淋巴因子,從而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的吞噬、消化功能,以達(dá)到殺滅結(jié)核分枝桿菌的目的[8]。貞芪扶正顆粒的主要有效成分為女貞子、黃芪。黃芪味甘,性微溫,歸脾、肺二經(jīng),具有補(bǔ)氣固表、托毒排膿、利尿、生肌的作用,有利于促進(jìn)肺結(jié)核患者痰菌轉(zhuǎn)陰、病灶吸收和空洞愈合[9]。女貞子性平,味甘、苦,歸肝、腎二經(jīng),可配伍其他藥物,具有滋陰益壽、補(bǔ)益肝腎、清熱明目、烏須黑發(fā)等功效,對(duì)化學(xué)性肝損傷有顯著改善作用[10]。

本研究結(jié)果顯示,貞芪扶正顆粒的主要活性化學(xué)成分包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、芒柄花素。槲皮素作為一種廣泛存在于自然界的天然黃酮類化合物,具有抗氧化、抗病毒、抗炎等多重生物活性。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在肺結(jié)核小鼠模型中,槲皮素通過(guò)抑制Toll樣受體4介導(dǎo)的炎癥相關(guān)信號(hào)通路,減少炎癥因子IL-1β的分泌,從而起到免疫調(diào)節(jié)作用,減輕肺組織病理?yè)p傷[11-12]。研究表明,槲皮素通過(guò)抑制脂肪酸和霉菌酸生物合成的關(guān)鍵酶,對(duì)結(jié)核分枝桿菌發(fā)揮殺滅及抑制活性的作用[13]。木犀草素多以糖苷的形式存在于多種植物,具有止咳、化痰、消炎、降尿酸的作用。研究表明,木犀草素可以抑制巨噬細(xì)胞極化、核轉(zhuǎn)錄因子κB活性,以及脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IL-6、TNF-α[14]。此外,木犀草素還具有抑制尿酸生成和促進(jìn)尿酸排泄的作用,能有效改善吡嗪酰胺所致的繼發(fā)性高尿酸血癥[15]。CYP121是細(xì)胞色素酶P450家族的成員之一,是結(jié)核分枝桿菌存活所必需的酶,參與結(jié)核分枝桿菌類固醇、脂肪酸和異生物質(zhì)的氧化過(guò)程,可以作為結(jié)核的治療靶點(diǎn)[16],而研究表明山柰酚及其芐基衍生物是良好的CYP121抑制劑[17]。臨床研究表明,結(jié)核分枝桿菌感染可導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性肺病,易引發(fā)銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌等病原菌合并感染[18]。β-谷甾醇作為天然甾體類物質(zhì),具有抵抗細(xì)菌入侵、抗氧化、抗炎的作用,可降低巨噬細(xì)胞中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3炎性小體的表達(dá)水平,抑制絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路的活化,使IL-6、TNF-α、IL-8表達(dá)水平降低,從而起到抗炎作用[19-20]。結(jié)核患者在化療過(guò)程中常出現(xiàn)藥物性肝炎,而芒柄花素可以通過(guò)下調(diào)TNF-α、核轉(zhuǎn)錄因子κB-p65、Toll樣受體3的mRNA表達(dá)水平,減輕化療藥物的肝毒性,從而改善患者肝功能[21]。另外,肺結(jié)核患者通常同時(shí)合并2型糖尿病,芒柄花素能有效控制體重、高血糖,改善胰島素抵抗、瘦素水平,減輕全身炎癥反應(yīng),從而起到緩解肺結(jié)核患者病情的作用[22]。

本研究的分子對(duì)接分析結(jié)果表明,MMP9、IL-6、PTGS2、PPARG、CXCL8均與貞芪扶正顆粒的主要活性化學(xué)成分有穩(wěn)定的對(duì)接效果(結(jié)合能<-5.0 kcal/mol)。MMP9屬于MMP家族成員,參與細(xì)胞外基質(zhì)的分解。大部分肺結(jié)核患者存在肺纖維化,其原因?yàn)镸MP9表達(dá)不足導(dǎo)致機(jī)體對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的分解作用減弱,使得細(xì)胞外基質(zhì)堆積進(jìn)而形成肺纖維化[23]。黃芪可提高肺結(jié)核患者血漿及肺泡灌洗液中的MMP9濃度,逆轉(zhuǎn)肺纖維化[9]。巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌感染的主要人類宿主細(xì)胞,肺巨噬細(xì)胞在吞噬結(jié)核分枝桿菌過(guò)程中分泌的炎癥因子增多,導(dǎo)致肺組織損傷。例如,臨床中?？梢?jiàn)肺結(jié)核活動(dòng)期患者體內(nèi)IL-6水平增高,而黃芪可降低患者血漿IL-6水平,從而延緩肺結(jié)核進(jìn)展[9]。在感染結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞中,PTGS2的表達(dá)水平顯著增加[24],而黃芪可降低大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中PTGS2的表達(dá)水平,從而起到抗纖維化作用[25]。目前已有研究表明,結(jié)核分枝桿菌能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞PPARG表達(dá)上調(diào),敲除肺巨噬細(xì)胞的PPARG基因可以抑制結(jié)核分枝桿菌的增殖,表明抑制PPARG活性有利于機(jī)體殺滅結(jié)核分枝桿菌[26]。CXCL8是負(fù)責(zé)招募CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的主要趨化因子,可增強(qiáng)結(jié)核患者的先天性免疫反應(yīng)及巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌的能力,并可作為診斷肺結(jié)核和評(píng)估肺結(jié)核病情的生物標(biāo)志物之一[27-28]。

GO功能富集分析結(jié)果表明,核心靶點(diǎn)主要分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞核、膜封閉管腔等細(xì)胞組分,通過(guò)發(fā)揮蛋白質(zhì)結(jié)合、核苷酸結(jié)合、離子結(jié)合等分子功能,進(jìn)而在機(jī)械刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。KEGG通路富集分析表明,核心靶點(diǎn)主要集中在IL-7信號(hào)通路及TNF信號(hào)通路,PTGS2、JUN、Caspase-3為這兩條通路的共有基因。PTGS2基因編碼前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶環(huán)氧化酶2,其是一種雙功能酶,具有環(huán)氧化酶和過(guò)氧化氫酶活性,是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶,參與炎癥反應(yīng)和前列腺素的生物合成[29]。JUN作為核因子E2相關(guān)因子2和小Maf蛋白K的輔助因子,在調(diào)控抗氧化反應(yīng)元件和活性氧簇的產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用[30]。Caspase-3基因編碼的蛋白是一種Caspase,在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著核心作用。IL-17信號(hào)通路在保護(hù)宿主免受細(xì)胞外病原體侵害方面具有重要作用[31],CD4+T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、γδ T淋巴細(xì)胞分泌的IL-17通過(guò)招募中性粒細(xì)胞來(lái)參與清除結(jié)核分枝桿菌的過(guò)程,但同時(shí)也可能加重局部炎癥反應(yīng),導(dǎo)致肺損傷[32]。TNF-α參與巨噬細(xì)胞抵抗結(jié)核分枝桿菌感染和結(jié)核性肉芽腫形成的過(guò)程,還能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡和其他細(xì)胞因子的釋放,在抗感染方面具有一定的積極作用,但過(guò)度激活可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征,使病情惡化[33]。研究顯示,肺結(jié)核患者體內(nèi)存在明顯的免疫功能紊亂,抗結(jié)核治療后患者血清TNF-α、IL-17水平明顯降低,說(shuō)明在肺結(jié)核活動(dòng)期炎癥相關(guān)信號(hào)通路處于激活狀態(tài)[34]。貞芪扶正顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制炎癥相關(guān)信號(hào)通路的過(guò)度激活,穩(wěn)定機(jī)體免疫功能,從而發(fā)揮輔助治療肺結(jié)核的作用。

綜上所述,貞芪扶正顆粒輔助治療肺結(jié)核的機(jī)制具有多成分、多靶點(diǎn)和多通路的特點(diǎn),其活性化學(xué)成分槲皮素、木犀草素等可能通過(guò)作用于MMP9、IL-6、PTGS2、PPARG、CXCL8等靶點(diǎn),來(lái)抑制IL-7信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路,從而發(fā)揮輔助治療肺結(jié)核的作用。