劉淑敏?杜艷?畢建蝶

摘要：目的 分析臨床分離的高黏液型肺炎克雷伯菌（hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae，HMKP）的耐藥性、毒力基因及其分子流行病學特征，為有效防治高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HVKP）的克隆傳播提供依據。方法 通過拉絲試驗收集非重復HMKP菌株。采用PCR檢測毒力基因、莢膜血清型及進行多位點序列分型（MLST）。分別比較K1型和K2型菌株毒力基因攜帶模式的差異，以及毒力基因rmpA或rmpA2陽性組與陰性組毒力基因的攜帶情況。結果 共收集HMKP菌株42株，標本來源以痰液為主（88.10%），主要的疾病分布為腫瘤（26.19%）、呼吸系統(tǒng)疾?。?1.43%）、腦部疾?。?1.43%）。莢膜血清型以K1（28.57%）和K2（33.33%）型為主，85.71%的菌株攜帶高毒力基因rmpA/rmpA2和iucA/iutA。MLST以ST23（21.43%）、ST86 （19.05%）最常見。K1型和K2型有不同的毒力基因攜帶模式，K1型攜帶的毒力基因數(shù)多于K2型。rmpA或rmpA2陽性組的毒力基因rmpA2或 rmpA、iucA 、iutA 攜帶率高于其陰性組（P<0.05）。結論 本院HMKP以K1、K2莢膜血清型為主，ST型主要為ST23、ST86，85.71%的菌株為攜帶高毒力基因rmpA/rmpA2和iucA/iutA的HVKP。

關鍵詞：高黏液型肺炎克雷伯菌；毒力基因；分子流行特征

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Study on the virulence gene and molecular epidemiology

of hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae

Liu Shu-min， Du Yan， and Bi Jian-die

（Department of Clinical Laboratory， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，

Yunnan Key Laboratory of Laboratory Medicine， Yunnan Province Clinical Research Center for Laboratory Medicine， Kunming 650032）

Abstract Objective To analyze the drug resistance， virulence gene and molecular epidemiological characteristics of clinically isolated hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae （HMKP）， so as to provide experimental basis for effective prevention and treatment of clonal transmission of hypervirulent Klebsiella pneumoniae （HVKP）. Methods Non-repetitive HMKP strains were collected by string test. Virulence gene， capsular serotype and multilocus sequence typing （MLST） were detected by PCR. The virulence gene carrying patterns of K1 and K2 strains were compared， and the virulence genes of rmpA or rmpA2 positive group were compared with those of negative group. Results A total of 42 HMKP strains were collected. The samples were mainly from sputum （88.10%）. The main diseases were tumors （26.19%）， respiratory diseases （21.43%） and brain diseases （21.43%）. The main capsular serotypes were K1 （28.57%） and K2 （33.33%）， and 85.71% of the strains carried hypervirulent genes of rmpA/rmpA2 and iucA/iutA. The most common MLST were ST23 （21.43%） and ST86 （19.05%）. K1 and K2 had different virulence gene carrying patterns， K1 carried more virulence genes than K2. The carrying rate of virulence genes rmpA2 or rmpA， iucA， iutA in rmpA or rmpA2 positive group was significantly higher than that in its negative group. Conclusion The main capsular serotypes of HMKP in our hospital are K1 and K2， and the main ST types are ST23 and ST86. And 85.71% of strains are HVKP carrying hypervirulent genes rmpA/rmpA2 and iucA/iutA .

Key words Hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae; Virulence gene; Molecular prevalence characteristics

高黏液型肺炎克雷伯菌（hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae，HMKP）是由經典肺炎克雷伯菌進化來的，在瓊脂平板上生長的菌落出現(xiàn)高黏液表型[1]。HMKP具有較厚的莢膜來抵抗免疫細胞的吞噬和抗菌肽、補體及血清的殺傷作用[2-3]。高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HVKP）與各種侵襲性感染密切相關，且攜帶多種毒力基因，致病力強，死亡率高[4]。研究顯示：大部分HVKP具有高黏液表型和高毒力性，而約51%[5]到98%[6]的HMKP因具有高毒力性可判定為HVKP。并非所有的HMKP都為高毒力，也并非所有HVKP都具有高黏液表型，HVKP與HMKP既緊密聯(lián)系又相互區(qū)別[7]。目前臨床缺乏統(tǒng)一的標準來快速鑒定所有的HVKP菌株，使用高黏液表型預測HVKP雖然存在缺陷，但對臨床及時治療HVKP感染仍具有重要意義。本研究對臨床收集的HMKP進行莢膜血清型、毒力基因、多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）等分析，為完善HVKP生物學信息及明確其代表性生物學標志物，提供分子流行病學依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

MALDI-TOF MS質譜儀和Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定儀（法國Bio-Merieux公司）、Genesy 96T基因擴增熱循環(huán)儀（西安天隆科技有限公司）、DYY-6C雙穩(wěn)定時電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、Image Quant LAS500超靈敏化學發(fā)光成像儀（美國GE Healthcare公司）、哥倫比亞血瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）、細菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）、2×Taq PCR MasterMix（北京博邁德生物公司）、DL2000 DNAMarker（Takara公司）、引物合成（安徽通用生物有限公司）。

1.2 菌株來源

收集昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2018年2月—2020年12月臨床標本中分離的42株非重復HMKP菌株，所有菌株經質譜儀鑒定。HMKP通過拉絲實驗篩選，用接種環(huán)輕觸培養(yǎng)基上單個菌落后向外拉，能夠形成≥5 mm的黏液絲判斷為拉絲試驗陽性[4]，重復3次確認。

1.3 臨床信息收集

所有菌株攜帶者的臨床信息利用LIS系統(tǒng)回顧性分析，包括標本類型、年齡、性別、入住科室、住院時間、侵入性操作和臨床診斷等臨床信息。

1.4 藥敏試驗

VITEK-2 全自動細菌鑒定藥敏儀測定哌拉西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢曲松、氨曲南、美羅培南、亞胺培南、厄他培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素和復方磺胺甲惡唑16種常用抗菌藥物的藥敏結果，藥敏結果判讀依據2020年CLSI M100 S30文件進行。

1.5 PCR檢測常見莢膜血清型及毒力基因攜帶情況

莢膜血清型主要包括：K1、 K2、K2、K5、 K20、K57型，毒力基因主要包括：magA、rmpA、rmpA2、iucA、iutA、iroN、entB、ybtS、kfu、fimH、mrkD、ureA、wabG、alls，使用基因組試劑盒進行菌株DNA提取，PCR反應采用25 μL反應體系：基因組DNA模板1 μL；Taq Master Mix 12.5 μL；ddH2O 9.5 μL；上下游引物各1 μL。引物序列及PCR反應條件參照文獻[7]進行，1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，陽性產物送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測序，測序結果于NCBI網站（http：//www. Ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行BLAST比對。

1.6 MLST

參照文獻[8]對肺炎克雷伯菌的7個管家基因（rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB）進行PCR擴增，產物電泳及測序確認參照1.5，測序結果于MLST網站（pastrur.fr/klebsiella/klebsiella.html）進行比對，得到ST分型。

2 結果

2.1 菌株分布情況

42株HMKP科室分布如下：胸外科（10/42，23.81%）、EICU（10/42，23.81%）、呼吸內科（5/42，11.90%）、神經內科（3/42，7.14%），其他科室均呈散在分布。標本來源以痰液為主（37/42，88.10%），其次是血（2/42，4.76%）和分泌物（2/42，4.76%），最后是咽拭子（1/42，2.38%）。主要的疾病分布如下：腫瘤（11/42，26.19%）、呼吸系統(tǒng)疾?。?/42，21.43%）、腦部疾?。?/42，21.43%）。

2.2 藥敏結果分析

藥敏結果顯示本研究的42株HMKP對16種常用抗菌藥物均處于較低的耐藥水平，如圖1所示。其中對碳青霉烯類抗生素（亞胺培南、美羅培南、厄他培南）耐藥的2株HMKP對其他的13種抗菌藥物均耐藥。

2.3 莢膜血清型分布

42株HMKP中，莢膜血清型以K1和K2型為主，K1型12株，占28.57%，K2型14株，占33.33%，兩者共占61.90%。未檢出K20和K54型菌株，見圖2。

2.4 毒力基因分布情況

42株HMKP中，毒力基因magA（28.57%）、iroN（9.52%）、kfu（42.86%）、alls（26.19%）攜帶率較低，其他毒力基因攜帶率均在70%以上，且高毒力基因rmpA/rmpA2和iucA/iutA的攜帶率高達85.71%。見圖3。在K1型和K2型菌株的毒力基因組合模式中，12株K1型菌株包含4 種模式，以magA+rmpA+rmpA2+iucA+iutA+entB+ybtS+kfu+fimH+mrkD+ureA+wabG+alls為主（9/12，75%）；而14株K2型菌株包含5種模式，以rmpA+rmpA2+iucA+iutA+entB+ybtS+fimH+mrkD+ureA+wabG為主（7/14，50%），見表1。此外，毒力基因alls和magA僅在K1型菌株中檢出。

2.5 rmpA或rmpA2陽性組與陰性組比較

在42株菌中，rmpA陽性組的毒力基因rmpA2、iucA 、iutA攜帶率高于其陰性組（P<0.05），rmpA2陽性組的毒力基因rmpA、iucA和iutA攜帶率高于其陰性組（P<0.05） ，見表2。

2.6 多位點序列分型分布情況

結果顯示42株HMKP經MLST分為20個ST型，見表3。其中以ST23（9/42，21.43%）、ST86（8/42，19.05%）最常見，其他ST型分布較散。

3 討論

本研究中HMKP主要分離自患有腫瘤、呼吸系統(tǒng)和腦部疾病患者，與安徽地區(qū)研究結果較相似[9]，此外大部分患者均進行過手術、呼吸機、氣管插管等侵入性操作，可能造成局部免疫力薄弱而更易誘發(fā)感染[3，10]。藥敏結果顯示42株HMKP對臨床常用抗生素耐藥率較低，出現(xiàn)的兩株碳青霉烯類耐藥的HMKP應引起重視，以免造成高耐藥合并高毒力肺炎克雷伯菌的局部暴發(fā)流行。

根據細菌表層一種有抗原性的莢膜多糖可將肺炎克雷伯菌分成78種以上莢膜血清型[11]。本研究42株HMKP中，莢膜血清型以K1和K2型為主，與以往研究[11]結果一致。HVKP最常見的莢膜血清型是K1，其次是K2，K5和K57[12-13]，但不能完全依賴莢膜類型來判斷本研究K1和K2型HMKP為高毒力菌株[12]。

研究[14]提出HVKP生物學標志可能是莢膜血清型與毒力因子的組合，通過對比分析發(fā)現(xiàn)：本研究12株K1型HMKP中，有9株是magA+rmpA+rmpA2+iucA+iutA+entB+ybtS+kfu+fimH+mrkD+ureA+wabG+alls毒力因子組合，攜帶了絕大部分毒力基因，而在14株K2型HMKP中有7株是rmpA+rmpA2+iucA+iutA+entB+ybtS+fimH+mrkD+ureA+wabG毒力因子組合，整體來看K2型攜帶的毒力基因數(shù)少于K1型，這可能是K1型肺炎克雷伯菌具有更強的侵襲力的原因。

HVKP最具特征性的毒力因子由毒力質粒編碼，包括氣桿菌素鐵載體生物合成基因iucABCD-iutA、黏液表型調節(jié)因子rmpA、rmpA2[15]，當rmpA/rmpA2合并iucA/iutA陽性可判定為HVKP[16]。本研究中有85.71% HMKP菌株攜帶高毒力基因rmpA/rmpA2和iucA/iutA，可預測為HVKP，提示本研究大部分HMKP具有較高毒力。rmpA2和rmpA功能相似，調控莢膜大量合成，導致高黏液表型，與菌株毒力密切相關[17-18]。本研究HMKP菌株rmpA2和rmpA攜帶率較高，同樣證實了rmpA2和rmpA與菌株高黏液表型相關。此外研究表明鐵載體的產生可能與高黏液表型協(xié)同作用[19]，本研究在rmpA或rmpA2陽性組與陰性組比較時發(fā)現(xiàn)，rmpA或rmpA2陽性組的毒力基因 rmpA2或rmpA、iucA 、iutA攜帶率高于其陰性組，提示在HMKP中氣桿菌素鐵載體的產生可能與黏液表型調節(jié)因子rmpA和rmpA2相關。

本研究42株HMKP共檢出20個ST分型，以ST23、ST86 最常見，其他ST分型相對分散，結果與以往研究相近[11，20]。提示本院HMKP分子流行特征分布廣泛，出現(xiàn)較多的變異型。應引起臨床密切關注。

綜上所述，本院HMKP以K1、K2莢膜血清型為主，ST序列分型主要為ST23、ST86，85.71%的菌株為攜帶高毒力基因rmpA/rmpA2和iucA/iutA的HVKP。建議實驗室結合HMKP的莢膜血清型、毒力基因、MLST和高黏液表型判斷是否為HVKP。

參 考 文 獻

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