李振?楊萍?殷瑜?陳代杰

摘要：目的 研究鮑曼不動(dòng)桿菌基因組上3個(gè)基因ptkD569N，shlBR403H及iclRY49H分別與基因pmrAI13M雙位點(diǎn)突變，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性和生物膜形成的影響。方法 在突變菌株AT196011的基礎(chǔ)上，通過(guò)同源重組，構(gòu)建3株雙突變菌株AT196012、AT196013和AT196014；通過(guò)生長(zhǎng)曲線考察不同點(diǎn)突變對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響；采用微量肉湯稀釋法測(cè)定突變菌株對(duì)多黏菌素的最低抑菌濃度；通過(guò)時(shí)間-殺菌曲線動(dòng)態(tài)分析，比較各突變菌株對(duì)多黏菌素的耐藥性差異；采用結(jié)晶紫染色法對(duì)生物膜進(jìn)行半定量測(cè)定，并用CCK-8試劑對(duì)生物膜內(nèi)活菌數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定。結(jié)果 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)與測(cè)序表明三株雙突變菌株構(gòu)建成功。各突變菌株對(duì)多黏菌素的最低抑菌濃度和時(shí)間-殺菌曲線表明，相較于AT196011單突變菌株，雙突變株AT196012和AT196014對(duì)多黏菌素的耐藥性增強(qiáng)，而AT196013的耐藥性無(wú)明顯變化；在生物膜形成方面，3株雙突變菌株的生物膜生成量顯著高于AT196011單突變菌株；1/2 MIC濃度的多黏菌素對(duì)AT196013與AT196014雙突變菌株生物膜形成的抑制作用顯著低于AT196011單突變菌株，其生物膜內(nèi)活菌量也顯著多于AT196011單突變菌株。結(jié)論 基因ptkD569N、iclRY49H和基因pmrAI13M的雙點(diǎn)突變，會(huì)增加鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多黏菌素的耐藥性；基因ptkD569N，shlBR403H和iclRY49H和pmrAI13M的雙點(diǎn)突變，會(huì)協(xié)同促進(jìn)生物膜的形成，且shlBR403H和 iclRY49H的促進(jìn)作用更強(qiáng)，相應(yīng)雙突變菌株對(duì)多黏菌素的耐受性更強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：鮑曼不動(dòng)桿菌；基因點(diǎn)突變；耐藥性；生物膜；多黏菌素

中圖分類號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Correlation study between gene point mutation of Acinetobacter baumannii

and drug resistance and biofilm characteristics

Li Zhen， Yang Ping， Yin Yu， and Chen Dai-jie

（School of Pharmacy， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240）

Abstract? ? Objective To investigate the effects of three point mutations in three different genes （ptkD569N， shlBR403H and iclRY49H） on drug resistance and biofilm formation in Acinetobacter baumannii. Methods Homologous recombination was used to create three double mutant strains， AT196012， AT196013， and AT196014， based on the previously created mutant strain AT196011; growth curves were used to examine the effects of various point mutations on bacterial growth， and the micro-broth dilution method was used to estimate the mutant strains lowest inhibitory concentration for colistin; the differences in the resistance of each mutant strain to colistin were compared using dynamic analysis of the time-kill curve; the biofilms were semi-quantitatively quantified by crystal violet staining， and CCK-8 reagent was used to measure relative viable bacterial counts in the biofilms. Results Three double mutant strains were successfully created， according to the electrophoresis and sequencing results of the PCR products. The double mutant strains AT196012 and AT196014 had stronger drug resistance than the single mutant strain AT196011， with no discernible difference in resistance between AT196013 double mutant strain and AT196011 single mutant strain; In terms of biofilm formation， the three double mutant strains produced significantly more biofilm than the single mutant strain AT196011; the inhibitory effect of 1/2 MIC colistin on the formation of biofilm in the double mutant strains AT196013 and AT196014 was significantly lower than in the single mutant strain AT196011 and the amount of viable bacteria in the biofilm was significantly higher than that of AT196011 single mutant strain. Conclusions Genes ptkD569N and iclRY49H， and the gene pmrAI13M， have a synergistic effect in drug resistance; the gene ptkD569N， shlBR403H and iclRY49H， and the gene pmrAI13M， also have synergistic effects in promoting the formation of biofilms. shlBR403H and iclRY49H had stronger promoting effects， and the corresponding double mutant strains had stronger tolerance to colistin.

Key words? ? ?Acinetobacter baumannii; Gene point mutation; Resistance; Biofilm; Colistin

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）是一種需氧的革蘭陰性桿菌，是全球醫(yī)院獲得性感染的重要原因[1]。2017年，在WHO發(fā)布的首份急需新型抗生素的重點(diǎn)病原體清單中，耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌（carbapenem resistant Acinetobacter baumannii， CRAB）被列為迫切需求新型抗生素的病原體。引起鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制有很多，包括產(chǎn)生抗生素滅活酶、激活外排泵、改變外膜通透性及形成生物膜等[2]。

細(xì)菌生物膜是細(xì)菌附著在生物或非生物表面，通過(guò)分泌胞外多聚物，將其自身進(jìn)行包裹而形成的一種結(jié)構(gòu)。生物膜細(xì)菌在生理方面與一般的浮游細(xì)菌不同，被生物膜包裹的細(xì)菌具有有限的代謝活性并受到細(xì)胞外基質(zhì)的保護(hù)，使其對(duì)抗生素和宿主的先天免疫成分更具有抵抗性[3-4]。生物膜的形成受多個(gè)基因以及環(huán)境因素的影響，同時(shí)更多生物膜形成的機(jī)制還有待于進(jìn)一步挖掘[4]。

前期經(jīng)過(guò)多黏菌素誘導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606獲得了穩(wěn)定耐藥的突變株AT19607，其對(duì)多黏菌素的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）比野生菌株提高了32倍，同時(shí)其生物膜的生成量也顯著提高。經(jīng)全基因組測(cè)序與分析后發(fā)現(xiàn)，與野生菌株相比，AT19607菌株在pmrAI13M、ptkD569N、 shlBR403H和iclRY49H 4個(gè)位點(diǎn)處發(fā)生了點(diǎn)突變。進(jìn)一步分別構(gòu)建此4個(gè)基因的單突變株，發(fā)現(xiàn)pmrAI13M的突變對(duì)耐藥性起主要貢獻(xiàn)，其單突變菌株AT196011對(duì)多黏菌素的MIC值較野生菌株提高了16倍，但生物膜的生成量與野生菌株并無(wú)顯著性差異。因此，本文主要探究AT19607菌株中另外3個(gè)點(diǎn)突變，與pmrAI13M點(diǎn)突變，是否在耐藥性以及生物膜的形成中，存在協(xié)同作用。本研究分別構(gòu)建了AT196012、AT196013和AT196014 3株雙突變菌株，研究了其余3個(gè)點(diǎn)突變?cè)邗U曼不動(dòng)桿菌耐藥性及生物膜形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒來(lái)源

鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606購(gòu)自ATCC菌株保藏中心，突變株AT19611及含鮑曼不動(dòng)桿菌重組系統(tǒng)的RecAb質(zhì)粒pAT04，點(diǎn)突變模板質(zhì)粒pLC001，pLC002和pLC003等由本實(shí)驗(yàn)前期自行構(gòu)建（表1）。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

T100熱循環(huán)儀（Bio-Rad）；Gene Pulser Xcell? 電穿孔儀（Bio-Rad）；EPS-200數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及HE-220高通量水平電泳槽（上海天能）；全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線儀（OY Growth Curves）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；TECAN多功能酶標(biāo)儀；HFsafe-1200LC系列生物安全柜（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）。

1.2.2 試劑

細(xì)菌培養(yǎng)材料主要購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；卡那霉素（Kan），四環(huán)素（Tet）購(gòu)自上海源葉生物有限公司；KOD FX酶購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司；結(jié)晶紫購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司；多黏菌素E由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院馮軍老師提供；瓊脂糖購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，本研究所用的引物均由該公司合成（表2）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)

鮑曼不動(dòng)桿菌野生菌株ATCC19606及各突變菌株的甘油保存管放置冰上，劃線于新鮮的相應(yīng)抗性或無(wú)抗LB平板上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h。挑取單個(gè)菌落接種于相應(yīng)抗性或無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基，37℃，220 r/min震蕩培養(yǎng)16 h。

1.3.2 基因敲除菌株的構(gòu)建

以相應(yīng)的定點(diǎn)誘變模板質(zhì)粒pLC002，pLC003，pLC004為模板，以引物M13F和M13R為上下游引物PCR擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的基因片段，擴(kuò)增結(jié)束后將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化回收之后氮吹濃縮，制成約5 μg的點(diǎn)突變電轉(zhuǎn)片段，-20℃保存待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

將含重組蛋白的pAT04質(zhì)粒電轉(zhuǎn)（2.5 kV）入AT196011感受態(tài)細(xì)胞中，之后涂布在含四環(huán)素（15 ?g/mL）的LB固體培養(yǎng)基中，37℃靜置過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于含四環(huán)素（10 ?g/mL）的LB液體培養(yǎng)基試管中，37℃，220 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)，以3%接種量轉(zhuǎn)接于含50 mL LB液體培養(yǎng)基的搖瓶中，添加終濃度為1 mmol/L IPTG和10 ?g/mL四環(huán)素，37℃，220 r/min震蕩培養(yǎng)至A600nm=0.8～1.0；5000 r/min離心10 min收集菌體，用預(yù)冷的10%無(wú)菌甘油或無(wú)菌水洗滌2次，最終添加200 ?L冰預(yù)冷10%無(wú)菌甘油或無(wú)菌水中懸菌體并分裝到3支EP管中，每支EP管分裝100 ?L感受態(tài)細(xì)胞。將之前制備好的點(diǎn)突變電轉(zhuǎn)片段加入100 ?L感受態(tài)細(xì)胞中，利用2 mm電轉(zhuǎn)杯電轉(zhuǎn)，電壓為2.5 kV，電擊后立即添加900 ?L LB液體培養(yǎng)基，37℃，220 r/min復(fù)蘇1 h，菌液全涂于含四環(huán)素（終濃度15 ?g/mL）與卡那霉素（終濃度為100 ?g/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)至單菌落長(zhǎng)出，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

將菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性的點(diǎn)突變菌株P(guān)CR擴(kuò)增含突變點(diǎn)的片段，送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.3 各菌株生長(zhǎng)情況的測(cè)定

將過(guò)夜培養(yǎng)的各菌株以1：1000的稀釋比例接種于LB液體培養(yǎng)基中并加入到全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線儀配套孔板各個(gè)孔中，每個(gè)菌株做3個(gè)復(fù)孔平行；設(shè)置培養(yǎng)溫度37℃，每1 h自動(dòng)測(cè)定各個(gè)孔中A600值，繪制各菌株生長(zhǎng)曲線，觀察各突變菌株的生長(zhǎng)情況。

1.3.4 最低抑菌濃度的測(cè)定

參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）發(fā)布的微生物藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法測(cè)定最低抑菌濃度（MIC）。挑單菌落過(guò)夜孵育，第二天將菌液1：1000稀釋至MH（Mueller Hinton） 培養(yǎng)基中，用于MIC的測(cè)定。在96 孔板各孔中分別加入100 μL MH 培養(yǎng)基，加入梯度稀釋的多黏菌素，最后加入100 μL前面稀釋好的菌液（多黏菌素最終濃度梯度為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL）。放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，以澄清孔的最低濃度為MIC值。

1.3.5 多黏菌素對(duì)各突變菌株的時(shí)間-殺菌曲線

將過(guò)夜培養(yǎng)的每種突變菌株活化的菌液以1：1000的比例轉(zhuǎn)接到2個(gè)新的2 mL LB液體培養(yǎng)基試管中，每種突變菌株的2個(gè)轉(zhuǎn)接試管其中一個(gè)加入終濃度為8 μg/mL的多黏菌素，另一個(gè)試管不加任何藥物作為陰性對(duì)照。之后將各個(gè)試管放入37℃，220 r/min搖床中使菌液與藥物共同孵育，分別于加藥后0、2、4、8、12、24 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，將每次取出的菌液進(jìn)行10倍梯度的稀釋，取適宜稀釋倍數(shù)的稀釋液5 ?L點(diǎn)在LB固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)稀釋倍數(shù)做3個(gè)平行，待吹干之后將平板放入培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)16～18 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示，并將各個(gè)組別不同時(shí)間點(diǎn)的菌落數(shù)量繪制成曲線。

1.3.6 突變菌株生物膜含量測(cè)定

將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基，按照1：100比例進(jìn)行稀釋，獲得菌懸液。取一個(gè)無(wú)菌96孔板，每孔加入180 μL稀釋后的菌液，并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸出96孔板里的菌液并用200 μL無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，洗滌完成后將96孔板放入60℃烘箱中固定1 h，之后加入180 μL濃度為1%的結(jié)晶紫溶液染色15 min，染色結(jié)束后吸出結(jié)晶紫溶液，加入生理鹽水洗滌3次，之后加入180 μL 95%乙醇溶解結(jié)晶紫，測(cè)定溶液在A570nm的值來(lái)標(biāo)定生物膜含量。

1.3.7 多黏菌素對(duì)突變菌株的生物膜形成抑制及生物膜活菌量測(cè)定

將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用LB液體培養(yǎng)基，按照1：100比例進(jìn)行稀釋，獲得菌懸液。取一無(wú)菌96孔板，每孔加入180 μL稀釋后的菌液，再加入終濃度為1/2MIC的多黏菌素，并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

（1）生物膜含量的測(cè)定? ? 按照“1.3.6”的方法洗滌，固定，染色，洗脫之后，測(cè)定溶液在A570nm的值來(lái)標(biāo)定藥物作用下生物膜含量。根據(jù)如下公式計(jì)算各突變菌株在1/2MIC的多黏菌素作用下，與未加藥物的對(duì)照組比較，其生物膜形成受到藥物抑制的抑制率：

（2）生物膜活菌量測(cè)定? ? 吸出96孔板里的浮游菌，并用200 μL無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，再加入170 μL無(wú)菌生理鹽水和10μL的WST-8溶液，孵育1 h，測(cè)定A450的值用以表征生物膜內(nèi)相對(duì)活菌量。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0分析軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，以P<0.05（*），P<0.01（**）和P<0.001（***）為顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 點(diǎn)突變菌株的構(gòu)建及測(cè)序驗(yàn)證

將卡那霉素平板上長(zhǎng)出來(lái)的單克隆菌落采用菌落PCR驗(yàn)證，ptkD569N，shlBR403H和iclRY49H點(diǎn)突變菌株的驗(yàn)證，分別采用p-F1/p-R1， S-F1/S-R1， i-F1/i-R1引物進(jìn)行驗(yàn)證，陽(yáng)性菌落的條帶大小分別為3.6 kb，4.5 kb，3.1 kb，陰性菌落的條帶大小分別為2.6 kb，2.5 kb，2.4 kb。各點(diǎn)突變菌株P(guān)CR相關(guān)引物及位點(diǎn)設(shè)計(jì)如圖1所示。將ptkD569N，shlBR403H和iclRY49H點(diǎn)突變陽(yáng)性菌落，分別設(shè)計(jì)引物p-F2/p-R2，S-F2/S-R2和i-F2/i-R2，對(duì)包含突變點(diǎn)的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2），并送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果顯示陽(yáng)性菌落確實(shí)突變成功（圖3）。

2.2 點(diǎn)突變對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

通過(guò)測(cè)定不同菌株的生長(zhǎng)曲線確定基因點(diǎn)突變會(huì)對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響。如圖4所示，各突變菌株的生長(zhǎng)速度均低于野生菌株ATCC19606，而各突變菌株之間沒(méi)有顯著性差異。

2.3 各突變菌株對(duì)多黏菌素耐藥性的測(cè)定

2.3.1 多黏菌素對(duì)各突變菌株最低抑菌濃度的測(cè)定

將多黏菌素對(duì)各突變菌株的MIC值進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，AT196012和AT196014雙突變菌株的MIC值是AT196011單突變菌株的2倍，說(shuō)明基因ptkD569N 和iclRY49H與基因pmrAI13M的突變，在耐藥性方面存在協(xié)同或疊加作用；而AT196013雙突變菌株的MIC值與AT196011單突變菌株一致，說(shuō)明基因shlBR403H與基因pmrAI13M，在耐藥性方面無(wú)相關(guān)作用（表3）。

2.3.2 多黏菌素對(duì)各突變菌株的時(shí)間-殺菌曲線

為了進(jìn)一步比較各突變菌株耐藥性的差異，測(cè)定了多黏菌素對(duì)不同突變菌株的時(shí)間-殺菌曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在8 μg/mL多黏菌素作用下，AT196012和AT196014雙突變菌株及AT19607菌株幾乎沒(méi)有受到多黏菌素影響，其生長(zhǎng)情況與未加藥物的陰性對(duì)照菌株的生長(zhǎng)情況類似；而AT196013雙突變菌株與AT196011單突變菌株的生長(zhǎng)明顯受到了多黏菌素的抑制，其在0～2 h菌落數(shù)出現(xiàn)了明顯的下降，但是由于8 μg/mL的多黏菌素對(duì)其沒(méi)有起到完全的抑制作用，2 h之后菌落數(shù)開(kāi)始上升，最終在24 h時(shí)的菌落數(shù)仍然略低于另外3株加藥的突變菌株。通過(guò)測(cè)定突變菌株的時(shí)間-殺菌曲線，進(jìn)一步說(shuō)明ptkD569N和iclRY49H點(diǎn)突變與pmrAI13M點(diǎn)突變，在耐藥性方面存在協(xié)同或疊加作用。

2.4 不同基因雙突變對(duì)生物膜形成的影響

2.4.1 不同突變株生物膜量的差異比較

用半定量結(jié)晶紫染色法，對(duì)各突變菌株培養(yǎng)24 h時(shí)，所形成生物膜量進(jìn)行比較。結(jié)果如圖6所示。各雙突變菌株的生物膜含量在24 h時(shí)，都顯著高于AT196011單突變菌株。其中AT196013和AT196014菌株的生物膜含量，要高于AT196012菌株，并且AT19607菌株的生物膜含量最高。這表明在生物膜的形成方面，基因ptkD569N、shlBR403H和iclRY49H，與基因pmrAI13M都存在協(xié)同作用，導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜量的增加，而AT19607的生物膜形成可能是多個(gè)基因作用共同疊加的結(jié)果。

2.4.2 亞MIC條件下多黏菌素對(duì)各突變株生物膜形成的影響

為了研究多黏菌素是否會(huì)影響各突變菌株生物膜的形成，測(cè)定1/2MIC多黏菌素濃度下各突變株生物膜的形成情況。結(jié)果如圖7所示，在藥物作用下，AT196013和AT196014雙突變菌株的生物膜形成抑制率顯著低于AT196011單突變菌株，AT196012雙突變菌株生物膜形成抑制率要略低于AT196011單突變菌株，但兩者之間沒(méi)有顯著性差異，所有突變菌株中，多黏菌素對(duì)AT19607菌株的生物膜形成抑制率最低。

同時(shí)對(duì)1/2MIC濃度多黏菌素作用下不同突變菌株的生物膜活菌量進(jìn)行了測(cè)定，如圖8所示， AT196013和ATCC196014雙突變菌株的生物膜活菌量顯著高于AT196011單突變菌株，而AT196012菌株的活菌量略高于AT196011單突變菌株，但兩者之間沒(méi)有顯著性差異，同時(shí)AT19607的生物膜活菌量最高，這進(jìn)一步說(shuō)明生物膜形成能力越強(qiáng)，生物膜菌對(duì)環(huán)境的耐受性也更強(qiáng)。

3 討論

近年來(lái)，對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的鮑曼不動(dòng)桿菌已成為對(duì)全球公共衛(wèi)生的嚴(yán)重威脅，并被視為需要緊急關(guān)注的首要任務(wù)之一，而生物膜的形成是鮑曼不動(dòng)桿菌在臨床上對(duì)抗生素產(chǎn)生耐受性的重要原因[5]。因此，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性及生物膜形成和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入探索對(duì)研發(fā)治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的藥物具有重要的意義。

在對(duì)各突變菌株耐藥性分析中，本研究發(fā)現(xiàn)，ptkD569N和iclRY49H點(diǎn)突變可以協(xié)同pmrAI13M點(diǎn)突變?cè)黾吁U曼不動(dòng)桿菌的耐藥性。本研究顯示，AT19607耐藥性的增加雖然主要與已報(bào)道的pmrAI13M點(diǎn)突變上調(diào)脂質(zhì)A的修飾相關(guān)[6]，但與ptkD569N和iclRY49H點(diǎn)突變也存在一定相關(guān)性。前期研究表明，AT196015菌株的耐藥性略強(qiáng)于野生菌株ATCC19606，而AT196016菌株的耐藥性與ATCC19606類似[6]，因此猜測(cè)ptkD569N點(diǎn)突變可能和pmrAI13M點(diǎn)突變具有疊加增強(qiáng)ATCC19606耐藥性作用，而iclRY49H點(diǎn)突變可能需要在pmrAI13M 點(diǎn)突變基礎(chǔ)上通過(guò)其他途徑上調(diào)細(xì)菌耐藥性。

當(dāng)對(duì)各突變菌株生物膜含量進(jìn)行研究時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ptkD569N，shlBR403H和iclRY49H點(diǎn)突變，與pmrAI13M點(diǎn)突變都具有協(xié)同作用，可以促進(jìn)鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜量的增加。目前有文獻(xiàn)表明，與ptk基因相關(guān)的莢膜多糖的產(chǎn)生，與生物膜的粘附與發(fā)展存在關(guān)聯(lián)[7-10]；而IclR家族作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，有研究表明其可以通過(guò)調(diào)控細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，以促進(jìn)生物膜的生成[11-12]。因此，猜測(cè)ptkD569N和iclRY49H點(diǎn)突變，協(xié)同 pmrAI13M點(diǎn)突變，能導(dǎo)致生物膜形成量的增加，這可能與莢膜多糖的形成和細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)有關(guān)；而shlB基因與細(xì)菌溶血素蛋白的生成有關(guān)[13-14]，但目前尚無(wú)報(bào)道其與生物膜形成存在關(guān)聯(lián)。有研究表明，生物膜形成與多種細(xì)菌的毒力因子有關(guān)[4]，因此關(guān)于shlB基因所調(diào)控的溶血素毒力因子與生物膜形成的關(guān)系仍然需要進(jìn)一步研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在藥物作用下shlBR403H和iclRY49H點(diǎn)突變，與pmrAI13M點(diǎn)突變協(xié)同促進(jìn)生物膜形成的能力更強(qiáng)，其生物膜內(nèi)存在的活菌量也更多，進(jìn)一步說(shuō)明其對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的耐受性也更強(qiáng)。由于AT19607菌株的幾個(gè)點(diǎn)突變是在多黏菌素作用下突變產(chǎn)生的，是菌株對(duì)環(huán)境產(chǎn)生耐受性的表現(xiàn)，而幾株點(diǎn)突變菌株在對(duì)多黏菌素的MIC方面沒(méi)有較大的差異，因此，本研究認(rèn)為另外3個(gè)點(diǎn)突變對(duì)菌株耐受性的貢獻(xiàn)可能主要體現(xiàn)在促進(jìn)菌株生物膜形成進(jìn)而增加其對(duì)環(huán)境的耐受性方面。

綜上所述，本研究深入討論了相關(guān)基因點(diǎn)突變與鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性，及生物膜形成的關(guān)系，為抗鮑曼不動(dòng)桿菌藥物的研究提供了新的方向。但是這3個(gè)基因點(diǎn)突變，與pmrA基因相互作用對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌藥物的敏感性及生物膜的調(diào)控的機(jī)制，仍然需要進(jìn)一步探索。

參 考 文 獻(xiàn)

Lin M F， Lan C Y. Antimicrobial resistance in Acinetobacter baumannii： From bench to bedside[J]. World J Clin Cases， 2014， 2（12）： 787-814.

Lee C R， Lee J H， Park M， et al. Biology of Acinetobacter baumannii： Pathogenesis， antibiotic resistance mechanisms， and prospective treatment options[J]. Front Cell Infect Microbiol， 2017， 7（55）： 1-35.

Runci F， Bonchi C， Frangipani E， et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation in human serum and disruption by gallium[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2017， 61（1）： e01563-16.

Gedefie A， Demsis W， Ashagrie M， et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis： A review[J]. Infect Drug Resist， 2021， 14： 3711-3719.

Magiorakos A P， Srinivasan A， Carey R B， et al. Multidrug-resistant， extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria： An international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance[J]. Clin Microbiol Infect， 2012， 18（3）： 268-281.

Sun B， Liu H， Jiang Y， et al. New mutations involved in colistin resistance in Acinetobacter baumannii[J]. mSphere， 2020， 5（2）： e00895-19.

Geisinger E， Isberg R R. Antibiotic modulation of capsular exopolysaccharide and virulence in Acinetobacter baumannii[J]. PLoS Pathog， 2015， 11（2）： e1004691.

Lees-Miller R G， Iwashkiw J A， Scott N E， et al. A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii[J]. Mol Microbiol， 2013， 89（5）： 816-830.

Russo T A， Luke N R， Beanan J M， et al. The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain 307-0294 is a major virulence factor[J]. Infect Immun， 2010， 78（9）： 3993-4000.

Hua X， Zhou Z， Yang Q， et al. Evolution of Acinetobacter baumannii in vivo： International clone ⅱ， more resistance to ceftazidime， mutation in ptk[J]. Front Microbiol， 2017， 8： 1256.

Zhou Y， Huang H， Zhou P， et al. Molecular mechanisms underlying the function diversity of transcriptional factor IclR family[J]. Cell Signal， 2012， 24（6）： 1270-1275.

Aguilar C， Schmid N， Lardi M， et al. The IclR-family regulator BapR controls biofilm formation in B. cenocepacia H111[J]. PLoS One， 2014， 9（3）： e92920.

Konninger U W， Hobbie S， Benz R， et al. The haemolysin-secreting ShlB protein of the outer membrane of Serratia marcescens： Determination of surface-exposed residues and formation of ion-permeable pores by ShlB mutants in artificial lipid bilayer membranes[J]. Mol Microbiol， 1999， 32（6）： 1212-1225.

Braun V， Helbig S， Patzer S I， et al. Import and export of bacterial protein toxins[J]. Int J Med Microbiol， 2015， 305（2）： 238-242.