田 凱，辛可啟，余群力,*，韓 玲，張新軍，孔祥穎，宋仁德

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.寧夏夏華肉食品股份有限公司，寧夏 中衛(wèi) 755000；3.青海省海北畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，青海 海北 812200；4.青海省玉樹州畜牧獸醫(yī)工作站，青海 玉樹 815000）

牦牛（Bos grunniens）是生活在青藏高原及周邊等高海拔環(huán)境的牛種[1]，并且在海拔高、溫差大（15 ℃以上）、低溫和缺氧等惡劣環(huán)境條件下能大量繁育。這樣特殊的環(huán)境造就了牦牛肉脂肪低、蛋白質(zhì)高、富含脂肪酸、氨基酸和礦物質(zhì)等營養(yǎng)豐富的特點[2]，因此受到廣大肉品消費者的喜愛。肉的嫩度能夠反映肉中各類蛋白質(zhì)特性，作為消費者衡量食用肉的重要指標(biāo)之一，會影響消費者的購買欲[3]。在宰后成熟階段，肌肉由鈣離子激活酶、組織蛋白酶和細(xì)胞凋亡酶等多種酶相互作用，共同促進其嫩化[4]。細(xì)胞凋亡是一種特殊的細(xì)胞死亡形式，宰后肌細(xì)胞會出現(xiàn)收縮、細(xì)胞核收縮并邊緣化等現(xiàn)象[5]。線粒體細(xì)胞凋亡途徑是當(dāng)今公認(rèn)的一種凋亡方式，細(xì)胞因受到應(yīng)激狀態(tài)及凋亡因子的調(diào)控，引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放程度、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）降低，并引起細(xì)胞凋亡酶家族級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。部分肌原纖維蛋白受到凋亡酶的作用發(fā)生降解，對肉的嫩度產(chǎn)生影響[7]。

牦牛宰后處于缺氧應(yīng)激狀態(tài)，低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）作為一種關(guān)鍵的“氧氣感受器”，在調(diào)控宰后肌肉細(xì)胞能量代謝方面具有重要意義。HIF-1是由氧調(diào)節(jié)亞單位HIF-1α和結(jié)構(gòu)亞單位HIF-1β構(gòu)成的一種異源二聚體蛋白性調(diào)節(jié)因子[8-9]。在低氧狀態(tài)下，脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase，PHD）活性鈍化，HIF-1α不能被泛素化降解，造成HIF-1穩(wěn)定表達[10]。與肉牛肉相比，牦牛肉中HIF-1α表達水平更高[11]，說明牦牛更能在高原缺氧環(huán)境下生存繁育。HIF-1作為氧依賴性轉(zhuǎn)錄激活因子，可以調(diào)控血管生長、能量代謝和細(xì)胞凋亡等相關(guān)的多種靶基因[12]。Xin Keqi等[13]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α通過調(diào)節(jié)糖酵解途徑在宰后牦牛肉嫩化成熟過程起到負(fù)調(diào)控作用。胡博等[14]的研究結(jié)果表明脯氨酰羥化酶通過上調(diào)HIF-1α表達提高糖酵解酶活性，加速糖酵解過程，從而使肌肉嫩度變差。

氨作為氨基酸脫氨作用和谷氨酰胺代謝過程的新陳代謝毒性副產(chǎn)物[15]，能夠在常氧條件下導(dǎo)致細(xì)胞HIF-1α積累[16]，上調(diào)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞HIF-1α的表達水平[17]。Xiong Zhong等[18]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞中HIF-1α通過與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）啟動子中的低氧反應(yīng)元件（hypoxic response element，HRE）直接結(jié)合從而抑制AIF轉(zhuǎn)錄，同時HIF-1α能夠控制MPTP開放以穩(wěn)定MMP，并降低心臟缺血再灌注損傷后的線粒體氧化應(yīng)激[19]。在腎小管細(xì)胞中，HIF-1α通過介導(dǎo)血紅素加氧酶-1下調(diào)因缺氧產(chǎn)生的線粒體膜電位降低和活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成[20]。與線粒體外膜相關(guān)的HIF-1α通過直接調(diào)節(jié)電壓依賴性陰離子通道1來保護線粒體穩(wěn)定并防止細(xì)胞凋亡[21]，說明HIF-1α可通過調(diào)控AIF、MPTP、MMP等因素，減少線粒體耗氧并維持其穩(wěn)定，防止由線粒體損傷引發(fā)的細(xì)胞凋亡。近年來，關(guān)于HIF-1α與細(xì)胞凋亡的研究主要集中于醫(yī)學(xué)癌細(xì)胞領(lǐng)域，且兩者間的作用機制尚未完全明確。與癌細(xì)胞類似，宰后肌肉細(xì)胞也處于缺氧應(yīng)激環(huán)境，目前鮮見HIF-1α與細(xì)胞凋亡是否存在類似機制，以及氨在調(diào)控宰后牦牛肉成熟過程中HIF-1α表達與線粒體細(xì)胞凋亡之間是否存在作用的報道。因此，對于氨調(diào)控宰后牦牛肉中HIF-1α表達對線粒體細(xì)胞凋亡以及肉嫩度的影響具有理論研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉樣品選自青海裕泰食品有限公司的6 頭公牦牛，體質(zhì)量（350±50）kg左右。牦牛發(fā)育優(yōu)良，生長年齡平均在3～4 歲左右，無任何健康問題且體質(zhì)良好，宰前禁水2 h，禁食16～18 h。

氯化銨、氯化鉀、氯化鎂、磷酸三鉀、甘露醇、蔗糖、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、NaN3天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；MOPS緩沖液、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、Hepes緩沖液 上海麥克林生化科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒 武漢賽維爾生物科技有限公司；NO測定試劑盒、ATP含量測定試劑盒、Na＋-K＋-ATPase試劑盒、Ca2＋-ATPase試劑盒南京建成生物工程研究所；MMP試劑盒、Caspase-3/9活力測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DW-86L416G超低溫冰箱 杭州諾丁科學(xué)器材有限公司；FJ200-SH分散均質(zhì)機 上海滬析實業(yè)有限公司；FA2004B電子天平 上海精科天美儀器有限公司；SP-756P紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；C-LM4型數(shù)顯式肌肉嫩度儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；BV-2電泳儀 北京伯蘭特儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

每頭牦牛經(jīng)屠宰放血干凈、除去無用組織后，各取其背最長肌500 g，再切割為100 g左右的肉塊以便處理。肉塊分為3 組，每組約900 g肉樣，分別注射濃度為10 mmol/L NH4Cl溶液、0.9%的生理鹽水和濃度為10 mmol/LN-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（N-nitro-Larginine methyl ester hydrochloride，L-NAME）溶液，以1∶1的質(zhì)量體積比進行多點位注射。本實驗以10 mmol/L NH4Cl溶液、10 mmol/LL-NAME溶液作為處理組，以0.9%的生理鹽水作為對照組。肉樣經(jīng)處理后在4 ℃下成熟0、6、12、24、72、120、168 h取樣，用濾紙吸取多余液體后進行相應(yīng)指標(biāo)測定，針對其余不便測定的指標(biāo)，將肉樣置于－80 ℃的超低溫冰箱中備用。

1.3.2 免疫印跡分析

參考任鈺昕等[22]的方法修改，取1 g肉樣剪碎置于9 mL裂解液中，13 000 r/min冰浴勻漿30 s，重復(fù)多次，冰上靜置裂解30 min。將勻漿液于4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，上清液用BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度。將上述樣液蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至1.5 μg/μL，按體積比4∶1向蛋白溶液中加入5×上樣緩沖液，沸水煮15 min。用12%的分離膠和5%濃縮膠進行SDS-PAGE，電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（poly(vinylidene fluoride)，PVDF）膜上，在脫色搖床上用5%的脫脂奶粉進行1 h封閉，加入一抗（GAPDH：GAPDH小鼠單克隆，1∶2 000；HIF-1α：多克隆兔抗小鼠，1∶1 000），4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液在脫色搖床上清洗3 次，每次5 min，清洗后加入二抗（山羊抗兔，1∶3 000）室溫孵育1 h。在暗室中進行化學(xué)發(fā)光，洗凈后定影，利用PhotoShop軟件整理去色，利用Alpha軟件處理并計算光密度值。

1.3.3 NO含量測定

取1 g肉樣置于50 mL離心管中，加入10 倍體積預(yù)冷的0.86%生理鹽水，利用分散均質(zhì)機勻漿，13 000 r/min冰浴勻漿30 s，重復(fù)多次，4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min，保留上清液待測。利用試劑盒測定NO含量。

1.3.4 Na＋-K＋-ATPase、Ca2＋-ATPase、ATP水平測定

Na＋-K＋-ATPase、Ca2＋-ATPase與ATP水平按照試劑盒說明書進行測定。

1.3.5 線粒體提取

參考王琳琳[23]的方法稍作修改，將牦牛肉樣剪碎后加入10 倍體積的線粒體分離緩沖液（220 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖、5 mmol/L MOPS、2 mmol/L EDTA和0.5% BSA，pH 7.4）中，用分散均質(zhì)機在12 000 r/min下冰浴勻漿30 s，重復(fù)多次。用高速臺式冷凍離心機于在4 ℃、1 000×g條件下離心10 min，相同條件下離心兩次，取上清液4 ℃、8 000×g離心25 min，棄上清液，取沉淀即為線粒體。利用Biuret法測定蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.6 MPTP開放程度測定

參考Wang Linlin等[24]的方法測定吸光度，通過吸光度變化描述MPTP開放程度。取分離純化后的線粒體用MPTP測試液（230 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖、3 mmol/L Hepes，pH 7.4）將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整至0.3 mg/mL。按體積比1∶3將線粒體懸浮液與MPTP測試液混勻，在540 nm波長處測定其吸光度，以吸光度表征MPTP開放程度，當(dāng)吸光度越小時，MPTP開放程度越大。

1.3.7 線粒體膜電位測定

MMP采用JC-1試劑盒檢測，取總蛋白質(zhì)量濃度為100 μg/mL的純化線粒體加入10 倍體積的JC-1染色液，孵育20 min，使用熒光分光光度計測定熒光強度，紅綠熒光強度比值能反映MMP水平（檢測JC-1單體時，激發(fā)波長490 nm、發(fā)射波長530 nm；檢測JC-1聚合物時，激發(fā)波長525 nm、發(fā)射波長590 nm）。

1.3.8 Caspase-3/9活力測定

樣品處理參照Caspase-3/9活力測定試劑盒說明書稍作修改，取0.1 g肉樣，加入1 mL Caspase-3/9裂解液，多次冰浴研磨，冰上靜置20 min，4 ℃、15 000×g條件下離心15 min，取上清液置于冰上，按照試劑盒說明書測定Caspase-3/9活力。

1.3.9 剪切力測定

參考NY/T 1180—2006《肉嫩度的測定 剪切力測定法》測定樣品剪切力，取100 g長×寬×高不小于6 cm×3 cm×3 cm的整塊肉樣置于80 ℃恒溫水浴鍋中加熱，待肉樣中心溫度達到70 ℃后，用直徑為1.27 cm的圓形取樣器取肉樣，再將其置于C-LM4型數(shù)顯式肌肉嫩度儀中測定其剪切力。

1.3.10 肌原纖維小片化指數(shù)測定

參考Gao Yongfang等[25]的方法并稍作修改，將3 g肉樣與30 mL MFI緩沖液（100 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L NaN3、20 mmol/L K3PO4，pH 7.1）按照質(zhì)量體積比1∶10混勻，于10 000 r/min下冰浴勻漿30 s，重復(fù)多次。在4 ℃、2 000×g條件下離心20 min，棄上清液，取沉淀加10 倍體積預(yù)冷肌原纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）緩沖液，再次在4 ℃、2 000×g條件下離心20 min，棄上清液，取沉淀加入10 mL MFI緩沖液溶解，用篩網(wǎng)過濾懸浮液，并使用MFI緩沖液沖洗濾網(wǎng)，得到蛋白溶液。用Biuret法測定蛋白質(zhì)量濃度，用MFI緩沖液將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至0.5 mg/mL，在540 nm波長測定吸光度，按下式計算MFI。

MFI＝吸光度×200。

1.3.11 肌細(xì)胞形態(tài)觀察

參考Fischer等[26]的方法，將肉樣加入體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液固定，組織切片后經(jīng)蘇木精-伊紅染色。通過顯微鏡進行拍照觀察，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析其肌纖維橫切面圖像，每張圖取30 組肌細(xì)胞分別測定其肌纖維面積、直徑和間隙。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)測定3 次以上，利用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析和Duncan’s顯著性檢驗（以P＜0.05表示差異顯著），處理類別、宰后成熟時間及其交互作用被認(rèn)為是固定效應(yīng)，動物被認(rèn)為是隨機效應(yīng)；利用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉內(nèi)環(huán)境及能量代謝變化

2.1.1 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉HIF-1α表達量變化

牦牛經(jīng)屠宰后，肌肉細(xì)胞受缺氧放血影響，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達量在宰后初期迅速增加。由圖1可知，HIF-1α表達水平整體呈先升高后下降的趨勢，在宰后24 h達到最高。這一結(jié)果與朱宏[27]的研究結(jié)果相似。在宰后缺氧狀態(tài)下，宰后6～24 h，NH4Cl組HIF-1α表達水平顯著高于對照組（P＜0.05），L-NAME組HIF-1α表達量顯著低于對照組（P＜0.05），這一結(jié)果與Kitajima等[28]的研究結(jié)果相似，說明NH4Cl對宰后牦牛肉細(xì)胞中HIF-1α表達量起上調(diào)作用，相反，L-NAME處理對宰后牦牛肉細(xì)胞中HIF-1α表達量起下調(diào)作用。結(jié)合Kruczek[29]與Olson[30]等的研究分析，這可能與氨在肌肉代謝轉(zhuǎn)換過程中產(chǎn)生的NO分子有關(guān)。因此，本實驗后續(xù)測定了3 種不同處理中牦牛肉NO含量，試圖揭示氨對HIF-1α的調(diào)控途徑。

圖1 HIF-1α免疫印跡及蛋白表達量Fig.1 Western blot analysis and protein expression analysis of HIF-1α

2.1.2 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉NO含量

Metzen等[31]發(fā)現(xiàn)NO分子通過鈍化PHD活性，造成HIF-1α不被降解而蓄積。NO是由一氧化氮合酶氧化L-精氨酸產(chǎn)生，并由尿素循環(huán)相關(guān)的酶介導(dǎo)[32]。由圖2可知，隨著宰后成熟，牦牛肉中NO含量先增加后減少，6 h時NO含量最高。宰后12 h，對照組NO含量比NH4Cl組低5.17%，比L-NAME組高8.78%，宰后6～168 h內(nèi)，對照組NO含量顯著高于L-NAME組（P＜0.05），而顯著低于NH4Cl組（P＜0.05）。張攀高等[33]的研究表明，L-NAME作為一種一氧化氮合酶抑制劑可抑制一氧化氮合酶活性，降低NO生成量。由本研究結(jié)果可知，氨可以通過代謝轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生NO分子，造成肌細(xì)胞中NO含量升高，而L-NAME處理可以有效減少肌細(xì)胞中NO產(chǎn)生，這與李雪茹等[34]的研究結(jié)果一致。

圖2 宰后成熟過程中NO含量變化Fig.2 Variation in NO content during postmortem aging

2.1.3 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉Na＋-K＋-ATPase與Ca2＋-ATPase活力

細(xì)胞能量代謝酶廣泛分布于細(xì)胞膜、線粒體膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，而Na＋-K＋-ATPase與Ca2＋-ATPase作為主要的能量代謝酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境方面起到重要作用[35]。由圖3A可知，宰后0～168 h，Na＋-K＋-ATPase活力先升高后降低，且在24 h達到峰值，此結(jié)果與陳琳[36]的研究結(jié)果相似。宰后6～24 h，對照組Na＋-K＋-ATPase活力顯著高于NH4Cl組（P＜0.05），顯著低于L-NAME組（P＜0.05）。說明受氨調(diào)控的HIF-1α可下調(diào)Na＋-K＋-ATPase活力。在宰后缺氧條件下，HIF-1α的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子會降低電子傳遞鏈活性[37]，并使蛋白翻譯和Na＋-K＋-ATPase活力下調(diào)。Ca2＋-ATPase存在于線粒體膜與細(xì)胞膜，在調(diào)節(jié)離子濃度平衡與線粒體膜通透性方面起到重要作用[38]。由圖3B可知，Ca2＋-ATPase活力在宰后初期先升高，隨后逐漸降低。宰后12 h，對照組Ca2＋-ATPase活力比NH4Cl組高9.08%，比L-NAME組低29.59%。說明經(jīng)過NH4Cl介導(dǎo)的HIF-1α可能存在下調(diào)Ca2＋-ATPase的作用，但其內(nèi)在機制仍需進一步研究。

圖3 宰后成熟過程中Na＋-K＋-ATPase（A）與Ca2＋-ATPase（B）活力變化Fig.3 Changes in Na+-K+-ATPase (A) and Ca2+-ATPase (B) activities during postmortem aging

2.1.4 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉ATP含量

ATP作為直接的能量物質(zhì)，在調(diào)節(jié)宰后肌肉能量代謝與內(nèi)環(huán)境變化方面極其重要。由于缺血缺氧等因素影響，宰后肌肉能量代謝因有氧呼吸終斷，此時能夠進行的能量代謝途徑即糖酵解途徑[39]。由圖4可知，宰后0～168 h，ATP含量逐漸下降，NH4Cl組ATP含量下降81.53%，對照組下降90.50%，L-NAME組下降91.43%。宰后6 ～7 2 h，對照組AT P 含量顯著低于N H4C l 組（P＜0.05），且顯著高于L-NAME組（P＜0.05）。宰后成熟過程受缺氧應(yīng)激影響，肌細(xì)胞進行各項生理活動仍需消耗ATP，且細(xì)胞凋亡過程也需消耗ATP。在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α通過調(diào)控糖酵解相關(guān)靶基因，促進糖酵解反應(yīng)的發(fā)生，進而產(chǎn)生更多的ATP以維持細(xì)胞能量消耗[40]。綜上，氨可能通過上調(diào)HIF-1α表達靶向調(diào)控糖酵解相關(guān)酶活性，促進糖酵解反應(yīng)發(fā)生，增加ATP生成，以維持細(xì)胞內(nèi)各項生理生化反應(yīng)正常進行，減緩細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

圖4 宰后成熟過程中ATP含量變化Fig.4 Change in ATP content during postmortem aging

2.2 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉線粒體途徑細(xì)胞凋亡的變化

2.2.1 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉MPTP開放程度

MPTP在調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性方面具有重要作用，是細(xì)胞凋亡線粒體途徑中的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)。MPTP開放程度越大，線粒體引起的細(xì)胞凋亡越可能發(fā)生[41]。MPTP開放程度由吸光度反映，吸光度越小，MPTP開放程度越大。如圖5所示，隨著成熟時間推移，吸光度逐漸下降，說明MPTP開放程度逐漸增大，宰后6～120 h，NH4Cl組MPTP開放程度顯著低于對照組（P＜0.05），而L-NAME組顯著高于對照組（P＜0.05），說明氨可能通過促進HIF-1α表達，抑制MPTP開放及線粒體外膜通透性增大。Wang Linlin等[42]通過對宰后牦牛肉進行研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和ROS過量產(chǎn)生引起的鈣超載可能影響MPTP的開放和MMP。Kim等[43]的研究表明，在低氧條件下，電子傳遞鏈發(fā)生故障，這使得葡萄糖代謝產(chǎn)物通過HIF-1介導(dǎo)了磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1表達從而引起線粒體呼吸減弱，抑制線粒體ROS產(chǎn)生，維持ATP水平。Xin Keqi等[13]的研究表明，與對照組相比，YC-1（HIF-1α抑制劑）處理抑制了磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1的表達。HIF-1α可能通過上調(diào)磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1表達，減弱線粒體呼吸作用，減少線粒體ROS產(chǎn)生從而抑制MPTP開放[19]。

圖5 宰后成熟過程中MPTP開放程度變化Fig.5 Change in MPTP openness during postmortem aging

2.2.2 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉線粒體膜電位

細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性變化之一是MMP下降。由圖6可知，隨著宰后成熟，MMP整體呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，表明宰后成熟過程發(fā)生肌細(xì)胞凋亡。宰后0～168 h，NH4Cl組MMP下降47.72%，對照組MMP下降53.54%，L-NAME組MMP下降60.05%。與Xin Keqi等[13]的研究結(jié)果一致，YC-1（HIF-1α抑制劑）組的MMP均低于對照組。前人研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α參與了VDAC1-mortalin-HIF-1α-HK-II復(fù)合體的形成，該復(fù)合體能夠促進抗凋亡VDAC1-?C的產(chǎn)生，維持MMP穩(wěn)定，從而阻止因缺氧誘發(fā)的細(xì)胞凋亡[21]。綜上，HIF-1α通過延緩MMP下降，維持線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定，抑制細(xì)胞凋亡。

圖6 宰后成熟過程中MMP變化Fig.6 Changes in MMP during postmortem aging

2.2.3 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉Cas pa se-9與Caspase-3活力

MPTP開放程度增大與MMP降低能夠引起細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）釋放入胞質(zhì)，消耗ATP，激活Caspase-9，活化后的Caspase-9進一步激活Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[44]。如圖7所示，Caspase-9與Caspase-3活力隨成熟時間延長先上升，隨著ATP消耗，其酶活力逐漸下降，這與魏起超[45]的研究結(jié)果相近。宰后6、24 h與72 h，NH4Cl組Caspase-9活力顯著低于對照組（P＜0.05），L-NAME組Caspase-9活力顯著高于對照組（P＜0.05），宰后12～168 h，NH4Cl組Caspase-3活力顯著低于對照組與L-NAME組（P＜0.05）。王琳琳等[46]的研究表明能量代謝酶活力同Caspase-9與Caspase-3活力呈正相關(guān)，本實驗結(jié)果與其一致。綜上，氨通過調(diào)控HIF-1α維持線粒體結(jié)構(gòu)與功能，抑制Caspase-9與Caspase-3活性，進而抑制細(xì)胞凋亡。

圖7 宰后成熟過程中Caspase-9（A）與Caspase-3（B）活力變化Fig.7 Changes in caspase-9 (A) and caspase-3 (B) activities during postmortem aging

2.3 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉嫩度變化

2.3.1 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉剪切力

剪切力是衡量肉品嫩度的指標(biāo)。肉品嫩度通常由pH值、鈣激活酶、組織蛋白酶與細(xì)胞凋亡酶等因素共同影響。如圖8所示，宰后0～168 h剪切力呈現(xiàn)先逐漸升高后逐漸下降趨勢，這與馬秀利等[47]的研究結(jié)果一致，宰后6～168 h，NH4Cl組剪切力顯著高于對照組（P＜0.05），L-NAME組剪切力低于對照組。由2.2.3節(jié)結(jié)果可知，氨通過上調(diào)HIF-1α表達能夠抑制Caspase-9與Caspase-3活性。Kemp等[48]的研究結(jié)果證明細(xì)胞凋亡酶可以對肌原纖維蛋白進行部分降解，從而影響剪切力等嫩度評價指標(biāo)。綜上，氨通過調(diào)控HIF-1α對肌肉嫩度產(chǎn)生負(fù)作用，推測可能與HIF-1α調(diào)節(jié)糖酵解過程造成pH值下降以及抑制線粒體細(xì)胞凋亡途徑中細(xì)胞凋亡酶活性有關(guān)。

圖8 宰后成熟過程中剪切力變化Fig.8 Change in shear force during postmortem aging

2.3.2 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉MFI

在宰后過程肉質(zhì)不斷得到改善，通過內(nèi)源酶的共同作用，肌肉嫩度不斷提高。MFI用于描述肌原纖維降解程度，由圖9可知，隨宰后成熟牦牛肉的MFI整體逐漸升高，這與高永芳等[49]的研究結(jié)果一致。在多種內(nèi)源酶的作用下，肌原纖維破裂為不同數(shù)目的多肽小片段，導(dǎo)致MFI值逐漸增大。宰后6～120 h，NH4Cl組MFI顯著低于對照組（P＜0.05），L-NAME組顯著高于對照組（P＜0.05）。綜上，在宰后成熟過程，氨調(diào)控的HIF-1α通過抑制線粒體細(xì)胞凋亡、弱化細(xì)胞凋亡酶對肌原纖維蛋白的降解作用，進一步導(dǎo)致肌肉嫩度變差。

圖9 宰后成熟過程中MFI變化Fig.9 Change in MFI during postmortem aging

2.3.3 氨調(diào)控宰后成熟過程中牦牛肉肌細(xì)胞形態(tài)變化

隨著宰后成熟，肌纖維受pH值、ATP消耗、內(nèi)源酶降解等多種因素影響，其形態(tài)會發(fā)生變化。由圖10可知，隨著宰后成熟，肌纖維形態(tài)上逐漸收縮，肌纖維面積、直徑逐漸變小，細(xì)胞間隙逐漸增大。由表1可知，在宰后6～72 h，NH4Cl組的肌纖維面積顯著大于對照組（P＜0.05），對照組肌纖維面積顯著大于L-NAME組（P＜0.05）；宰后6～24 h和72 h，NH4Cl組的肌纖維直徑顯著大于對照組（P＜0.05），對照組肌纖維直徑顯著大于L-NAME組（P＜0.05）；宰后6～24 h對照組的肌纖維間隙顯著大于NH4Cl組（P＜0.05），顯著小于L-NAME組（P＜0.05）。NH4Cl組肌纖維形態(tài)收縮較對照組慢，嫩度改善效果較差，而L-NAME組較對照組肌纖維形態(tài)收縮較快。綜上，NH4Cl處理顯著抑制肌纖維形態(tài)收縮，NH4Cl可以通過調(diào)控HIF-1α表達抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生與肌細(xì)胞形態(tài)變化。

表1 宰后成熟過程中不同時間肌纖維面積、直徑及間隙Table 1 Muscle fiber area and diameter and space between muscle fibers at different time points during postmortem aging

3 結(jié) 論

隨著宰后牦牛肉成熟，HIF-1α表達量、NO含量、Na＋-K＋-ATPase活力、Ca2+-ATPase活力、Caspase-9活力、Caspase-3活力與剪切力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，ATP含量、MPTP開放程度、MMP與及肌纖維直徑和面積呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，而MFI與肌纖維間隙呈現(xiàn)逐漸上升趨勢。同時，與對照組相比，經(jīng)NH4Cl處理的牦牛肉NO含量增加，可能是通過釋放NO分子造成HIF-1α表達增加，而HIF-1α通過下調(diào)Na＋-K＋-ATPase與Ca2＋-ATPase活力減緩ATP消耗，維持宰后缺氧環(huán)境引起的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定狀態(tài)。HIF-1α通過抑制MPTP開放，減緩MMP下降，進而造成Caspase-9與Caspase-3活力降低，對線粒體細(xì)胞凋亡起抑制作用，進一步引起肌肉剪切力增大，MFI減小，肌纖維直徑、面積增大，細(xì)胞間隙變小，使肌纖維細(xì)胞形態(tài)收縮變化較小，對肌肉嫩度產(chǎn)生負(fù)面影響。綜上所述，氨能夠上調(diào)宰后牦牛肉細(xì)胞中HIF-1α表達，調(diào)節(jié)肌肉內(nèi)環(huán)境變化，通過抑制線粒體細(xì)胞凋亡，造成肌肉嫩度變差。本研究可為宰后牦牛肉成熟過程中細(xì)胞凋亡理論與嫩度調(diào)控提供一定的理論依據(jù)，同時為后續(xù)研究HIF-1α在宰后牦牛肉細(xì)胞中的調(diào)控機制提供新的思路。