楊愛馥，孫 赟，萬 超，劉雪華，邰麗梅，王 玫*

（1 大連海關(guān)技術(shù)中心 遼寧大連 116001 2 中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所 昆明 650033）

塊菌（Tuberspp.），在商業(yè)上稱為松露，是一類生于地表下與樹木共生的、珍貴的食藥用真菌[1]。松露具有獨特的香氣和風(fēng)味，營養(yǎng)價值高，是美食界的頂級食材，在歐美被冠以“地下黃金”“上帝的食物”“黑色金剛石”等美稱，尤以法國黑孢塊菌（T.melanosporum）和意大利白塊菌（T.magnatum）最為矜貴[2-3]。以印度塊菌復(fù)合群（T.indicumcomplex）為代表的中國黑松露（黑塊菌）主要分布于我國西南地區(qū)（云南和四川），是塊菌屬在我國產(chǎn)量最大、分布最廣且大宗出口的野生貿(mào)易食用菌種類。主要包括印度塊菌（T.indicumCooke & Massee）、T.sinense、喜馬拉雅塊菌（T.himalayense）[4]、假喜馬拉雅塊菌（T.pseudohimalayense）[5]和T.formosanum[6]5 個菌種[1，7]。

作為歐洲黑松露的替代品，自20 世紀(jì)90 年代初以來，亞洲黑松露已出口到歐洲，并在當(dāng)?shù)厥袌鲣N售[8]。中國松露貿(mào)易種印度塊菌復(fù)合群（T.indicumcomplex）是由一類形態(tài)上高度相似、基因序列相似度高的2～4 個隱形種組成?；驁D譜顯示，中國的印度塊菌（T.indicumCooke & Massee）和法國黑孢松露的基因相似度達到96%以上，二者在子囊果形態(tài)及孢子顯微特征方法極為相似[1]，香味和營養(yǎng)價值也幾乎沒有區(qū)別?；谛螒B(tài)學(xué)和分子序列特征，證實屬于該復(fù)合群的假凹陷塊菌（T.pseudoexcavatum）和假喜馬拉雅塊菌（T.pseudohimalayense）為同種[1，7，9-10]，中國塊菌（T.sinense）作為印度塊菌（T.indicumCooke & Massee）的異名[1，7，9-14]，T.formosanum是喜馬拉雅塊菌（T.himalayense）的異名[7，11-15]。

松露的生長需要極其特殊的生長環(huán)境，無法進行人工培育且產(chǎn)量稀少，導(dǎo)致其價格昂貴，具有極高的經(jīng)濟價值。此外，黑松露除了含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸（包括人體不能合成的8 種必需氨基酸）、不飽和脂肪酸、維生素、微量元素外，還具有良好的生物活性，主要活性成分有塊菌多糖、神經(jīng)酰胺、α-雄烷醇、麥角甾醇等[16]，不僅具有抗氧化、抗誘變、抑菌、抗腫瘤等方面的藥理作用，還具有調(diào)理內(nèi)分泌，防治心腦血管疾病，增強免疫力，抗衰老，抗疲勞等方面的營養(yǎng)保健價值[17-21]。

黑松露在國際市場上長期受到追捧，價格居高不下，其經(jīng)濟價值日益突顯。中國產(chǎn)黑松露大約是全球產(chǎn)量的40%以上，是出口歐洲的主要菌類食品。目前尚無黑松露的檢測標(biāo)準(zhǔn)，市場上銷售的黑松露制品真假難辨，其進出口貿(mào)易受到一定的制約。本研究靶向黑松露物種特異序列，建立一種快速、精準(zhǔn)鑒定黑松露成分的分子生物學(xué)檢測方法，以適用于黑松露及其制品鑒偽的定性檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

廣泛收集黑松露樣品及其它食用菌和異源性動植物樣品，樣品采集信息見表1。采用ITS 和LSU（Nuclear large submit ribosomal DNA，核糖體大亞基）基因序列[22]做分子鑒定標(biāo)記，分別用引物ITS5/ITS4 和LR0R/LR5 對樣品進行PCR 擴增，測序后登陸NCBI 數(shù)據(jù)庫進行BLAST 比對，以進行樣品真實性鑒定。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information

1.2 試劑與儀器

動物源性植物飼料基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；Premix ExTaqTMProbe qPCR，寶生物工程（大連）有限公司；合成引物、探針及測序，華大基因有限公司。

QuantStudio 6 Flex QS6 實時熒光定量PCR儀，美國ABI 公司；NanoDrop Lite 超微量分光光度計，美國ThermoFisher 公司；5415R 小型高速離心機，德國Eppendorf 公司；WNB7 恒溫水浴鍋，德國Memmert 公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 按照試劑盒操作說明進行DNA 提取，并進行DNA 純度及濃度的測定。

1.3.2 引物和探針設(shè)計 從GenBank 上查找并下載印度塊菌（T.indicumCooke ＆ Massee）、中國塊菌（T.sinense）、喜馬拉雅塊菌（T.himalayense）、假凹陷塊菌（T.pseudoexcavatum）、假喜馬拉雅塊菌（T.pseudohimalayense）和黑孢塊菌（T.melanosporum）以及網(wǎng)蓋牛肝菌（Boletus reticuloceps）、皺蓋疣柄牛肝菌（Leccinum duriusculum）、黑斑厚瓤牛肝菌（Hourangia nigropunctata）、褐牛肝菌（Boletus aereus）、黑木耳（Auricularia auricula）、香菇（Lentinula edodes）、羊肚菌（Morchella sextelata）等物種的ITS 基因序列。使用Clustal X軟件進行序列比對，根據(jù)差異性原則，利用Primer Premier 5.0 軟件在黑松露與其它食用菌序列的差異處設(shè)計特異性引物和探針，并在GenBank 上進行Blast 比對檢測引物和探針的可行性。序列如下：上游引物：5’-CTGTTCGAGCGTCACTACACAC-3’；下游引物：5’-TGATATGCTTAAGTTCA GCGGGTA-3’；探針：FAM-5’-CAATATTTGTG GTCTTGGCAGGAGTGAATT-3’-TAMRA。

1.3.3 實時熒光PCR 檢測方法建立 實時熒光PCR 反應(yīng)體系25 μL，包括：PCR 反應(yīng)混合液（2×）12.5 μL、上游引物（10 μmol/L）1.0 μL、下游引物（10 μmol/L）1.0 μL、TaqMan 探針（10 μmol/L）0.5 μL、DNA 模板2.0 μL、無菌水將體系補充至總體積25 μL。

擴增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min（1 個循環(huán)）；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s（40 個循環(huán)），熒光閾值為設(shè)備默認(rèn)值，在每個循環(huán)退火階段收集熒光信號。

1.3.4 特異性試驗 利用1.3.1 節(jié)中的DNA 提取方法提取表1 中所列出6 種黑松露目標(biāo)樣品和23 種非目標(biāo)源性樣品的基因組DNA，并以此為模版進行實時熒光PCR 擴增，以雙蒸水為空白對照，驗證本方法的特異性。

1.3.5 靈敏度試驗 將黑松露基因組DNA 進行10 倍梯度稀釋至質(zhì)量濃度分別為10，1.0，1.0×10-1，1.0×10-2，1.0×10-3，1.0×10-4ng/μL，各質(zhì)量濃度3 個平行進行靈敏度檢測試驗。

不同摻入比例模擬樣品靈敏度試驗：以黑松露粉為本源，分別以大豆粉和易混食用菌（黑木耳和牛肝菌混合物）為基質(zhì)做添加試驗，制備黑松露/基質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%，10%，1%，0.1%，0.01% 5 個不同比例的模擬樣品，提取DNA 并作為靈敏度檢測模板進行實時熒光PCR 檢測。

1.3.6 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗 將黑松露基因組DNA 進行10 倍梯度稀釋至質(zhì)量濃度分別為10，1.0，1.0×10-1ng/μL，進行實時熒光PCR 檢測，每個樣品3 個平行，以不同濃度基因組DNA 獲得的Ct值計算其平均數(shù)和變異系數(shù)，進行重復(fù)性和穩(wěn)定性分析。

1.3.7 市售樣品檢測 購置市售黑松露鮮品（20份）、凍品（20 份）、干品（20 份），黑松露粉末（10份）、黑松露醬（5 份）和黑松露調(diào)味粉（5 份）以及不含黑松露成分的雜菌包（20 份）、雜菌碎（20 份）樣品，檢測其是否含有黑松露成分。同時采用DNA 條形碼方法[22]對陽性樣品進行ITS 基因序列擴增并測序，對比兩種方法檢測結(jié)果的差異。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，利用Microsoft Excel 2016 對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核生物18S rRNA 內(nèi)參基因檢測結(jié)果

以真核生物18S rRNA 基因作為內(nèi)參基因?qū)Ρ驹囼炈崛〉乃袠悠稤NA 溶液進行實時熒光PCR 檢測，結(jié)果顯示所有DNA 溶液均出現(xiàn)擴增曲線，Ct 值均小于30，說明所有用于黑松露成分特異性檢測的DNA 樣品均適用于PCR 檢測（圖1）。

圖1 黑松露和其它樣品18S rRNA 內(nèi)參基因檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of 18S rRNA gene in black truffles and other materials

2.2 黑松露成分實時熒光PCR 特異性驗證結(jié)果

檢測收集到的6 個黑松露物種樣品：印度塊菌（T.indicumCooke ＆ Massee）、中國塊菌（T.sinense）、喜馬拉雅塊菌（T.himalayense）、假凹陷塊菌（T.pseudoexcavatum）、假喜馬拉雅塊菌（T.pseudohimalayense）和黑孢塊菌（Tuber melanosporum），同時以23 種其它食用菌以及異源性動植物樣品作為陰性對照，進行實時熒光PCR 擴增，檢測引物和探針的特異性。結(jié)果顯示，6 個黑松露物種樣品印度塊菌（T.indicumCooke ＆ Massee）、中國塊菌（T.sinense）、喜馬拉雅塊菌（T.himalayense）、假凹陷塊菌（T.pseudoexcavatum）、假喜馬拉雅塊菌（T.pseudohimalayense）和黑孢塊菌（Tuber melanosporum）均出現(xiàn)明顯的擴增曲線（圖2、圖3），23 種對照樣品基因組DNA 均無擴增檢測結(jié)果（圖3），非目標(biāo)源性無交叉反應(yīng)，說明該方法具有很好的特異性。

圖2 6 種黑松露的實時熒光PCR 特異性檢測結(jié)果Fig.2 Specific detection results of 6 species of black truffles by real-time PCR

圖3 黑松露的實時熒光PCR 特異性檢測結(jié)果Fig.3 Specific detection results of black truffles by real-time PCR

2.3 黑松露成分實時熒光PCR 靈敏度檢測

以1 μL 質(zhì)量濃度分別為10，1.0，1.0×10-1，1.0×10-2，1.0×10-3，1.0×10-4ng/μL 的黑松露基因組DNA 為模板，進行靈敏度試驗。結(jié)果顯示該方法的最低檢出限為1.0×10-3ng/μL 基因組DNA（圖4）。

圖4 不同DNA 濃度靈敏度檢測結(jié)果Fig.4 Sensitivity test results of different DNA concentrations

黑松露樣品分別與大豆基質(zhì)或易混食用菌基質(zhì)按不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（100%，10%，1%，0.1%，0.01%）混合，靈敏度檢測試驗結(jié)果如圖5、圖6 所示，當(dāng)黑松露/基質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%時，出現(xiàn)典型的擴增曲線，因此該方法的靈敏度可穩(wěn)定達到0.01%。

圖5 模擬添加大豆粉靈敏度檢測結(jié)果Fig.5 Sensitivity test results of simulated added soybean powder

圖6 模擬添加易混食用菌靈敏度檢測結(jié)果Fig.6 Sensitivity test results of simulated mixed edible fungi

2.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗

以1 μL 質(zhì)量濃度范圍為10，1，0.1 ng/μL 3個連續(xù)稀釋梯度的黑松露基因組DNA 為模板進行實時熒光PCR 檢測，每個濃度梯度進行3 次平行試驗，根據(jù)Ct 值計算其平均數(shù)和變異系數(shù)，進行重復(fù)性和穩(wěn)定性分析。結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)在0.47%～0.88%，批間變異系數(shù)在1.12%～2.71%（表2），說明該方法有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表2 黑松露實時熒光PCR 重復(fù)性和穩(wěn)定性分析Table 2 Repeatability and stability of real-time PCR for black truffle detection

2.5 黑松露成分實時熒光PCR 法實際應(yīng)用檢測

對120 份市售黑松露及制品進行檢測，結(jié)果見表3。商品標(biāo)識為黑松露（鮮品、凍品、干片、粉末）或含有黑松露成分的樣品（黑松露醬和黑松露調(diào)味粉）均出現(xiàn)典型的擴增曲線，陽性比例為100%，不含黑松露成分的雜菌包干貨、雜菌碎干貨樣品均為陰性結(jié)果，檢測結(jié)果與商品標(biāo)識一致。同時采用DNA 條形碼方法對陽性樣品進行ITS基因序列擴增并測序，結(jié)果為印度塊菌（T.indicumCooke ＆ Massee），說明本文建立的實時熒光PCR 檢測方法結(jié)果可靠，在黑松露成分真實性鑒定中具有很強的實際應(yīng)用價值。

表3 市售黑松露商品檢測結(jié)果Table 3 Detection results of commercial black truffle

3 結(jié)論

本研究建立了鑒定黑松露成分的TaqMan 探針實時熒光PCR 檢測方法，具有較強的特性和較高的靈敏度，與23 種其它常見食用菌和異源性動植物樣品均無交叉反應(yīng)，檢測靈敏度可達到1.0×10-3ng/μL，黑松露基因組DNA 或質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的黑松露粉。對120 份市售黑松露實際樣品的檢測結(jié)果均與商品標(biāo)識一致，黑松露檢測結(jié)果的陽性樣品與DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果一致，說明本方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用范圍從黑松露鮮品、凍品、干品到深加工黑松露制品，在黑松露成分真實性鑒定中具有很強的實際應(yīng)用價值。本方法的建立將填補我國黑松露檢測的空白，可作為有效的檢測手段應(yīng)用于口岸及市場上黑松露及制品的真?zhèn)舞b別，為標(biāo)簽符合性查驗、打擊摻假欺詐、規(guī)范市場秩序提供技術(shù)支持，對促進我國黑松露產(chǎn)業(yè)和進出口貿(mào)易的穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。