錢欣穎 梁學(xué)亞 蔣 薇 李志勇

（成都百裕制藥股份有限公司創(chuàng)新藥研究院生物部，四川 成都，610000）

缺血性中風(fēng)，是腦血管疾病中比較常見的一種疾病，致殘率和致死率很高，是為患者和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)的疾病之一[1-2]。大腦動(dòng)脈（尤其是大腦中動(dòng)脈）閉塞會(huì)導(dǎo)致缺血性中風(fēng)，引起一系列神經(jīng)毒性事件，包括氧化損傷[3]、自噬[4]、血腦屏障通透性增加和功能障礙[5]、炎癥途徑[6]及鈣超載[7]等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元和腦細(xì)胞的死亡。鼻腔給藥是一種便捷的給藥方式，活性成分可經(jīng)鼻黏膜迅速吸收，作用于鼻腔局部和全身，此外，還可直接將藥物傳遞至大腦[8]。與口服或靜脈給藥相比，鼻腔給藥具有包括非侵入性、自我給藥以及高生物利用度等優(yōu)點(diǎn)，是近些年來(lái)制劑學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[9-10]。許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病已經(jīng)通過(guò)鼻腔給藥治療，如帕金森、阿爾茲海默癥、癲癇、成癮等[11]。鼻腔給藥治療腦缺血已有一定研究基礎(chǔ)。YANG J P 等[12]證實(shí)了鼻內(nèi)給藥重組人VEGF 可減少梗死體積，改善行為恢復(fù)，并增強(qiáng)腦血管生成。楊開清[13]用腦醒噴鼻劑治療急性缺血型中風(fēng)，該藥能顯著改善腦缺血，減輕自由基損傷，保護(hù)腦細(xì)胞。銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯的神經(jīng)保護(hù)作用已在多個(gè)臨床前研究中得到驗(yàn)證[14-17]。金閣萊?（銀杏內(nèi)酯注射液）是由白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C等組成的天然藥物注射液，是唯一兼具拮抗血小板活化因子及保護(hù)神經(jīng)血管單元的分子復(fù)方藥物，其安全性和有效性已在臨床得到證實(shí)。為了進(jìn)一步提高金閣萊有效藥物成分的臨床使用便利性、增加患者依從性，因此，本研究主要探究鼻內(nèi)給予銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑在腦缺血再灌注損傷方面發(fā)揮的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)6～8 周齡的SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量220～250 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001，合格證編號(hào)：20210316Aazz0619000800]提供。大鼠飼養(yǎng)在屏障內(nèi)，內(nèi)部環(huán)境溫度為（22±2）℃，環(huán)境濕度范圍為40%～70%，12 h 晝夜循環(huán)，動(dòng)物自由飲用水和飼料，適應(yīng)環(huán)境1 周左右開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑

銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑由成都百裕制藥股份有限公司與健喬信元醫(yī)藥生技股份有限公司（中國(guó)臺(tái)灣）合作研究和開發(fā)。陽(yáng)性藥物依達(dá)拉奉（生產(chǎn)企業(yè)：先聲藥業(yè)集團(tuán)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：86-200802）。氯化三苯基四氮唑（生產(chǎn)企業(yè)：北京西濃科技，生產(chǎn)批號(hào)：409E033）。多聚甲醛（生產(chǎn)企業(yè)：科隆化工，生產(chǎn)批號(hào)：2019052001）。甲醇(HPLC 級(jí))購(gòu)自Merck kGaA。

1.3 儀器設(shè)備

電子天平（生產(chǎn)企業(yè)：德國(guó)賽多利斯，型號(hào)：SECURA225D-1CN）、小動(dòng)物安樂死系統(tǒng)（生產(chǎn)企業(yè)：上海玉研科學(xué)儀器廠，型號(hào)：LC-500-S1）、高速冷凍離心機(jī)（生產(chǎn)企業(yè)：四川蜀科儀器廠，型號(hào)：TGL-16）、高效液相色譜系統(tǒng)（生產(chǎn)企業(yè)：日本 SHIMADZU，型號(hào)：LC-20AD）、四極桿離子阱質(zhì)譜儀（生產(chǎn)企業(yè)：美國(guó) Applied Biosystem，型號(hào)：API 4000）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定

通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)法檢測(cè)大鼠血漿含有的銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑的藥物濃度。SD 大鼠鼻腔滴注（IN）10 mg/kg 銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑，分別在0、0.25、0.5、1、2、4、8 h 各時(shí)間點(diǎn)麻醉取全血，離心得到血漿，向含25 μL 的空白血漿（標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)控樣品）或待測(cè)血漿樣品的96 孔板中加入25 μL 標(biāo)準(zhǔn)樣品系列溶液、質(zhì)控溶液或甲醇，再加25 μL 內(nèi)標(biāo)工作液，最后加200 μL 甲醇，渦旋震蕩3 min，在3 800 rpm/min 條件下進(jìn)行15 min 離心處理，用移液槍吸取上清液200 μL 進(jìn)行LC-MS/MS 檢測(cè)藥物濃度。

2.2 動(dòng)物藥效實(shí)驗(yàn)

2.2.1 動(dòng)物分組及給藥方式

篩選35 只健康狀態(tài)良好的雄性SD 大鼠，按照體質(zhì)量對(duì)其進(jìn)行分組，設(shè)置假手術(shù)組（5 例），腦缺血再灌注模型組（10例）、依達(dá)拉奉陽(yáng)性對(duì)照組（6 mg/kg）（10 例）、銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑組（10 例）。所有動(dòng)物在復(fù)灌后即刻首次給藥，陽(yáng)性對(duì)照依達(dá)拉奉組尾靜脈注射，連續(xù)給藥3 d；銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑組滴鼻給藥，造模當(dāng)天給藥1 次，之后給藥2 次/d，共給藥3 d，具體操作為將動(dòng)物保持仰臥姿勢(shì)，藥物通過(guò)右鼻孔滴注100 μL，左鼻孔不給藥[18]。模型組與假手術(shù)組經(jīng)鼻給予同體積的溶媒。

2.2.2 大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注（MCAO）模型構(gòu)建

給藥組與模型組大鼠按7 mL/kg 腹腔注射6%的水合氯醛麻醉，在手術(shù)臺(tái)上保持仰臥姿勢(shì)。大鼠頸部正中偏右剪開皮膚，做大約1.5 cm 長(zhǎng)的切口，分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，沿頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端將頸內(nèi)外動(dòng)脈分離，在頸外動(dòng)脈處做切口，沿頸內(nèi)動(dòng)脈插入線栓，有明顯阻力感立即停止插入，缺血2 h后，將線栓完全取出，實(shí)現(xiàn)缺血再灌注。假手術(shù)組動(dòng)物用6%水合氯醛麻醉后，僅分離暴露頸總動(dòng)脈，不做中動(dòng)脈栓塞處理。在整個(gè)操作過(guò)程中，使用加熱墊和加熱燈將大鼠體溫保持在（37.0±0.5）℃。

2.2.3 觀察指標(biāo)

（1）神經(jīng)功能評(píng)分：通過(guò)Longa 評(píng)分法對(duì)大鼠在經(jīng)過(guò)24 h 的缺血再灌注后的神經(jīng)癥狀進(jìn)行評(píng)分[18]。評(píng)分結(jié)果劃分成5 個(gè)級(jí)別，級(jí)別越高，代表神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重，詳細(xì)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

表1 Longa 評(píng)分表

（2）腦梗死面積檢測(cè)：大鼠缺血再灌注72 h 后，將大鼠置于二氧化碳安樂死箱中進(jìn)行安樂死，將提前預(yù)冷的PBS 溶液灌注心臟，迅速取各組動(dòng)物腦組織，除去小腦、嗅球、低位腦干部分，沿冠狀切面切成厚度約2 mm 的6 片腦部切片，輕輕置于1%的TTC 溶液中，37 ℃水浴30 min，期間用鑷子輕輕翻動(dòng)，經(jīng)染色后正常腦組織呈現(xiàn)紅色，梗死組織區(qū)域不會(huì)被染色（呈現(xiàn)蒼白色），用圖像分析軟件對(duì)每個(gè)切片上的梗死區(qū)域進(jìn)行劃分和分析，計(jì)算腦梗死面積百分比，腦梗死面積百分比（%）= 腦右側(cè)梗死面積/全腦面積×100%。

（3）相對(duì)腦含水量檢測(cè)：大鼠缺血再灌注后72 h 后進(jìn)行安樂死，取腦組織，即上述腦梗死面積檢測(cè)組織，在TTC 染色前準(zhǔn)確稱取腦組織濕重，TTC 染色后將組織放于60 ℃恒溫干燥箱中烘烤24 h，干燥后準(zhǔn)確稱取腦組織干重，按照干濕重法對(duì)大鼠的相對(duì)腦含水量進(jìn)行計(jì)算，公式為：相對(duì)腦含水量測(cè)試組=［（腦組織濕重-腦組織干重）測(cè)試組-（腦組織濕重-腦組織干重）假手術(shù)組］

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用EXCEL 和SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以（±s）表示，采用Graph Pad Prism 8 軟件對(duì)不同組別動(dòng)物給藥后的參數(shù)進(jìn)行繪圖。數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，當(dāng)方差齊時(shí)P＞0.05，采用單因素方差分析（ANOVA）中的Dunnett's &LSD 法對(duì)組間差異進(jìn)行比較。當(dāng)方差不齊時(shí)P＜0.05，通過(guò)Kruskal-Wallis H 秩和檢驗(yàn)（K-W 法）里面的Mann-Whitney U 檢驗(yàn)（M-W 法）完成組間差別分析。通過(guò)WinNonlin 8.3 軟件對(duì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行求取。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 鼻腔滴注藥代動(dòng)力學(xué)

SD 大鼠鼻腔給予10 mg/kg 銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑后在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采血，對(duì)銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑內(nèi)含的主要成分，即白果內(nèi)酯與銀杏內(nèi)酯B 進(jìn)行檢測(cè)，具體藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。其中，白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯B 的半衰期t1/2分別為2.70 h 和8.04 h，給藥時(shí)曲線下面積AUCall分別為3 046 ng/mL 和1 257 ng/mL，藥物達(dá)峰時(shí)間tmax分別為2 h 和0.333 h，結(jié)果表明藥物可通過(guò)鼻腔系統(tǒng)迅速吸收進(jìn)入全身，且具有較好的藥代特征。

表2 大鼠鼻腔給藥銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑10 mg/kg 的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=10)

4.2 銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑對(duì)大鼠Longa 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響

建模24 h 之后，假手術(shù)組大鼠除因外科手術(shù)創(chuàng)口導(dǎo)致活動(dòng)略微減少外，未見明顯異常癥狀；其余各組動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的體質(zhì)量下降，活動(dòng)減緩，對(duì)側(cè)前爪屈曲、行走時(shí)身體向?qū)?cè)偏倒或者無(wú)法自發(fā)行走，對(duì)所有組大鼠進(jìn)行Longa 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。Longa 評(píng)分結(jié)果見表3 和圖1，模型組評(píng)分為（2.92±0.19）分，依達(dá)拉奉組為（2.20±0.25）分，銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑組為（2.09±0.09）分。與假手術(shù)組相比較，模型組評(píng)分顯著升高（P＜0.001），動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的運(yùn)動(dòng)行為缺陷，表明建模成功。與模型組相比，依達(dá)拉奉組、銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑組運(yùn)動(dòng)行為缺陷減少，神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑組與依達(dá)拉奉組評(píng)分相當(dāng)或更低。

圖1 銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑對(duì)大鼠Longa 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響

表3 各組動(dòng)物L(fēng)onga 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果 （±s，分）

表3 各組動(dòng)物L(fēng)onga 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果 （±s，分）

注：與假手術(shù)組相比，***P＜0.001；與模型組相比，#P＜0.05。

4.3 銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑對(duì)大鼠腦梗死面積的影響

造模72 h 后，模型組大鼠右腦部位出現(xiàn)了明顯的梗死灶，依達(dá)拉奉組和銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑組出現(xiàn)不同程度的梗死灶。TTC 染色結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物腦梗死面積百分比為（24.78±1.72）%，與假手術(shù)組（0.00±0.00）%相比顯著升高（P＜0.001）；給予依達(dá)拉奉后，腦梗死面積明顯減小，百分比為（10.89±1.57）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑組腦梗死面積百分比為（20.57 ±1.40）%，與模型組相比雖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但仍表現(xiàn)一定降低腦梗死面積的作用，見圖2。

圖2 銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑對(duì)大鼠腦梗死面積的影響

4.4 銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑對(duì)大鼠腦水腫的影響

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，檢測(cè)各組動(dòng)物相對(duì)腦含水量（g），結(jié)果顯示，模型組大鼠與假手術(shù)組的相對(duì)腦含水量分別是（0.20±0.03）g與（0.00±0.03）g，模型組明顯更高，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；給予銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑和依達(dá)拉奉可明顯減少相對(duì)腦含水量，腦相對(duì)含水量分別為（0.12±0.03）g 和（0.13±0.03）g，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑對(duì)大鼠MCAO 模型中的腦水腫有良好的改善作用，在該指標(biāo)上與陽(yáng)性依達(dá)拉奉相當(dāng)，見圖3。

圖3 銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑對(duì)大鼠腦水腫的影響

5 討論

許多臨床前研究已經(jīng)驗(yàn)證了銀杏內(nèi)酯與白果內(nèi)酯對(duì)于缺血性中風(fēng)的細(xì)胞和信號(hào)事件的作用，包括炎癥途徑和神經(jīng)保護(hù)。本研究中的銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑主要成分為銀杏內(nèi)酯A/B/C/J（總占比為52%～64%）、白果內(nèi)酯（占比為36%～48%）。以往研究結(jié)果表明，對(duì)小鼠tMCAO 模型腹腔注射給予3.5 mg/kg 銀杏內(nèi)酯注射液，能顯著改善模型急性期臨床癥狀，主要機(jī)制為通過(guò)抑制模型發(fā)展過(guò)程中的炎癥因子和炎癥小體進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)作用[19]。同樣，在大鼠MCAO 模型上同樣證明了銀杏內(nèi)酯注射液和其內(nèi)部主要成分銀杏內(nèi)酯B 與白果內(nèi)酯在急性腦缺血性腦損傷方面的治療作用，其機(jī)理可能和突觸后致密蛋白的濃度發(fā)生改變有關(guān)[20]。

為了提高臨床的使用便利性和患者的依從性，我們探索開發(fā)銀杏內(nèi)酯的鼻噴制劑。由于鼻噴劑用藥方便、適合擴(kuò)展國(guó)際市場(chǎng)等多方面優(yōu)勢(shì)，在中風(fēng)、創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合征、鎮(zhèn)靜抗焦慮及血管性癡呆等適應(yīng)證方向具有較高的應(yīng)用價(jià)值?；谙嚓P(guān)制劑體系，采用不同比例和類型的增溶劑、抗菌防腐劑、陽(yáng)離子螯合劑、增稠劑、助懸劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和溶劑等，制備了多種制劑配方，最終篩選得到的鼻噴劑處方可以達(dá)到10 mg/mL 的載藥濃度。大鼠鼻腔滴注銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)也很好證明了藥物可通過(guò)鼻黏膜吸收迅速進(jìn)入體內(nèi)，具有一定的暴露，且銀杏內(nèi)酯B 的半衰期可達(dá)到8 h。

在實(shí)驗(yàn)性中風(fēng)研究中，大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）被認(rèn)為是模擬人類缺血性中風(fēng)的最佳模型之一，并在大鼠和沙鼠上有大量研究[21]。本研究中，采用線栓法構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，以依達(dá)拉奉為陽(yáng)性對(duì)照，缺血再灌注后，鼻內(nèi)滴注銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑能改善神經(jīng)功能損傷，減小腦梗死面積，改善腦水腫，表明銀杏內(nèi)酯鼻噴制劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性的局灶性腦缺血再灌注模型在急性發(fā)作期間的受損具有顯著的保護(hù)作用，是一種潛在的治療方案。