茍麗霞?解子晗?張文麗?宋子涵?汪志軍?韓鐵生

摘要：目的 研究卡西霉素產(chǎn)生菌教酒鏈霉菌NRRL 3882中編碼MmpL家族同源蛋白的抗性基因calT的功能。方法 利用λ-RED同源重組方法構(gòu)建calT基因敲除質(zhì)粒，通過接合轉(zhuǎn)移和同源重組的方法得到雙交換的calT基因敲除的突變株。通過HPLC分析突變株的代謝產(chǎn)物，并對突變株及野生菌株的細胞內(nèi)及細胞外卡西霉素的分布進行分析。結(jié)果 突變株GLX30（ΔcalT）中卡西霉素的產(chǎn)量與野生菌株相比顯著降低，且胞內(nèi)卡西霉素的占比與野生菌株相比增加約3倍，說明calT與卡西霉素的轉(zhuǎn)運功能相關(guān)。結(jié)論 CalT為轉(zhuǎn)運蛋白，負責將卡西霉素轉(zhuǎn)運至胞外以實現(xiàn)教酒鏈霉菌對卡西霉素的抗性。

關(guān)鍵詞：卡西霉素；calT；MmpL家族；生物合成

中圖分類號：Q933文獻標志碼：A

The function of the resistance gene calT in the biosynthetic pathway of calcimycin

Gou Li-Xia1， Xie Zi-han1， Zhang Wen-li2， Song Zi-han2， Wang Zhi-jun3， and Han Tie-sheng2

（1 School of Life Sciences， North China University of Science and Technology， Tangshan 063210; 2 Hebei Province Key Laboratory

of Occupational Health and Safety for Coal Industry， School of Public Health， North China University of Science and Technology， Tangshan 063210; 3 State Key Laboratory of Microbial Metabolism， School of Life Sciences and Biotechnology，

Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240）

Abstract Objective To study the function of the resistance gene calT encoding MmpL family homologous protein in Streptomyces chartreusis NRRL 3882. Methods The calT gene knockout plasmid was constructed by λ-RED homologous recombination method， and the double-crossover calT gene knockout mutant was obtained by the methods of conjugation and homologous recombination. The metabolites of the mutant strains were analyzed by HPLC， and the distribution of intracellular and extracellular calcimycin in the mutant and wild strains was analyzed. Results Compared with the wild strain， the production of calcimycin in the mutant GLX30 （ΔcalT） was significantly lower than that in the wild strain， and the proportion of intracellular calcimycin increased by about 3 times compared with the wild strain， indicating that calT and the wild strain related to the transport function of the hormone. Conclusion CalT is a transporter protein， which is responsible for transporting calcimycin to the outside of the cell to achieve the resistance of Streptomyces oleifera to calcimycin.

Key words Calcimycin; calT; MmpL family; Biosynthesis

卡西霉素（calcimycin）又名A23187，是由教酒鏈霉菌（Streptomyces chartreusis）NRRL 3882產(chǎn)生的一種吡咯聚醚類抗生素，化學結(jié)構(gòu)由吡咯環(huán)、螺旋酮環(huán)及含3位取代基團的苯并噁唑環(huán)組成[1]（圖1A）?？ㄎ髅顾厥侵匾碾x子載體，能與生理上重要的陽離子如鈣離子、鎂離子等結(jié)合形成二聚體復合物，具有抗菌、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡[2-5]等功能，此外，卡西霉素具有誘導哺乳動物精子頂體反應(yīng)、激活卵母細胞等功能[6-7]，被廣泛應(yīng)用于輔助生殖的臨床實踐中。

2011年，吳秋林等[1]根據(jù)吡咯環(huán)的合成途徑，設(shè)計特異性引物從教酒鏈霉菌NRRL 3882的總DNA中克隆到卡西霉素的生物合成基因簇（圖1B）。其中，calA1-A5為5個聚酮合酶（polyketide synthase， PKS）基因，負責卡西霉素的螺旋環(huán)的合成；calB1-B4負責苯并惡唑環(huán)的前體3-羥基鄰氨基苯甲酸（3-HAA）的合成；calN1-N3負責卡西霉素的吡咯環(huán)合成；calM為甲基轉(zhuǎn)移酶，負責3位氨基的甲基化；calU1-calU5為未知功能基因；calR1-R3為3個途徑特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。前期研究中，通過對calR3基因體內(nèi)敲除實驗及體外酶學實驗證實CalR3是一個負調(diào)控蛋白，通過finger-printing方法證實CalR3結(jié)合于calR3與calT基因之間的雙向啟動子位置，抑制自身及calT基因的轉(zhuǎn)錄。在calR3基因敲除的突變株中，calT基因的表達量明顯上升，且突變株中卡西霉素的產(chǎn)量大幅度提升[8]。生物信息學分析顯示calT是一個抗性基因，編碼MmpL超家族的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白。關(guān)于MmpL家族蛋白的研究，目前主要集中在結(jié)核分枝桿菌中，探討其對抗生素的抗性機制，在其他細菌中的研究比較少。因此本研究以calT基因為研究對象，通過PCR-targeting的方法，構(gòu)建calT基因中斷的突變株，通過HPLC方法對calT基因敲除突變菌株及野生菌株的代謝產(chǎn)物進行比較分析，并對野生菌株及calT基因敲除突變株的細胞內(nèi)及細胞外代謝產(chǎn)物進行分析，揭示了calT基因在卡西霉素生物合成及轉(zhuǎn)運中的作用，為MmpL家族同源蛋白在鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物合成中的作用機制提供參考，并為今后利用分子生物學策略從基因水平上提高卡西霉素產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本實驗中所用到的全部菌種和質(zhì)粒見表1，其中Escherichia coli BW25113/pIJ790用于PCR-targeting 敲除目的基因，ET12567/pUZ8002用作大腸埃希菌與鏈霉菌兩親本接合轉(zhuǎn)移。本研究用到的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳見表2。

1.1.2 培養(yǎng)基、主要試劑和儀器

實驗所需LB培養(yǎng)基、LA培養(yǎng)基、SFM固/液體培養(yǎng)基、TSBY液體培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH7.0； LA培養(yǎng)基：將瓊脂粉加入LB培養(yǎng)基中，最終濃度為1.5%。LB、LA培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸埃希菌；SFM固體培養(yǎng)基用作教酒鏈霉菌NRRL 3882的孢子收集和結(jié)合轉(zhuǎn)移；SFM液體培養(yǎng)基用作發(fā)酵教酒鏈霉菌NRRL 3882；TSBY培養(yǎng)基（10.3%蔗糖）[9]用于鏈霉菌菌絲體的生長及總DNA的提取。rTaq DNA聚合酶、KOD plus高保真DNA聚合酶，TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，F(xiàn)ermentas公司；DNA膠回收試劑盒、實驗所用抗生素購自天根生化科技有限公司；甲醇、乙醇、乙酸乙酯購自河北艾錦科技有限公司。本實驗所用抗生素的終濃度為：卡那霉素（Kan）50 μg/mL、氨芐霉素（Amp） 100 μg/mL、氯霉素（Cml） 25 μg/mL、阿泊拉霉素（Apr） 30 μg/mL。HPLC1200及色譜柱ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）購自安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CalT的生物信息學分析

CalT（GenBank： AEH42475.1）的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析由在線NCBI的CDD工具完成[11] （ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）。

1.2.2 calT基因敲除突變株的構(gòu)建

本研究應(yīng)用REDIRECT Technology的方法[12]對calT基因進行敲除，通過EcoR I和 Hind III酶切pIJ773，回收獲得具有阿泊拉霉素抗性基因（aac（3）IV）及oriT的片段（約1.4 kb），以其為模板，設(shè)計引物T-F1和T-F2，PCR擴增aac（3）IV-oriT cassette片段用于中斷calT基因， 回收aac（3）IV-oriT cassette片段，并電轉(zhuǎn)入E.coli? BW25113/pKD46/p16F9感受態(tài)細胞中，利用E. coli BW25113/pKD46的同源重組系統(tǒng)將p16F9上的calT基因與aac（3）IV-oriT PCR cassette片段進行同源臂交換，構(gòu)建calT基因中斷的重組質(zhì)粒pJTU3796。在輔助質(zhì)粒pUZ8002的協(xié)助下，將重組質(zhì)粒pJTU3796通過接合轉(zhuǎn)移導入到野生型教酒鏈霉菌NRRL 3882孢子中，30℃、培養(yǎng)12～16 h 后用阿泊拉霉素（30 μg/mL）及萘啶酮酸（40 μg/mL）覆蓋，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d后挑選阿泊拉霉素抗性平板上的接合子劃線擴培，擴培3 d后提取每個接合子的基因組DNA，以其為模板，使用驗證引物T-F3和T-F4進行PCR驗證。

1.2.3 突變菌株及野生菌株代謝物萃取及分析

將野生菌株及突變菌株GLX30（ΔcalT）的孢子按1：1000的比例接種于TSBY培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min培養(yǎng)3 d，之后將種子液按2%的接種量轉(zhuǎn)接于100 mL液體SFM培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min發(fā)酵培養(yǎng)5～7 d。用兩倍體積的乙酸乙酯對野生菌株及突變株的發(fā)酵液進行萃取，分析菌株總的代謝產(chǎn)物，接著對野生菌株及突變株發(fā)酵液進行離心，對發(fā)酵液離心后的菌體（胞內(nèi)代謝物檢測）和上清（胞外代謝物檢測）做分別萃取，分析細胞內(nèi)外的代謝產(chǎn)物。將萃取液分別進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，之后用1 mL甲醇溶解旋蒸后的沉淀，有機濾膜過濾后用HPLC進行檢測分析，計算其胞內(nèi)外卡西霉素比值（胞內(nèi)/胞外），通過峰面積計算卡西霉素含量。使用Agilent 1200 HPLC及ZORBAX SB-C18反向柱對樣品進行檢測，檢測波長為280 nm，流動相A為含有0.1%的三氟乙酸（TFA）的水溶液，B相為甲醇（80%～100%），流速為0.3 mL/min。

2 結(jié)果

2.1 CalT的生物信息學分析

通過NCBI的CDD工具對CalT進行功能預(yù)測，顯示CalT屬于MmpL家族同源蛋白（圖2）。MmpL（mycobacterial membrane protein large）即分枝桿菌膜蛋白，屬于RND（抵抗-結(jié)瘤-細胞分裂）轉(zhuǎn)運蛋白家族的一個亞類，參與跨細胞膜的底物特異性的內(nèi)源性親脂性成分的輸出[4]。目前關(guān)于MmpL家族蛋白的研究主要集中在結(jié)核分枝桿菌中，現(xiàn)有研究表明，MmpL3介導分枝桿菌中脂質(zhì)海藻糖單菌酸（TMM）的轉(zhuǎn)運[5]，MmpL5介導分枝桿菌的藥物外排作用[13] ，MmpL7介導分枝桿菌聚酮化合物硫青霉烯二肌酸酯的轉(zhuǎn)運等[14]。因此，CalT可能作為一個抗生素外排蛋白，通過將卡西霉素向胞外轉(zhuǎn)運，實現(xiàn)宿主自身對卡西霉素的抗性。

2.2 calT基因中斷的突變株的構(gòu)建

為了探索calT基因的功能，通過PCR-targeting體系的λ-RED同源重組技術(shù)，對教酒鏈霉菌NRRL 3882基因組上的calT基因進行中斷，通過同源重組構(gòu)建aac（3）IV抗性基因置換calT基因的重組質(zhì)粒pJTU3796，見圖3A。在輔助質(zhì)粒pUZ8002的協(xié)助下，將重組質(zhì)粒pJTU3796通過接合轉(zhuǎn)移導入教酒鏈霉菌NRRL 3882孢子中，篩選到calT基因中斷的變菌株GLX30，見圖3B。以野生菌株及GLX30突變株的基因組DNA為模板， PCR擴增驗證，結(jié)果顯示野生菌株對應(yīng)的PCR片段大小為1024 bp，突變株GLX30（ΔcalT）對應(yīng)的片段為1820 bp，說明GLX30是calT基因中斷的雙交換突變株。

2.3 野生菌株和突變菌株GLX30的代謝產(chǎn)物分析

將野生菌株與突變菌株GLX30（ΔcalT）進行液體發(fā)酵，30℃培養(yǎng)7 d，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測分析。以卡西霉素標準品為陽性對照，HPLC結(jié)果顯示（圖4），突變株GLX30 （ΔcalT）中卡西霉素的產(chǎn)量比野生菌株的產(chǎn)量大幅度降低（圖4），這與我們前期研究結(jié)果相吻合，即當敲除calR3基因，卡西霉素的產(chǎn)量提高，calT的基因表達量明顯上升[8]。

為了進一步研究calT基因，作為MmpL家族同源蛋白在卡西霉素跨膜轉(zhuǎn)運中的作用，對突變菌株GLX30（ΔcalT）及野生菌株發(fā)酵7 d的細胞內(nèi)（intracellular）及細胞外（extracellular）代謝產(chǎn)物分別進行HPLC檢測分析，計算其胞內(nèi)外卡西霉素比值（胞內(nèi)/胞外），通過峰面積進行比較。結(jié)果顯示，野生菌株及突變株GLX30 （ΔcalT）突變株的細胞外的卡西霉素的量均高于細胞內(nèi)卡西霉素的量（圖5），經(jīng)計算WT胞外（WT-extracellular）與WT胞內(nèi)（WT-intracellular）卡西霉素的比值約為88.97（圖5A） ，突變株胞外（ΔcalT -extracellular）與突變株胞內(nèi)（ΔcalT -intracellular）卡西霉素的比值約為26.67（圖5B），說明calT與卡西霉素的胞外轉(zhuǎn)運功能相關(guān)。

3討論與結(jié)論

MmpL家族，是一種重要的多底物外排泵，根據(jù)其典型的拓撲結(jié)構(gòu)被歸屬于RND（resistance-nodulation-division）超家族[15]，其主要作用是將復雜的、與毒力相關(guān)的包膜脂質(zhì)和鐵載體穿過質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到細胞外[16]。結(jié)核分枝桿菌的基因組編碼有13個MmpL蛋白，目前只有MmpL3蛋白的轉(zhuǎn)運活性通過體外生物化學實驗的到證實[17]。RND超家族的外排泵蛋白參與的物質(zhì)外排，被認為是結(jié)核分枝桿菌耐藥的重要機制，RND超家族蛋白除了參與結(jié)核分枝桿菌的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，還與革蘭陰性細菌的抗生素耐藥性及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，目前研究較清楚的是大腸埃希菌中的RND超家族同源蛋白AcrB，作為藥物外排泵，能將底物通過周質(zhì)擠壓到細胞外，其表達受負調(diào)控因子AcrR的調(diào)控[18-19]。生物信息學分析表明CalT與RND超家族的MmpL家族蛋白有較高同源性。本研究成功構(gòu)建calT基因敲除的突變株，HPLC結(jié)果顯示ΔcalT突變株中卡西霉素的產(chǎn)量大幅度減少，且細胞內(nèi)卡西霉素的占比增加約3倍，說明calT與卡西霉素的胞外轉(zhuǎn)運功能相關(guān)。同時，敲除calT后，胞外的卡西霉素濃度仍高于胞內(nèi)，說明教酒鏈霉菌中仍有其他外排泵或非特異性外排系統(tǒng)將卡西霉素轉(zhuǎn)運出胞外，以降低其體內(nèi)毒性。

本研究中，calT基因的轉(zhuǎn)錄受到CalR3蛋白的調(diào)控。CalR3蛋白屬于TetR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，一般為誘導變構(gòu)型DNA結(jié)合蛋白，其天然構(gòu)型蛋白往往結(jié)合在一個雙向啟動子位置，阻遏自身及偶聯(lián)基因的表達，構(gòu)成負反饋調(diào)控結(jié)構(gòu)；當細胞內(nèi)誘導物的濃度增加，其與該調(diào)控因子結(jié)合使其構(gòu)象改變，從而降低與DNA的結(jié)合強度，造成自身及偶聯(lián)基因的轉(zhuǎn)錄水平上升。在本研究中，目標產(chǎn)物卡西霉素即為誘導物，實驗研究表明其可以在體外結(jié)合CalR3蛋白，降低其DNA結(jié)合活性[8]。因此calR3與calT構(gòu)成一個“自動開關(guān)”，當胞內(nèi)卡西霉素濃度低時，CalR3抑制自身基因及calT的轉(zhuǎn)錄；當卡西霉素濃度升高，calR3及calT基因的轉(zhuǎn)錄水平上升，CalT將卡西霉素排出胞外，因此始終將胞內(nèi)的卡西霉素濃度維持在一個較低的水平。此種轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式為TetR家族蛋白的典型調(diào)控模式，其偶聯(lián)的基因多種多樣，一般為其調(diào)控因子誘導物的效應(yīng)蛋白。其中偶聯(lián)藥物外排泵基因的模式比較常見，除了本研究的CalT，大腸埃希菌中藥物外排泵蛋白AcrB（RND超家族同源蛋白）也受到TetR家族蛋白AcrR的負調(diào)控。結(jié)核分枝桿菌中MmpL4轉(zhuǎn)運蛋白也反向偶聯(lián)一個TetR家族調(diào)控因子Rv0452（尚未經(jīng)實驗驗證）。

前期研究中，對卡西霉素基因簇上的負調(diào)控基因calR3敲除后，突變株中卡西霉素的產(chǎn)量提高約7倍，RT-PCR數(shù)據(jù)顯示突變株中calT基因的表達量大幅度上升，體外酶學實驗證實CalR3結(jié)合于calR3與calT基因之間的雙向啟動子位置，抑制自身及calT基因的轉(zhuǎn)錄[8]，屬于典型的TetR家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機制。

綜上，本研究通過基因敲除回補、HPLC代謝產(chǎn)物分析等手段證明了CalT是一個卡西霉素轉(zhuǎn)運蛋白，通過將自身生成的卡西霉素外排，實現(xiàn)自身對卡西霉素的抗性。本研究將為MmpL家族蛋白的轉(zhuǎn)運機制研究提供新的研究對象。

參 考 文 獻

Wu Q， Liang J， Lin S， et al. Characterization of the biosynthesis gene cluster for the pyrrole polyether antibiotic calcimycin （A23187） in Streptomyces chartreusis NRRL 3882[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2011， 55（3）： 974-982.

Kajitani N， Kobuchi H， Fujita H， et al. Mechanism of A23187-induced apoptosis in HL-60 cells： Dependency on mitochondrial permeability transition but not on NADPH oxidase[J]. Biosci Biotechnol Biochem， 2007， 71（11）： 2701-2711.

蓋婧璇， 韓鐵生， 劉文秀， 等. 卡西霉素生物合成調(diào)控基因calR2的功能[J]. 微生物學通報， 2018， 45（7）： 9.

Viljoen A， Dubois V， Girard-Misguich F， et al. The diverse family of MmpL transporters in mycobacteria： From regulation to antimicrobial developments[J]. Mol Microbiol， 2017， 104（6）： 889-904.

Su C C， Klenotic P A， Cui M， et al. Structures of the mycobacterial membrane protein MmpL3 reveal its mechanism of lipid transport[J]. PLoS Biol， 2021， 19（8）： e3001370.

Xu Z， Yao G， Niu W， et al. Calcium Ionophore （A23187） rescues the activation of unfertilized oocytes after intracytoplasmic sperm injection and chromosome analysis of blastocyst after activation[J]. Front Endocrinol （Lausanne）， 2021， 12： 692082.

Sampaio B， Ortiz I， Resende H， et al. Factors affecting intracellular calcium influx in response to calcium ionophore A23187 in equine sperm[J]. Andrology， 2021， 9（5）： 1631-1651.

Gou L， Han T， Wang X， et al. A novel TetR family transcriptional regulator， CalR3， negatively controls calcimycin biosynthesis in Streptomyces chartreusis NRRL 3882[J]. Front Microbiol， 2017， 8： 2371.

Wu Q， Gou L， Lin S， et al. Characterization of the N-methyltransferase CalM involved in calcimycin biosynthesis by Streptomyces chartreusis NRRL 3882[J]. Biochimie， 2013， 95（7）： 1487-1493.

Kieser T， Bibb M J， Buttner M J， et al. Practical Streptomyces genetics[M]. The John Innes Foundation， Norwich， United Kingdom， 2000： 25.

Marchler-Bauer A， Derbyshire M K， Gonzales N R， et al. CDD： NCBI's conserved domain database[J]. Nucleic acids research， 2015， 43（Database issue）： D222-226.

Gust B， Kieser T， Chater K. PCR targeting system in Streptomyces coelicolor A3 （2）[J]. John Innes Centre， 2002， 3（2）： 1-39.

Briffotaux J， Huang W， Wang X， et al. MmpS5/MmpL5 as an efflux pump in Mycobacterium species[J]. Tuberculosis （Edinb）， 2017， 107： 13-19.

Jain M， Cox J S. Interaction between polyketide synthase and transporter suggests coupled synthesis and export of virulence lipid in M. tuberculosis[J]. PLoS Pathog， 2005， 1（1）： e2.

Domenech P， Reed M B， Barry C E， 3rd. Contribution of the Mycobacterium tuberculosis MmpL protein family to virulence and drug resistance[J]. Infect Immun， 2005， 73（6）： 3492-3501.

Szekely R， Cole S T. Mechanistic insight into mycobacterial MmpL protein function[J]. Mol Microbiol， 2016， 99（5）： 831-834.

Xu Z， Meshcheryakov V A， Poce G， et al. MmpL3 is the flippase for mycolic acids in mycobacteria[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2017， 114（30）： 7993-7998.

Okusu H， Ma D， Nikaido H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance （Mar） mutants[J]. J Bacteriol， 1996， 178（1）： 306-308.

Ruzin A， Keeney D， Bradford P A. AcrAB efflux pump plays a role in decreased susceptibility to tigecycline in Morganella morganii[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2005， 49（2）： 791-793.