朱駿馳，郭印山，郭修武*

（1. 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)系，上海 201699；2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧沈陽 110866）

葡萄屬多年生落葉藤本植物，不同地域的地理?xiàng)l件和自然環(huán)境促成了葡萄品種多樣化，并已開發(fā)出很多配套的栽培技術(shù)。隨著葡萄經(jīng)濟(jì)價(jià)值不斷被發(fā)掘，現(xiàn)代葡萄種植產(chǎn)業(yè)高度發(fā)達(dá)，鮮食葡萄及加工后的葡萄干、葡萄酒等產(chǎn)品備受人們的青睞[1]。

隨著葡萄種植技術(shù)的不斷發(fā)展，葡萄種質(zhì)資源持續(xù)改良。草莓香型、玫瑰香型是葡萄的兩種典型香型，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-3]。一般認(rèn)為，香氣物質(zhì)多數(shù)作為數(shù)量性狀，在遺傳上由多基因控制，少數(shù)表現(xiàn)為受一對(duì)或多對(duì)基因控制的質(zhì)量性狀[4]。本試驗(yàn)使用固相微萃取技術(shù)與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，通過構(gòu)建雜交群體檢測(cè)種間雜交后代香氣物質(zhì)及分析草莓香型香氣物質(zhì)遺傳特點(diǎn)，為草莓香型葡萄新品種選育及香氣物質(zhì)的相關(guān)基因篩選提供表型數(shù)據(jù)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以親本‘紅地球’（母本）與‘金星無核’（父本）及種間雜交后代為試材，后代未經(jīng)人為選擇。2008年5月進(jìn)行雜交，秋季選取飽滿及無霉菌感染的雜交種子，同年10月至2009年2月進(jìn)行層積處理，3月對(duì)雜交種子進(jìn)行催芽處理及溫室營(yíng)養(yǎng)缽點(diǎn)播，4—6月進(jìn)行移栽定植和掛牌標(biāo)記，2012年以后大部分實(shí)生苗結(jié)果，現(xiàn)所有試驗(yàn)材料均定植于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄試驗(yàn)基地（41°50′24″N，123°24′41″E），長(zhǎng)勢(shì)良好。雜交后代群體共有531株，隨機(jī)選取其中183株連同親本用于本研究。由于試材果實(shí)成熟期不同，用果實(shí)糖度含量與種子呈褐色作為果實(shí)成熟鑒別依據(jù)。為了避免過早或過晚采集樣品，每72 h對(duì)樣本成熟度進(jìn)行田間調(diào)查，一般在8月下旬至10月上旬陸續(xù)采集。

果實(shí)采集時(shí)，兼顧陰陽面每一樣品植株取3穗果，每穗隨機(jī)取20個(gè)成熟度一致且無機(jī)械損傷的果實(shí)，按照相同采樣標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)3次。摘取的果實(shí)放入提前做好標(biāo)記的自封袋中，在經(jīng)液氮速凍后，-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆肹5]。2016年采集共計(jì)151份材料包括149個(gè)結(jié)果后代單株與兩個(gè)親本，2017年采集共計(jì)161份材料包括159個(gè)結(jié)果后代單株與兩個(gè)親本，進(jìn)行香氣測(cè)定與分析。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器（GC-MS）；氮?dú)淇找惑w機(jī)（Nitrogen-hydrogen Air Machine）；SPME手柄及萃取頭；榨汁機(jī)；多功能恒溫?cái)嚢杵鳌?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

葡萄果實(shí)中香氣物質(zhì)成分及含量通過NIST11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫匹配及標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線后進(jìn)行定性定量分析，試驗(yàn)中設(shè)置的固相微萃取條件以李志文等[6]的方法為參考。萃取步驟：將低溫保存的葡萄樣品化凍至室溫，在每一樣品中稱取30～40 g作為萃取樣品，剔除果實(shí)中的種子與果梗，用榨汁機(jī)榨汁，抽取8 mL樣品放入離心管離心5 min，轉(zhuǎn)入容量為20 mL頂空瓶?jī)?nèi)攪拌，加入干燥后的磁力與3.0 g NaCl后混勻密封；將SPME萃取頭輕緩插入頂空瓶后推出石英纖維；樣品加熱至60 ℃，以950 r·min-1的速度進(jìn)行磁力攪拌；靜置吸附40 min，回抽石英纖維和萃取頭，轉(zhuǎn)入氣相色譜進(jìn)樣口；加溫至250 ℃，完全干燥后用儀器解析5 min，同步記錄所有數(shù)據(jù)。試驗(yàn)中采用的進(jìn)樣口以無分流模式為主，萃取頭在使用前經(jīng)1 h的270 ℃高溫老化處理。

G C 分析：繪制色譜柱V F-Wa x m s 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 μm，0.25 mm），注入高純度He，在流速為1 mL·min-1下通過250 ℃的進(jìn)樣口，不分流手動(dòng)進(jìn)樣，解析5 min。溫控步驟：先將初始溫度調(diào)整為60 ℃，持續(xù)3 min，按照3 ℃·min-1的升溫速度提至120 ℃，保持2 min，再按5 ℃·min-1的速度升至210 ℃，保持5 min。

MS條件：GC-MS傳輸線250 ℃、EI離子源200 ℃，電子能量70 eV、廣電倍增管電壓為350 V，在荷質(zhì)比（m/z）45～600 amu范圍內(nèi)啟用全掃描模式。

1.4 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜圖采集結(jié)束后，在系統(tǒng)中打開N I S T Chemistry WebBook，在信息檢索欄查找相關(guān)測(cè)試數(shù)據(jù)，將質(zhì)譜圖中的數(shù)據(jù)與檢索得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，評(píng)測(cè)匹配程度以確定香氣中的物質(zhì)成分。采用SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)分析軟件中PCA分析模塊確定香氣物質(zhì)中的主成分，并繪制香氣成分中的標(biāo)準(zhǔn)品主成分曲線，采用定量分析法解析香氣成分。

采用Excel 2019對(duì)親中值、子代均值和變異系數(shù)等相關(guān)遺傳指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，相關(guān)計(jì)算公式參照《果樹育種學(xué)》及相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]計(jì)算方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩品種雜交后代香氣物質(zhì)鑒定

從親本的香氣成分?jǐn)?shù)據(jù)對(duì)比上看，水楊酸甲酯、大馬士酮、苯乙醇、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯的含量不同是造成親本葡萄果實(shí)樣品香氣成分差異的主要原因，分別對(duì)應(yīng)出峰時(shí)間為25.851、28.312、31.144、40.484、45.546 min。

2.2 兩品種雜交后代酯類香氣物質(zhì)的遺傳分析

圖1為3種主要的酯類香氣物質(zhì)（水楊酸甲酯、鄰苯二甲酸二甲酯和鄰苯二甲酸二丁酯）在親本及雜交后代中含量分布情況?？梢钥闯?，在2016、2017兩年試驗(yàn)中3種酯類香氣物質(zhì)遺傳存在相似性，即酯類香氣物質(zhì)在父本‘金星無核’中的含量均高于在子代中的含量，絕大多數(shù)子代中的含量高于母本‘紅地球’中的含量。

圖1 在親本和雜交后代中酯類香氣物質(zhì)含量分布Figure 1 Content distribution of ester aroma compounds in parental and hybrid progeny

由表1可以看出，連續(xù)兩年的各酯類香氣物質(zhì)的變異系數(shù)范圍在123.2%～251.4%，可以看出雜交后代酯類香氣物質(zhì)分離趨勢(shì)廣泛，選擇潛力大。遺傳傳遞力最小為2017年鄰苯二甲酸二甲酯的116.7%，最大為2017年鄰苯二甲酸二丁酯的197.8%，且超低親率明顯高于超高親率，在遺傳效應(yīng)上呈現(xiàn)典型的趨小性遺傳特征。

表1 ‘紅地球’和‘金星無核’及雜交后代中各香氣物質(zhì)的遺傳變異Table 1 The hereditary variation of aroma compounds in 'Red Globe' 'Venus Seedless' and their hybrids%

2.3 兩品種雜交后代大馬士酮香氣物質(zhì)的遺傳分析

大馬士酮是異戊二烯代謝合成途徑產(chǎn)生的葡萄果實(shí)香氣組分，具有花香、木瓜等氣味特征，雖然含量較低但受到其低閾值的影響，對(duì)葡萄及葡萄酒豐富的花果香味具有重要的貢獻(xiàn)[10-11]。有研究表明，大馬士酮可以通過與葡萄及葡萄酒中其他香氣成分互作，增強(qiáng)果香[12-14]。

本試驗(yàn)中大馬士酮香氣物質(zhì)全部遺傳到所有雜交后代中，屬于連續(xù)變量的數(shù)量性狀遺傳。通過圖2可以看出，其遺傳特點(diǎn)兩年大體上一致，即父本‘金星無核’中大馬士酮的含量均高于子代的中間值，母本‘紅地球’中大馬士酮的含量小于絕大多數(shù)子代中的含量，其中2016年大馬士酮在母本‘紅地球’中的含量小于所有子代中的含量。

圖2 在親本和雜交后代中大馬士酮含量分布Figure 2 Content distribution of damascenone in parental and hybrid progeny

通過表1可以看出大馬士酮兩年的變異系數(shù)分別為228.9%和157.4%，且2016年親本與子代葡萄果實(shí)中大馬士酮含量均值低于2017年（圖2），2017年含量分布范圍更廣表明雜交后代大馬士酮香氣物質(zhì)分離趨勢(shì)大，選擇潛力大。大馬士酮遺傳傳遞力兩年平均為53.7%，超高親率兩年均大于50%，顯著高于超低親率（13.4%和15.5%），說明大馬士酮香氣物質(zhì)遺傳給雜交后代的能力比較強(qiáng)，在遺傳效應(yīng)上呈現(xiàn)典型的趨大性遺傳特征。

2.4 兩品種雜交后代苯乙醇香氣物質(zhì)的遺傳分析

苯乙醇是一種從植物資源中發(fā)現(xiàn)的芳香族化合物，在蘋果、獼猴桃、桃、樹莓、葡萄等多種果樹中均有發(fā)現(xiàn)，具有清甜的花香味，被廣泛應(yīng)用于調(diào)味料和化妝品中[15-19]。通過表1可以看出，苯乙醇兩年的變異系數(shù)均值為223.5%，遺傳傳遞力都不低于130.1%。兩年間超低親率分別為37.3%和62.6%，遠(yuǎn)高于超高親率，在遺傳效應(yīng)上呈現(xiàn)典型的趨小性遺傳特征。

苯乙醇在雜交后代出現(xiàn)了分離的遺傳表現(xiàn)，2016年和2017年分別在86個(gè)和85個(gè)雜交后代中檢測(cè)到了苯乙醇香氣物質(zhì)，在后代群體中分別占比57.7%和53.5%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)計(jì)算求得卡方值分別為3.55和0.76，均小于P值3.84，說明苯乙醇符合質(zhì)量性狀的遺傳規(guī)律。兩年間苯乙醇在父本‘金星無核’中的含量均遠(yuǎn)高于子代含量的中間值（圖3），但在母本‘紅地球’中的含量2016年遠(yuǎn)低于子代含量的中間值，2017年略高于子代含量的中間值，表明兩年間苯乙醇在雜交后代中表現(xiàn)出了不完全相同的遺傳特點(diǎn)。

3 討論與結(jié)論

葡萄雜交育種過程中，受親本基因正向及反向的影響，后代雜交性狀廣泛分離，形成一些超高親植株，這也正是有性雜交的意義[20-22]。

葡萄香氣是近年來消費(fèi)者最在意的性狀之一，也是重要的商品指標(biāo)。葡萄的草莓香味，也稱狐香，主要在美洲種及歐美雜交后代的果實(shí)中存在，這種獨(dú)特香味的形成與多種酯類揮發(fā)性物質(zhì)及降異戊二烯類物質(zhì)有關(guān)[23-25]。目前，有關(guān)香氣物質(zhì)遺傳規(guī)律研究多數(shù)選用玫瑰香型葡萄為試材，關(guān)于草莓香型葡萄特征香氣物質(zhì)遺傳規(guī)律的研究報(bào)道相對(duì)較少。郭印山等[26]對(duì)以玫瑰香型葡萄品種‘87-1’為親本構(gòu)建的雜交群體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)主要香氣物質(zhì)萜稀類化合物在雜交后代呈廣泛分離，其中香葉醇在遺傳效應(yīng)上呈典型的增強(qiáng)變異，部分香氣物質(zhì)受環(huán)境影響較大。劉若瑾等[27]認(rèn)為，26種單萜化合物是構(gòu)成玫瑰香型葡萄的主要香氣物質(zhì)，雜交后代中果實(shí)香氣物質(zhì)種類基本相同，在含量上有巨大差異，導(dǎo)致不同單株的果實(shí)香氣產(chǎn)生差別。曹亞平[28]研究發(fā)現(xiàn)，無香型葡萄品種‘京秀’與草莓香型葡萄品種‘布朗無核’的雜交后代中僅有11.1%呈現(xiàn)草莓香型，大部分均為無香型。孫婷[29]研究認(rèn)為，草莓香型葡萄主要香氣物質(zhì)為酯類化合物，種間雜交后代大部分的酯類香氣物質(zhì)呈低親遺傳效應(yīng)。

本研究剖析了以‘紅地球’和‘金星無核’葡萄雜交F1代果實(shí)中5種主要香氣物質(zhì)遺傳規(guī)律。發(fā)現(xiàn)5種主要香氣物質(zhì)變異系數(shù)均大于100%，后代出現(xiàn)廣泛分離，選擇潛力大，其中大馬士酮2016年的變異系數(shù)最大，選擇潛力最大。水楊酸甲酯、鄰苯二甲酸二甲酯與鄰苯二甲酸二丁酯在父本中的含量遠(yuǎn)高于母本，且在后代中出現(xiàn)了連續(xù)的變異，平均遺傳力為153.2%，符合數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)。親本均值高于大部分雜交后代果實(shí)中酯類化合物的含量，呈現(xiàn)趨低遺傳。何明茜[30]研究草莓香型香氣物質(zhì)遺傳特點(diǎn)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，酯類化合物在草莓香型親本中含量遠(yuǎn)高于無香型親本品種，少數(shù)酯類化合物如苯甲酸乙酯等有超親遺傳的現(xiàn)象，這些結(jié)果的不同可能是因?yàn)橛H本遺傳背景及試材地點(diǎn)氣候的差異，說明葡萄酯類化合物遺傳是非常復(fù)雜的。

在研究中也發(fā)現(xiàn)了大馬士酮和苯乙醇對(duì)草莓香型香味的形成貢獻(xiàn)率較高，并且連續(xù)兩年大多數(shù)子代中大馬士酮的含量高于親本，在后代中也出現(xiàn)了連續(xù)變異，且超高親率均超過50%，表現(xiàn)為趨大的遺傳傾向。

苯乙醇在后代群體中檢測(cè)到的比率分別為57.7%和53.5%，通過卡方適合性檢驗(yàn)計(jì)算，檢測(cè)出苯乙醇的次數(shù)與理論分離比例為1∶1，符合質(zhì)量性狀不連續(xù)變異的遺傳特點(diǎn)。李坤等[31]研究歐美雜交品種‘紫珍香’自交后代中發(fā)現(xiàn)，香氣成分苯乙醇也符合質(zhì)量性狀的遺傳特點(diǎn)。

遼寧沈陽屬北溫帶大陸性氣候，氣候溫和，雨量適中，光照充足，且秋季晝夜溫差較大，有利于優(yōu)質(zhì)葡萄的生產(chǎn)。結(jié)合沈陽氣象局公布的氣象數(shù)據(jù)，2017年沈陽降水量為463.8 mm，不足2016年967.9 mm的一半，為枯水年，日照時(shí)數(shù)與平均氣溫均多于2016年，表明不同年份間氣候的差異對(duì)降異戊二烯香氣物質(zhì)的合成積累產(chǎn)生了一定的影響。2017年大馬士酮在親本中的含量相比2016年顯著增加，表明干旱、炎熱的年份對(duì)大馬士酮的積累有積極的作用[32]。Xie等[33]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄果實(shí)大馬士酮的含量受溫度、濕度、日照時(shí)長(zhǎng)及無霜天數(shù)等的強(qiáng)烈影響。此外也有研究表明，干旱、摘葉、整形方式及果實(shí)大小等因素均影響葡萄果實(shí)中香氣物質(zhì)大馬士酮的積累[34-37]。

綜上所述，育種者可以從雜交后代中挑選一些草莓香型香氣物質(zhì)高于親本的優(yōu)系個(gè)體進(jìn)一步選育，同時(shí)也更應(yīng)該關(guān)注草莓香型特征香氣物質(zhì)的遺傳規(guī)律。