周彤?周秀娟?龍坤蘭?陳駿?高培陽

摘要：肺炎克雷伯菌作為醫(yī)院感染的主要病原體之一，具有聚集成生物膜的能力，極易附著在醫(yī)療設(shè)備上，是多種慢性感染的重要原因。肺炎克雷伯菌生物膜感染極難治愈，傳統(tǒng)抗生素治療并不能有效地改善患者的預(yù)后。因此，目前亟需開發(fā)治療肺炎克雷伯菌生物膜的新方法。本文就近幾年肺炎克雷伯菌生物膜的治療作一綜述，旨在為開發(fā)肺炎克雷伯菌生物膜新的治療方法提供思路。

關(guān)鍵詞：肺炎克雷伯菌；生物膜；治療；研究進展

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Recent advances in the treatment of Klebsiella pneumoniae biofilms

Zhou Tong， Zhou Xiu-juan， Long Kun-lan， Chen Jun， and Gao Pei-yang

（Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610075）

Abstract Klebsiella pneumoniae， as one of the main pathogens of nosocomial infection， has the ability to aggregate into biofilms and is easily attached to medical equipment， which is an important cause of various chronic infections. Klebsiella pneumoniae biofilm infection is extremely difficult to cure， and traditional antibiotic treatment cannot effectively improve the prognosis of patients. Therefore， it is urgent to develop new treatment methods for Klebsiella pneumoniae biofilms. This paper makes a summary on advances in the treatment of Klebsiella pneumoniae biofilms to provide new ideas for it.

Key words Klebsiella pneumoniae; Biofilms; Treatment; New advances

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae， KPN）是一種革蘭陰性桿菌，是院內(nèi)醫(yī)療相關(guān)感染的主要致病菌，也是嚴重社區(qū)獲得性感染的風(fēng)險因素[1]。近幾十年來，隨著抗生素的廣泛使用，多重耐藥肺炎克雷伯菌分離株的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)頻繁增加，對公眾健康構(gòu)成重大威脅[2-3]。生物膜是指附著在表面并牢固地嵌入胞外聚合物（extracellular polymeric substance， EPS）基質(zhì)中的細菌的復(fù)雜三維聚集[4]。生物膜基質(zhì)是細菌對抗微生物、宿主免疫系統(tǒng)和不利環(huán)境條件的保護屏障，研究表明，生物膜內(nèi)細菌的抗生素耐藥性比浮游細胞高10～1000倍，是KPN的主要耐藥機制之一[5-6]。肺炎克雷伯菌的生物膜現(xiàn)象于1988年被首次發(fā)現(xiàn)[7]，它可以導(dǎo)致呼吸道、胃腸道、泌尿道以及留置醫(yī)療設(shè)備上的定植，是許多慢性感染的原因[8-9]。生物膜的存在使得KPN的治療變得更加復(fù)雜，傳統(tǒng)的抗生素治療的效果不能令人滿意。本文從KPN生物膜形成和調(diào)控機制的介紹開始，總結(jié)了KPN生物膜治療的最新研究進展，以期對KPN生物膜感染的治療提供一些新的參考。

1 KPN生物膜的形成過程

肺炎克雷伯菌的生物膜基質(zhì)主要由胞外多糖、細胞外DNA（extracellular DNA， eDNA）和蛋白質(zhì)組成[10]。研究表明，KPN生物膜基質(zhì)的成分并非一成不變的，根據(jù)其不同的定值表面出存在很大差異，而這種差異多表現(xiàn)在基質(zhì)蛋白質(zhì)的不同[11-12]。KPN生物膜的形成主要經(jīng)歷5個階段（圖1）：①附著：在最初階段，自由游動的浮游生物細胞通過弱堿、疏水、分子間作用力和靜電等相互作用可逆地附著在生物或非生物表面。②定植：細菌病原體通過更強的相互作用，如黏附蛋白、脂多糖、莢膜多糖和菌毛，不可逆地附著在表面。③增殖：多層細菌細胞被深度積累，產(chǎn)生大量的胞外聚合物。④成熟：附著的多層細菌細胞生長成具有典型3D生物膜結(jié)構(gòu)的成熟生物膜。⑤分散：生物膜完全形成后，通過機械運動和生物活性進行分解或分散[13]。

2 KPN生物膜的調(diào)控機制

在生物膜的形成過程中，KPN主要依靠Ⅰ型菌毛和Ⅲ型菌毛完成在介質(zhì)表面的附著和聚集，Ⅰ型菌毛主要促進細菌在表面含有甘露糖成分的物質(zhì)（如泌尿生殖道上皮細胞）上黏附，Ⅲ型菌毛則主要介導(dǎo)氣管上皮細胞、腎小管細胞以及非生物材料表面（如留置的導(dǎo)管和氣管內(nèi)管）上的生物膜的形成[14， 15]。菌毛介導(dǎo)穩(wěn)定地黏附，而多糖最終影響生物膜結(jié)構(gòu)和細胞間通訊。脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）是革蘭陰性菌細胞膜的主要成分，與Ⅲ型菌毛共同介導(dǎo)KPN在非生物表面的初始黏附[16]。莢膜多糖（capsular polysaccharide， CPS）則發(fā)揮進一步穩(wěn)定細菌黏附性的作用，并適當調(diào)整菌落間的空間分布，促進三維結(jié)構(gòu)生物膜的成熟[17-18]。臨床KPN分離株常擁有極厚、高黏滯的胞外多糖莢膜，這使得KPN相較于其他革蘭陰性菌更易形成生物膜[11]。

另外，鑒于細菌生物膜是一個高度調(diào)節(jié)的過程，嵌入的細菌必須具有快速而廣泛地改變基因表達的能力來應(yīng)對生物膜內(nèi)外環(huán)境的動態(tài)變化。目前研究發(fā)現(xiàn)，KPN生物膜主要由群體感應(yīng)（quorum sensing， QS）和環(huán)鳥二苷（c-di-GMP）兩種信號網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)節(jié)[4，19]。KPN地QS系統(tǒng)目前所知主要由AHL、AI-2兩種信號分子介導(dǎo)，這些信號分子在KPN生物膜形成中具有重要作用[20-21]。當細菌間分泌的信號分子濃度達到閾值時，可觸發(fā)信號傳導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，信號分子與相對應(yīng)的同源受體結(jié)合后激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，可以誘導(dǎo)CPS、LPS、菌毛等多種基因的表達，啟動生物膜的形成，誘導(dǎo)生物膜成熟。近期的研究[9]表明，在ΔluxS（AI-2信號分子的合成基因）突變體中觀察到生物膜的表面覆蓋較少，大菌落形成減少。通過對生物膜提取物的RT-PCR評估，發(fā)現(xiàn)AI-2信號分子的減少下調(diào)了LPS合成基因的表達，從而影響了KPN生物膜的早期形成。c-di-GMP網(wǎng)絡(luò)，是一個復(fù)雜的二級信號系統(tǒng)。c-di-GMP在KPN中可以通過與各種細胞受體結(jié)合，控制Ⅲ型菌毛的表達、莢膜和生物膜的形成，在浮游生物和生物膜形成之間的轉(zhuǎn)換以及生物膜結(jié)構(gòu)的發(fā)展中起著重要作用[22-23]。

3 KPN生物膜治療的新策略

目前，臨床上面對KPN生物膜感染的傳統(tǒng)治療策略仍以抗生素為主[24]。研究表明，多黏菌素能夠以濃度依賴性方式抑制KPN生物膜的形成以及減少預(yù)先形成的生物膜[25]。并且，多黏菌素在與其他抗生素（包括美羅培南、替加環(huán)素、利福平）雙藥合用時表現(xiàn)出了明顯優(yōu)于單體的協(xié)同抗KPN生物膜作用[26]。然而，重癥監(jiān)護病房中耐多黏菌素肺炎克雷伯菌的感染正在增加，尤其是發(fā)生在靜脈導(dǎo)管中的生物膜定植[27-28]。在大多數(shù)情況下，需要進行手術(shù)移除導(dǎo)管。然而，更換受感染的導(dǎo)管有造成創(chuàng)傷、限制導(dǎo)管使用和增加治療費用的風(fēng)險[29]。因此，尋找抗生素替代品成為當前治療細菌感染的新方向。近年來，出現(xiàn)了幾種治療生物膜感染的新方法。這些方法既可以用來防止生物膜的形成，也可以用來處理現(xiàn)有的生物膜，如QS抑制劑、抗菌肽、噬菌體、納米顆粒以及這類不同化合物的組合（圖2）。

3.1 QS抑制劑——阻斷生物膜內(nèi)外的信號傳導(dǎo)

QS是一個由細菌基因表達、生物膜內(nèi)容物內(nèi)小細胞外信號分子的產(chǎn)生和檢測協(xié)調(diào)的過程。在KPN中主要存在兩種與細胞間通訊有關(guān)的信號分子，包括AHL、AI-2。這些分子在細菌群體中誘導(dǎo)了幾種不同的行為，可能包括毒力因子和生物膜形成。

QS抑制劑可以通過抑制信號分子合成酶、降解信號分子、抑制信號分子與受體的結(jié)合等多種手段阻斷QS級聯(lián)反應(yīng)，抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，減少細菌生物膜的產(chǎn)生或抑制細菌生物膜的成熟和擴散[30-31]。Cadavid等[32]評估了27種以前報告為QS抑制劑的化合物，包括呋喃、苯基酰基衍生物、吡咯、吡啶和吡嗪等，對KPN ATCC13884生物膜形成的影響。所有抑制實驗均通過光密度進行評估，使用結(jié)晶紫對形成的總生物量進行染色。最終，只有3-甲基-2（5H）-呋喃酮對KPN ATCC13884生物膜表現(xiàn)為凈效應(yīng)。3-甲基-2（5H）-呋喃酮通過干擾AHL信號分子的合成阻斷了QS系統(tǒng)的級聯(lián)反應(yīng)，抑制了生物膜的形成和成熟，通過減弱細菌的運動活性避免了生物膜的進一步傳播。在聚氯乙烯（PVC）導(dǎo)管上的黏附試驗中，KPN的黏附能力下降。即使在細菌擁有成熟生物膜的情況下，3-甲基-2（5H）-呋喃酮可以增加慶大霉素對KPN的體外活性，與常規(guī)抗生素具有一定的協(xié)同作用。目前，關(guān)于QS抑制劑治療KPN生物膜的研究仍相對較少，尤其是AI-2信號分子作為一種重要的種間細菌通信介質(zhì)在細菌聚集生物膜中具有重要的調(diào)節(jié)作用，未來可以將注意力放在作用于已經(jīng)驗證的AI-2信號分子QS抑制劑，如芍藥苷[33]、蘆丁[34]、綠茶多酚[35]、哈巴俄苷[36]等，探索其在抑制KPN生物膜的作用和機制。

3.2 抗菌肽——協(xié)同抗生素滲透生物膜

抗菌肽（antimicrobial peptides， AMPs）是一種小的多肽分子，具有廣譜抗菌活性，能夠抑制或殺死不同類型的微生物[37-39]。根據(jù)抗菌肽數(shù)據(jù)庫，迄今為止已有超過3324種抗菌肽被描述[40]。AMPs對浮游細菌具有廣泛的活性，對聚集在生物膜中的細菌也有很好的效果。近年來，AMPs表現(xiàn)出的抗KPN生物膜活性受到廣泛關(guān)注，盡管其潛在機制似乎尚不清楚[41]。

Cardoso等[42]報道了一種新型富含聚丙氨酸的陽離子AMP，命名為Pa-MAP 1.9，評估了其對肺炎克雷伯菌ATCC和臨床分離株的浮游和生物膜形式的活性。應(yīng)用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，Pa-MAP 1.9對24～96 μmol/L范圍內(nèi)的所有菌株均有活性。在生物膜生長速率下，該肽表現(xiàn)出更好的活性，其濃度為1.1 μmol/L。通過降低生物膜的體積和高度，還檢測到了Pa-MAP 1.9對預(yù)成型生物膜的強抑制。研究結(jié)果表明，AMPs針對KPN具有獨立于浮游細菌抗菌作用之外的抗生物膜特性。除此之外，多種AMPs同樣表現(xiàn)出了顯著的抗KPN生物膜活性，如pepW[43]、RcAlb PepII[44]、WMR-K[45]、WLBU2[46]等，但都缺少相關(guān)的機制研究，仍需要進一步的試驗探索。目前，針對肺炎克雷伯菌的AMPs抗生物膜機制探索最多的是廣譜合成多肽IDR-1018、DJK-5和DJK-6[47]。這些多肽通過信號素介導(dǎo)的嚴緊反應(yīng)損害生物膜，因為它們結(jié)合并促進信號核苷酸（p）ppGpp的降解，同時也增強了常規(guī)抗生素對肺炎克雷伯菌生物膜的體外活性，包括耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的臨床分離株。在小鼠皮下膿腫模型中，美羅培南聯(lián)合DJK-5和環(huán)丙沙星聯(lián)合IDR-1018可協(xié)同減少肺炎克雷伯菌的負荷[48]?？偟膩碚f，AMPs可以通過擾亂病原體的嚴緊反應(yīng)發(fā)揮抗生物膜活性，并能夠協(xié)助抗生素滲透來增強抗生素的活性，體現(xiàn)了AMPs與抗生素在KPN生物膜感染上的聯(lián)合治療潛力[41]。

3.3 噬菌體——降解生物膜基質(zhì)

噬菌體是一種可以在細菌內(nèi)感染和繁殖的病毒[49]。大約100年前，甚至在抗生素發(fā)現(xiàn)之前，就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了噬菌體，并在臨床上用于治療細菌感染。然而，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，噬菌體療法逐漸被忽視[50-51]。在抗生素有效性的逐漸降低的今天，人們才重新燃起了研究噬菌體療法的興趣。

噬菌體的抗菌機制和抗生物膜機制已經(jīng)被廣泛研究。在非生物膜細菌感染時，噬菌體首先克服細菌細胞膜的防御機制，然后將基因組并入細胞質(zhì)中進行增殖，通過增殖破壞細菌細胞的正常功能，從而使細胞失活或死亡[52]。而針對細菌生物膜感染時，噬菌體必須能夠編碼降解生物膜基質(zhì)的解聚酶，包括降解聚合物、莢膜多糖和細胞外DNA，才能進入細胞膜和受體[53]。因此，能夠編碼解聚酶的噬菌體是抗生物膜感染的一個重要研究方向。Hao等[54]鑒定了一種長尾噬菌體ΦSRD2021，該噬菌體對K47血清型耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae， CRKP）具有特異性，在其尾部纖維蛋白中顯示一個莢膜解聚酶結(jié)構(gòu)域，能有效地溶解宿主CRKP A1806的浮游細胞和生物膜。直接用ΦSRD2021治療感染幼蟲，能顯著提高幼蟲的存活率。更重要的是，噬菌體預(yù)處理和噬菌體延遲處理都能有效地保護幼蟲，并且在小鼠肺炎克雷伯菌直腸定植模型中也觀察到了治療效果。這些數(shù)據(jù)表明，ΦSRD2021具有潛在的預(yù)防和治療效果，并可能提供一個可行的對抗CRKP腸道定植的抗生素替代療法[54]。事實上，除了解聚酶外，噬菌體編碼的溶菌酶（溶菌素、溶菌素等）也可以發(fā)揮消化生物膜基質(zhì)的作用[55-56]。Li等[49]用CRKP臨床分離株對54種噬菌體的抗菌作用進行評估。在54種噬菌體中，屬于尾狀病毒目肌病毒科的噬菌體P545，能夠在70 min內(nèi)顯著抑制細菌生長。結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，P545不僅能抑制生物膜的形成，還能降解已形成的成熟生物膜。然而，菌斑形態(tài)分析表明，噬菌體P545是一種非產(chǎn)出解聚酶的噬菌體?；赗AST預(yù)測，在P545基因組中發(fā)現(xiàn)了兩個尾部溶菌酶基因。因此，噬菌體P545對生物膜形成的抑制和成熟生物膜的降解可能與其編碼的尾溶菌酶有關(guān)[49]。

3.4 納米顆粒——載藥輸送至生物膜內(nèi)部

在過去十年中，許多出版物都將納米技術(shù)作為一種替代治療方法，用于治療細菌及其生物膜的感染，并將其作為藥物輸送系統(tǒng)[57]。納米顆粒（nanoparticles， NPs）抗生物膜的作用機制主要包括：在生物膜組件中，釋放的離子與某些官能團相互作用；釋放導(dǎo)致細菌破壞和EPS降解的活性氧類；載有抗菌劑的高分子納米粒子通過生物膜滲透到細菌體內(nèi)，并向細菌體內(nèi)輸送藥物；近紅外光照射下的光熱效應(yīng)引起局部熱量上升，對胞外多糖和細菌細胞有明顯的抑制作用；脂質(zhì)體包裹抗菌藥物，與細胞膜融合，直接在細菌細胞內(nèi)釋放抗菌藥物[58]。

銀納米顆粒（silver nanoparticles， AgNPs）是一種主要的納米顆粒，其在對抗致病性多重耐藥細菌方面具有非凡的潛力，是治療細菌感染的替代方法[57]。Siddique等[59]評估AgNPs對多重耐藥肺炎克雷伯菌MF953599和MF953600臨床分離株的抗菌和抗生物膜效果。AgNPs的MIC分別為62.5和125 μg/mL，而其MBC分別為250和500 μg/mL。AgNPs處理后，細胞外多聚物的產(chǎn)生減少，而由于AgNPs更高的細胞膜破壞率，細胞蛋白泄漏增加。在AgNPs濃度為100 μg/mL時，肺炎克雷伯菌菌株MF953600的生物膜抑制率為64%，MF953599的生物膜抑制率為86%。在濃度為15～120 μg/mL時，AgNPs的細胞毒性最低，安全性最高。研究證明，AgNPs是安全的抗多藥耐藥肺炎克雷伯菌（multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae， MDR-KP）和抗MDR-KP生物膜化合物。AgNPs同時又可以作為抗生素和天然抗菌劑的載體[59]。Foroohimanjili等[60]研究了歐楂提取物合成的AgNPs對MDR-KP菌株的抗菌、抗生物膜活性。研究結(jié)果表明，歐楂提取物-AgNPs具有平均尺寸為17.60 nm的球形納米結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出劑量依賴性的抗菌活性。微量滴定板和RT-PCR方法的結(jié)果表明，歐楂提取物-AgNPs抑制了MDR-KP的生物膜形成，并且在亞微量抑制濃度的AgNPs處理后，多藥耐藥菌株中Ⅲ型菌毛基因（mrkA）和群體感應(yīng)系統(tǒng)基因（luxS）的表達顯著下調(diào)。綜上所述，歐楂提取物-AgNPs有效地防止了生物膜的形成，并殺死了已建立的生物膜中的細菌，這表明歐楂提取物-AgNPs可能是預(yù)防和治療由MDR-KP菌株引起的生物膜相關(guān)感染的一個有希望的候選者[60]。

4 小結(jié)與展望

生物膜的形成提供了細胞免受不利環(huán)境因素、抗菌劑或免疫系統(tǒng)成分影響的物理保護屏障，這使得KPN耐藥菌株的治療更加困難。最近的一項流行病學(xué)調(diào)查顯示，臨床肺炎克雷伯菌分離株的生物膜形成能力與各自患者的預(yù)后顯著相關(guān)，生物膜的形成明顯減少了患者的存活天數(shù)[61]。目前，生物膜感染的化學(xué)治療一般是長期聯(lián)合使用多種抗生素，而這種策略并不能有效地改善患者預(yù)后[62]。本文梳理了近年來關(guān)于KPN生物膜的新發(fā)現(xiàn)，總結(jié)了包括QS抑制劑、抗菌肽、噬菌體和納米顆粒等4種新型抗菌化合物治療KPN生物膜感染的機制和效果。盡管這里所述的新型抗菌成分已被證明對體外生物膜有效，但是對治療機制的認識還處于初級階段，并且大多停留在體外試驗階段缺少體內(nèi)效果證據(jù)。未來的研究應(yīng)進一步了解KPN生物膜形成和成熟的調(diào)控機制，增加新型抗菌化合物體內(nèi)實驗的比重，并探索多種不同抗生物膜策略的協(xié)同效應(yīng)。另外，一些治療生物膜感染的新技術(shù)如磁場、光動力療法和超聲波的應(yīng)用等在KPN生物膜上的研究報道相對較少，這些新技術(shù)的應(yīng)用以及與各種抗菌化合物的協(xié)同應(yīng)用可能是今后研究的新方向。筆者認為，未來有效的治療最有可能來自于針對生物膜多樣機制的不同策略的組合。

參 考 文 獻

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