張蕓，袁風(fēng)雷，袁若琳，李釗

華北醫(yī)療健康集團(tuán)峰峰總醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056000

脂多糖（LPS）是內(nèi)毒素的有效成分，是一種多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的復(fù)合物，能夠介導(dǎo)多種細(xì)胞、組織的損傷，是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要誘因。研究［1-2］顯示，LPS可觸發(fā)氣道炎癥，它通過(guò)降低肺泡毛細(xì)血管屏障功能，增加肺血管通透性以及促進(jìn)白細(xì)胞浸入肺泡間隙，從而引起肺損傷。LPS可誘導(dǎo)炎癥因子如白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8和腫瘤壞死因子（TNF）-α釋放到局部肺組織和血液循環(huán)中，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)，這也是引起呼吸功能下降的呼吸道疾病的主要誘因，急性肺損傷的大鼠模型、急性肺損傷的細(xì)胞模型均是由LPS誘導(dǎo)形成的［3-4］。有絲分裂原激活的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1參與炎癥的發(fā)生過(guò)程，可調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用的各種基因的表達(dá)，若TGF-β1激活與Smad家族蛋白3（Smad3）結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α的表達(dá)升高［5-6］。依托咪酯是一種新型選擇性抗膽堿藥，是一種常用的麻醉藥物，可降低乙酰膽堿活性，從而發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用［7］。依托咪酯的抗炎活性已在藥理學(xué)研究中被證明。研究［8-9］發(fā)現(xiàn)，依托咪酯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎、肺炎均有明顯的抑制作用，可有效阻止?jié)冃越Y(jié)腸炎和肺炎的疾病進(jìn)展。然而，依托咪酯對(duì)呼吸道炎癥疾病的抗炎作用機(jī)制尚未得到充分研究。2022年12月—2023年1月，我們觀察了依托咪酯對(duì)LPS誘導(dǎo)人氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）炎性損傷的改善作用，并探討其機(jī)制，以期為呼吸系統(tǒng)炎癥疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人ASMCs購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司。依托咪酯（原料藥，純度99.86%）購(gòu)自深圳市民康源生物科技有限公司；胎牛血清、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測(cè)試劑盒、IL-2、IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)自廣州博輝生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、LPS、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）試劑盒、TRIzol試劑、PCR試劑盒、蛋白裂解液、ECL試劑均購(gòu)自昆明亞靈生物科技有限公司；兔源TGF-β1、Smad3、GAPDH一抗、羊抗兔二抗均購(gòu)自武漢菲越生物科技有限公司。MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱、CMax Plus型酶標(biāo)儀、iQue 3型流式細(xì)胞儀均購(gòu)自常州祥泰生物技術(shù)有限公司；Esan-Gene 696型熒光定量PCR儀、OmegaLum G型凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自南京北魚(yú)生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞分組及LPS、依托咪酯給予 于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)環(huán)境在含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)ASMCs，每天更換培養(yǎng)液，在細(xì)胞覆蓋率達(dá)到90%左右時(shí)使用胰蛋白酶消化、傳代。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ASMCs接種于96孔板上（1×105個(gè)/孔），并分為對(duì)照組、LPS組［10］、依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組［11］。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)ASMCs；LPS組在含ASMCs的培養(yǎng)基中加入500 ng/mL的LPS［10］；依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組在含ASMCs的培養(yǎng)基中加入500 ng/mL的LPS后，再分別加入5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的依托咪酯［11］。各組設(shè)8個(gè)平行樣，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3 各組細(xì)胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α檢測(cè) 采用ELISA法。取各組細(xì)胞以3×104個(gè)/孔接種于24孔板上，棄培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液沖洗2次，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法及步驟，檢測(cè)各組細(xì)胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α。

1.4 各組細(xì)胞存活率、凋亡率測(cè)算

1.4.1 各組細(xì)胞存活率測(cè)算 采用MTT法。取各組細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板上，加入MTT溶液，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜，振蕩15 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣本490 nm處的吸光度值（OD490值），計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=各組OD490值/對(duì)照組OD490值×100%。

1.4.2 各組細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞法。取各組細(xì)胞重懸為1×105個(gè)/mL，加入Annexin VFITC和PI各8 μL，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.5 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白檢測(cè)

1.5.1 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA檢測(cè)采用熒光定量PCR法。取各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑分離總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，以U6為內(nèi)參，熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA，引物由武漢瓊格生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列如下：TGF-β1正向引物為5'-ATCGCGCCATGTTAACAACT-3'，反向引物為5'-TGGAAAGTCGCCACCGCGTG-3'；Smad3正向引物為5'-GTCTACTGAAGAGTAGTTAAC-3'，反向引物為5'-AATCCACATTCCCATCCATTG-3'；U6正向引物為5'-GCTCGAGTCCTCACATGCTCG-3'，反向引物為5'-TGATAGTAATCAGTCACTAGT-3'。反應(yīng)條件及環(huán)境的配置參照PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，以2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.2 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3蛋白檢測(cè) 采用蛋白印跡法。取各組細(xì)胞，蛋白裂解液裂解，BCA試劑盒定量總蛋白，電泳分離各組中等量的蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，加入稀釋好的兔源TGF-β1（1：600）、Smad3（1：700）、GAPDH（1：1000）一抗，4 ℃下孵育過(guò)夜，加入羊抗兔二抗（1：1400），室溫下孵育1 h，ECL試劑顯色，采用Image J軟件檢測(cè)蛋白灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈正態(tài)分布時(shí)以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比較 各組細(xì)胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比較見(jiàn)表1。由表1可知，與對(duì)照組相比，LPS組、依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組細(xì)胞中IL-2、IL-6、TNF-α水平均升高（P均＜0.05）；與LPS組相比，依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組細(xì)胞中IL-2、IL-6、TNF-α水平均降低（P均＜0.05），且依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組低于依托咪酯低濃度組（P均＜0.05），依托咪酯高濃度組低于依托咪酯中濃度組（P＜0.05）。

表1 各組細(xì)胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組細(xì)胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與LPS組相比，bP＜0.05；與依托咪酯低濃度組相比，cP＜0.05；與依托咪酯中濃度組相比，dP＜0.05。

組別依托咪酯低濃度組依托咪酯中濃度組依托咪酯高濃度組LPS組對(duì)照組IL-239.56 ± 5.11ab 28.79 ± 4.86abc 17.78 ± 2.77abcd 52.68 ± 5.86a 6.68 ± 1.65 IL-6104.76 ± 15.44ab 83.85 ± 12.86abc 65.85 ± 9.06abcd 127.68 ± 19.90a 41.75 ± 7.96 TNF-α 228.05 ± 27.87ab 195.69 ± 24.75abc 160.54 ± 19.58abcd 268.47 ± 29.16a 125.58 ± 17.86

2.2 各組細(xì)胞存活率、凋亡率比較 對(duì)照組、LPS組、依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組細(xì)胞存活率分別為100.00%、40.08% ±6.04%、52.87% ± 6.21%、66.48% ± 7.10%、81.26% ± 9.54%，組間相比，P均＜0.05。對(duì)照組、LPS組、依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組細(xì)胞凋亡率分別為4.40% ± 1.09%、25.16% ± 5.07%、19.77% ± 4.03%、14.71% ±2.25%、10.05% ± 2.05%，組間相比，P均＜0.05。

2.3 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表2。由表2可知，與對(duì)照組相比，LPS組、依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組細(xì)胞中TGF-β1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量、Smad3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高（P均＜0.05）；與LPS組相比，依托咪酯低濃度組、依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組細(xì)胞中TGF-β1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量、Smad3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低（P均＜0.05），且依托咪酯中濃度組、依托咪酯高濃度組低于依托咪酯低濃度組（P均＜0.05），依托咪酯高濃度組低于依托咪酯中濃度組（P＜0.05）。

表2 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與LPS組相比，bP＜0.05；與依托咪酯低濃度組相比，cP＜0.05；與依托咪酯中濃度組相比，dP＜0.05。

組別依托咪酯低濃度組依托咪酯中濃度組依托咪酯高濃度組LPS組對(duì)照組TGF-β1 mRNA 2.18 ± 0.41ab 1.78 ± 0.26abc 1.46 ± 0.21abcd 2.67 ± 0.55a 1.00 ± 0.00蛋白0.57 ± 0.12ab 0.40 ± 0.09abc 0.27 ± 0.05abcd 0.85 ± 0.18a 0.15 ± 0.02 Smad3 mRNA 2.05 ± 0.36ab 1.72 ± 0.31abc 1.33 ± 0.27abcd 2.55 ± 0.54a 1.00 ± 0.00蛋白0.90 ± 0.19ab 0.65 ± 0.15abc 0.48 ± 0.07abcd 1.08 ± 0.23a 0.29 ± 0.06

3 討論

LPS是內(nèi)毒素的有效成分，是一種多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的復(fù)合物，能夠介導(dǎo)多種細(xì)胞、組織的損傷，是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要誘因，同時(shí)其能干預(yù)氣道上皮細(xì)胞分泌炎癥因子，這些炎癥因子能夠參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)過(guò)程和免疫應(yīng)答過(guò)程［12-14］。依托咪酯是一種小分子量的化合物，也是一種常用的麻醉藥物，起效快，同時(shí)有鎮(zhèn)靜和催眠的作用，其被證明可有效保護(hù)器官免受急性損傷，例如缺血和再灌注引起的心臟損傷以及動(dòng)物急性肺損傷［15-16］。這些保護(hù)作用部分歸因于其抗炎功能，依托咪酯已被證明可減輕急性肺損傷小鼠的肺組織炎性浸潤(rùn)和病理?yè)p傷［17］。然而，依托咪酯的抗炎作用的細(xì)胞和分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究使用LPS處理ASMCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS處理的ASMCs存活率顯著降低，凋亡率、IL-2、IL-6、TNF-α水平顯著升高。在LPS處理的ASMCs培養(yǎng)基中加入依托咪酯后，可以觀察到ASMCs存活率顯著升高，凋亡率、IL-2、IL-6、TNF-α水平顯著降低，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，與景建闖等［17］研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)的ASMCs發(fā)生炎性損傷，導(dǎo)致ASMCs存活減少，凋亡細(xì)胞數(shù)目增多，而依托咪酯能減輕LPS誘導(dǎo)的ASMCs炎性損傷，減少因炎性損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，提高ASMCs存活率。

TGF-β1/Smad3是與氣道重塑和脂質(zhì)代謝過(guò)程密切相關(guān)的信號(hào)通路，TGF-β1在肝臟中含量較高，能夠參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等生物學(xué)行為［18-19］。Smad3是TGF-β1的下游信號(hào)分子，TGF-β1與其受體結(jié)合后能激活Smad3，調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路也在炎癥反應(yīng)和多種器官纖維化的發(fā)展中起著重要作用［20-21］。FENG等［22］研究表明，地塞米松能夠抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路拮抗氣道重塑。GUAN等［23］研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1能降低TGF-β1/Smad3信號(hào)通路活性，從而改善香煙煙霧誘導(dǎo)的大鼠氣道重塑和肺功能。WU等［24］報(bào)道，細(xì)顆粒物能夠激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路促使哮喘大鼠病情加重，從而導(dǎo)致氣道纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS處理的ASMCs中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白水平顯著升高，在LPS處理的ASMCs培養(yǎng)基中加入依托咪酯后，ASMCs中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白水平顯著降低，且依托咪酯濃度越高，降低效果越明顯。結(jié)合FENG和GUAN等［22-23］的研究，我們推測(cè)，抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路能改善大鼠氣道重塑，可能是因?yàn)闇p輕了大鼠ASMCs的炎性損傷，降低了ASMCs的凋亡率；而依托咪酯能抑制LPS誘導(dǎo)的ASMCs炎性損傷和凋亡，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的依托咪酯對(duì)LPS誘導(dǎo)人ASMCs炎性損傷均具有改善作用，可升高細(xì)胞存活率、降低細(xì)胞凋亡率，且20 μg/mL依托咪酯的的改善作用最強(qiáng)。依托咪酯對(duì)LPS誘導(dǎo)人ASMCs炎性損傷的改善作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活有關(guān)。但本研究?jī)H探討了依托咪酯通過(guò)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的ASMCs炎性損傷的抑制作用，依托咪酯能否通過(guò)其他信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的ASMCs炎性損傷，有待深入研究。