張鵬?李婕?曹若楠

摘要：目的 研究產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae， Kp）對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥的分子機制。方法 臨床分離2株對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥的產(chǎn)KPC酶Kp C9和C14，利用膠體金法進行碳青霉烯酶型檢測，基質輔助激光解吸飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）進行同源性分析，MIC法進行藥物最低抑菌濃度檢測，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及基因測序檢測外膜蛋白表達及基因突變，羰基氰化物間氯苯腙（CCCP）抑制試驗檢測主動外排機制。結果 產(chǎn)KPC酶Kp C9和C14同其他產(chǎn)KPC酶Kp同源性較低，對頭孢他啶/阿維巴坦的MIC分別為16和32μg/mL，外膜蛋白SDS-PAGE顯示Kp C9和C14均有OmpK36的缺失，外膜蛋白基因序列分析顯示Kp C9和C14的OmpK36基因序列均存在個別位點的突變、缺失，CCCP抑制試驗顯示CCCP不能提高Kp C9和C14對頭孢他啶/阿維巴坦的敏感性。結論 KPC酶合并膜孔蛋白OmpK36缺失可引起Kp對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥。

關鍵詞：肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；膜孔蛋白；頭孢他啶/阿維巴坦

中圖分類號： R978.1文獻標志碼：A

Molecular mechanism of resistance of Klebsiella pneumoniae to ceftazidime/avibactam due to combination of KPC enzyme and the loss of OmpK36 porin

Zhang Peng， Li Jie， and Cao Ruo-nan

（Clinical Laboratory， Yijishan Hospital of Wannan Medical College， Wuhu 241001）

Abstract Objective To study the molecular mechanism of resistance of Klebsiella pneumoniae （KP） producing KPC enzyme against ceftazidime/avibactam. Methods? ? Kp C9 and C14 which producing KPC enzyme resistant to ceftazidime/avibactam were clinically isolated， and the carbapenemase type was detected by the colloidal gold method. Homology analysis was carried with matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS）. The minimum inhibitory concentration （MIC） method was used to perform drug resistant tests. Outer membrane protein expressions were examined by SDS-PAGE. Gene mutations were detected by gene sequencing. Inhibition assays were performed by carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone （CCCP） to detect active efflux system. Results? ? Kp C9 and C14 producing KPC enzyme have low homology with other Kp producing KPC enzymes. MIC of Kp C9 and C14 to ceftazidime/avibactam was 16～32 μg/mL， respectively. SDS-PAGE showed that both Kp C9 and C14 had the loss of OmpK36. The OmpK36 gene sequence of Kp C9 and C14 contained a few point mutations and deletions at individual sites. The MIC of ceftazidime/avibactam did not change in the presence of CCCP. Conclusion? ? Ceftazidime/avibactam resistance in Kp C9 and C14 isolates is attributable to the production of KPC enzyme combined with the loss of OmpK36 porin.

Key words Klebsiella pneumoniae; Carbapenemase; Porin; Ceftazidime/Avibactam

碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌近來成為危害全球公共衛(wèi)生安全的主要病原體[1-2]，碳青霉烯類耐藥機制包括細菌產(chǎn)碳青霉烯酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、外排系統(tǒng)上調(diào)、膜孔蛋白缺失所致外膜滲透性改變等[3]。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase， KPC）于1996年美國北卡羅來納州發(fā)現(xiàn)并在全世界廣泛傳播[4]。產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類藥物及大多數(shù)抗菌藥物均耐藥，給臨床治療帶來了一定的困難。2015年以來，阿維巴坦作為一種新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，因其具有長半衰期、低分子量、親和重要催化基團等優(yōu)點，與頭孢他啶組合后針對產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌較其他藥物治療效果更為明顯[5]。但經(jīng)過一段時間的臨床應用，腸桿菌目細菌對頭孢他啶/阿維巴坦（ceftazidime/avibactam， CZA）耐藥率亦有報道，有研究顯示世界范圍內(nèi)腸桿菌目細菌對CZA耐藥率平均水平低于2.6%[6]，而2017年中國報道該耐藥率為5.4%[7]，高于全球平均水平。2021年2—3月我們于本院分離得到2株Kp C9和C14，經(jīng)分析兩者均產(chǎn)KPC酶，與其他產(chǎn)KPC酶Kp同源性較低，并同時合并膜孔蛋白OmpK36缺失導致對CZA耐藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

Kp C9，于2021年2月分離自皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院重癥醫(yī)學科1例72歲女性患者痰液標本。該患者患有主動脈瓣狹窄、肺動脈高壓、重癥肺炎、呼吸衰竭等疾病，入院后行Morrow術+主動脈瓣置換+二尖瓣/三尖瓣成形術，術后轉入重癥醫(yī)學科并發(fā)多器官功能衰竭、肺部感染加重，使用哌拉西林/他唑巴坦鈉3.375 g q8h治療1周后分離得到Kp。

Kp C14，于2021年3月分離自皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院血液內(nèi)科1例51歲女性患者中心靜脈導管標本。該患者患有急性髓系白血病、腔隙性梗死、上呼吸道感染等疾病，入院后行同胞全合異基因造血干細胞移植，出現(xiàn)發(fā)熱，使用利奈唑胺0.6 g q12 h和亞胺培南/西司他丁鈉1 g q6 h各治療5 d和3 d后分離得到Kp。

其他18株對CZA敏感產(chǎn)KPC酶Kp分離自皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院住院患者微生物送檢標本。

以上菌株經(jīng)VITEK-2全自動細菌鑒定儀鑒定均為Kp。外膜蛋白分析選擇Kp ATCC13883作為對照菌株。

1.1.2 主要儀器與試劑

VITEK-2全自動細菌鑒定與藥敏分析系統(tǒng)及配套試劑（法國BioMérieux公司）、CP5-01碳青霉烯酶檢測試劑盒（天津一瑞生物科技股份有限公司）、MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)及配套試劑（法國BioMérieux公司）、垂直電泳儀及聚丙烯酰胺凝膠（美國Bio-rad公司）、PCR試劑盒（日本Takara公司）、質粒小量提取試劑盒（德國Qiagen公司）、羰基氰化物間氯苯腙（美國Sigma公司）、血平板及巧克力平板（濟南百博生物技術股份有限公司）、MH瓊脂平板（英國Oxoid公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感試驗

使用VITEK-2配套的革蘭陰性菌藥敏卡AST-N334測定臨床分離Kp對常見抗菌藥物的MIC值，采用微量肉湯稀釋法測定Kp對CZA和多黏菌素B的MIC值。檢測結果根據(jù)美國臨床與實驗室標準化研究所CLSI M100-S30推薦的折點進行判讀。

1.2.2 碳青霉烯酶型鑒定

采用膠體金免疫層析技術，檢測樣本與金標抗體結合形成抗原抗體免疫復合物，通過毛細作用在纖維素膜上層析并與包被固化的碳青霉烯酶單抗反應，形成雙抗體夾心檢測條帶，固定于KPC、NDM、IMP、VIM和OXA-48相應檢測線上。

1.2.3 菌株同源性分析

將臨床分離Kp菌株涂布靶板孔位，室溫晾干后，加1 μL 70%甲酸覆蓋樣本，晾干后再加1 μL IVD HCCA基質液，加樣完成后將靶板放入質譜儀進行蛋白質指紋峰圖譜采集，通過不同位置100次激光點擊獲得蛋白譜峰信息，經(jīng)VITEK MS SARAMIS軟件分析鑒定結果并利用配套科研軟件導入圖譜數(shù)據(jù)庫對檢測結果進行聚類分析，相似度<70%者為不同質譜型別。

1.2.4 外膜蛋白及基因序列分析

Kp C9、C14和其他Kp及標準菌株分別接種于MH肉湯培養(yǎng)基，37℃搖床過夜，超聲破碎細菌，100000×g 4℃離心1 h后收集沉淀，用含2%十二烷基肌酸鈉Tris-Mg重懸沉淀，室溫放置30 min，重復2次，外膜蛋白與上樣緩沖液充分混勻煮沸5 min后進行SDS-PAGE，25 mA恒流電泳70 min后考馬斯亮藍染色，對比臨床分離菌株和標準菌株外膜蛋白表達的差異。同時應用參考文獻[8]引物PCR擴增OmpK36基因并送交安徽佰歐晶醫(yī)學科技有限公司進行序列分析。

1.2.5 外排系統(tǒng)機制分析

同時制備含有50 μmol/L CCCP和不含CCCP的CZA濃度梯度為1～32 μg/mL的MH培養(yǎng)基，將Kp C9和C14接種于該MH培養(yǎng)基，測定細菌的MIC值。

2 結果

2.1 Kp對抗菌藥物的耐藥結果

收集臨床分離耐碳青霉烯類Kp 20株，其中Kp C9和C14對CZA的MIC值分別為16 μg/mL和32 μg/mL，結果判斷為耐藥。除CZA外，Kp C9對其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物均呈現(xiàn)高水平耐藥，對多黏菌素B、阿米卡星、復方磺胺甲惡唑敏感，Kp C14對其他β內(nèi)酰胺類抗菌藥物也呈現(xiàn)高水平耐藥，僅對多黏菌素B、阿米卡星敏感，見表1。其余18株Kp對CZA的MIC值分別為0.5～2 μg/mL，結果判斷為敏感。

2.2 Kp產(chǎn)碳青霉烯酶表型鑒定及同源性分析

20株耐碳青霉烯類Kp采用膠體金免疫層析技術定性檢測碳青霉烯酶型，結果顯示所有Kp均為KPC酶陽性，見圖1。再使用質譜儀對該20株Kp進行蛋白質指紋峰圖譜采集，并對檢測結果進行聚類分析并構建發(fā)育樹，根據(jù)不同菌株質譜間相似度>70%劃分為同一質譜型別，結果顯示Kp C14與其余19株Kp親緣關系較遠，Kp C9與其余18株Kp親緣關系較遠，剩余Kp之間親緣關系較近，見圖2。

2.3 Kp外膜蛋白及基因序列檢測結果

Kp ATCC13883和20株Kp的外膜蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，Kp ATCC13883可見4種蛋白，LamB位于相對分子質量46000條帶，OmpA位于相對分子質量32000條帶，OmpK36位于相對分子質量39000條帶，OmpK35位于相對分子質量35000條帶。Kp C9和C14都有相對分子質量39000條帶的缺失，而其他Kp條帶與質控菌株均相同（圖3）。Kp C9和C14經(jīng)OmpK36引物PCR擴增后產(chǎn)物測序與GenBank中Kp C3（登錄號：Z33506.1）數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，Kp C9和C14的OmpK36基因序列存在個別位點的突變、缺失，其中Kp C9點突變74個，缺失堿基數(shù)2個，Kp C14點突變79個，缺失堿基數(shù)20個。

2.4 主動外排機制檢測結果

在含有CCCP的不同濃度CZA MH培養(yǎng)基中，Kp C9對CZA MIC值為16 μg/mL，Kp C14對CZA MIC值為32 μg/mL，與不含CCCP時MIC結果相同，表明Kp C9和C14對CZA不存在主動外排耐藥機制。

3 討論

KPC型絲氨酸酶最常見于耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌對大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物呈現(xiàn)高度耐藥，且對亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類藥物也耐藥[9]。隨著多重耐藥菌在全世界不斷增多，臨床迫切需求新型抗菌藥物[10]。治療策略之一就是選擇β-內(nèi)酰胺類藥物聯(lián)合β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，然而傳統(tǒng)的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如克拉維酸、他唑巴坦、舒巴坦等對某些β-內(nèi)酰胺酶缺乏活性，導致對多重耐藥菌治療無效[11]。阿維巴坦作為一種新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑對Ambler A類、C類甚至某些D類酶具有廣泛的活性[12]。有研究表明阿維巴坦聯(lián)合頭孢他啶對產(chǎn)ESBL酶、AmpC酶、KPC酶、OXA-48等腸桿菌目細菌和多重耐藥銅綠假單胞菌均有良好的抗菌效果[13-14]。體外試驗研究顯示頭孢他啶/阿維巴坦對腸桿菌目細菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、腸桿菌屬細菌的MIC90為0.5 μg/mL，而單獨頭孢他啶對腸桿菌目細菌的MIC90為64 μg/mL，美羅培南耐藥腸桿菌目細菌有83.5%對頭孢他啶/阿維巴坦敏感[15]。對于產(chǎn)KPC酶腸桿菌目細菌，頭孢他啶/阿維巴坦敏感率為97.5%[16]。頭孢他啶/阿維巴坦對非發(fā)酵菌如銅綠假單胞菌的MIC90為8 μg/mL，而單獨頭孢他啶對銅綠假單胞菌的MIC90為64 μg/mL，美羅培南耐藥銅綠假單胞菌有72%對頭孢他啶/阿維巴坦敏感[17]，對于產(chǎn)KPC酶銅綠假單胞菌，頭孢他啶/阿維巴坦敏感率為76%[16]。因此，頭孢他啶/阿維巴坦對碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌具有更好的抗菌活性。

盡管頭孢他啶/阿維巴坦被批準用于臨床時間不長，但一些國家和地區(qū)已有該藥耐藥的報道，需引起廣泛關注。目前腸桿菌目細菌對頭孢他啶/阿維巴坦總體耐藥率為0.6%，其中產(chǎn)ESBL酶菌株對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥率為2.8%[18-19]，而產(chǎn)碳青霉烯酶菌株對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥率高達24.7%[20]，尤其產(chǎn)金屬酶菌株耐藥率更高達98.6%[21]。對肺炎克雷伯菌而言，耐碳青霉烯類菌株對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥率可達16.7%～21%[22-23]。究其耐藥原因，主要有以下幾方面：①膜孔蛋白缺失致外膜滲透性改變，當OmpK36存在時，肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦MIC值為0.5～1 μg/mL[24]，②外排系統(tǒng)功能增強，有研究表明外排泵抑制劑PAβN并未增加肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦的MIC值[25]，③靶蛋白突變，PBP3蛋白氨基酸插入可增加大腸埃希菌對頭孢他啶/阿維巴坦的MIC值[26]。本研究收集耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌20株，碳青霉烯酶型鑒定均產(chǎn)KPC酶，藥敏結果顯示C9和C14兩株菌對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥，其余肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦均敏感，為進一步研究該兩株菌耐藥機制，經(jīng)同源性分析發(fā)現(xiàn)C9和C14與其他菌株親緣關系較遠，外膜蛋白SDS-PAGE和基因測序結果顯示C9和C14均有OmpK36蛋白缺失和OmpK36基因序列個別位點的突變、缺失，而其余菌株外膜蛋白條帶均正常，CCCP抑制試驗顯示C9和C14對頭孢他啶/阿維巴坦的MIC值沒有變化。這一結果表明，OmpK36缺失在頭孢他啶/阿維巴坦耐藥中起了重要作用。

綜上所述，頭孢他啶/阿維巴坦作為新型含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抗菌藥物，自2015年上市針對革蘭陰性桿菌尤其腸桿菌目細菌呈現(xiàn)良好的抗菌活性，從一定程度上減輕了多重耐藥菌和泛耐藥菌的抗生素選擇壓力。但頭孢他啶/阿維巴坦耐藥菌株的出現(xiàn)需引起臨床和院感的高度重視，針對此類耐藥菌應避免單獨使用頭孢他啶/阿維巴坦，可考慮聯(lián)合多黏菌素B或氨基糖苷類等藥物進行治療。因此，加強細菌耐藥檢測和耐藥機制研究對臨床合理使用抗菌藥物和醫(yī)院感染管理意義重大。

參 考 文 獻

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