宋澤鑫，周艷，林曉晨，趙永美，施鵬，王學(xué)付，張朝武，李鴻鈞

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所

云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650118

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）是一種具有包膜的正鏈單股RNA 病毒，病毒顆粒呈圓形或橢圓形，直徑80~120 nm，屬于冠狀病毒科乙型冠狀病毒屬［1］。自2019 年12 月起，由SARS-CoV-2 引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）疫情大流行持續(xù)至今［2］，截至2022年9月18 日，全球已累計(jì)報(bào)道超過6.09 億例確診病例，其中包括560萬例死亡病例［3］。

SARS-CoV-2 RNA基因組為27 000~32 000 bp［4］，分為14個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）。位于5'端的ORF1a／b 約占全基因組的2／3，編碼16種非結(jié)構(gòu)蛋白；3'端剩余1／3 的基因組編碼9 種輔助蛋白和4 種結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N）［5］。SARS-CoV-2 感染主要依賴于S蛋白與宿主細(xì)胞受體人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（human angiotensin converting enzyme 2，hACE2）的結(jié)合［6］，在接觸宿主細(xì)胞時(shí)，病毒的S 蛋白會經(jīng)歷特定的構(gòu)象變化［7］，S 蛋白會被細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)膜蛋白酶剪切酶2 裂解為S1 和S2 兩個(gè)亞基，使其受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）與hACE2相結(jié)合，通過促進(jìn)S2 亞基介導(dǎo)與細(xì)胞的膜融合完成感染［8］?；赗BD 可誘導(dǎo)高效的中和反應(yīng)，其也成為SARSCoV-2疫苗研發(fā)的重要靶標(biāo)［9］。SARS-CoV-2 N蛋白的基本功能是將病毒基因組包裝成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）顆粒。因此，N 蛋白具有識別和結(jié)合RNA 的能力［10-11］，將N 蛋白作為疫苗標(biāo)靶，可發(fā)揮阻斷N 蛋白與病毒基因組的結(jié)合或誘導(dǎo)N 蛋白異常寡聚化以抑制RNP 的正確組裝，從而影響子代病毒復(fù)制的作用［12-14］。

腺病毒是具有雙鏈DNA 基因組的無包膜病毒。腺病毒感染細(xì)胞類型廣譜，基因組易于操作，插入外源基因相對容易，基因表達(dá)穩(wěn)定，通過黏膜途徑具有高效的感染性［15-17］，較適合作為重組真核表達(dá)載體特別是基因工程疫苗載體［18］。E1／E3 缺失的第1 代腺病毒載體具有較高的安全性。本研究使用的腺病毒載體系統(tǒng)是第3 代腺病毒系統(tǒng)pAdEasy-1將外源基因片段同源重組至腺病毒載體上，在HEK-293 細(xì)胞中完成病毒包裝，從而表達(dá)目的蛋白。本研究采用該系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)SARS-CoV-2 Delta 突變株S 蛋白RBD 和N 蛋白的重組腺病毒，并進(jìn)行鑒定，旨在為SARS-CoV-2 Delta 突變株重組腺病毒疫苗的開發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為目前使用的SARSCoV-2 滅活疫苗和基于野生型或其他突變株開發(fā)的重組蛋白疫苗、亞單位疫苗的聯(lián)合免疫提供可選的疫苗株［19-20］。

1 材料與方法

1.1菌株、細(xì)胞及質(zhì)粒E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、E.coliBJ5138 感受態(tài)細(xì)胞、人胚胎腎細(xì)胞293（HEK-293）、猴胚腎細(xì)胞MA-104（MA104）、pcDNA3.0BA 載體［21］、穿梭載體（pShuttle-CMV）和通用腺病毒骨架載體（pAdeasy-1）均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級BALB／c小鼠12只，雌性，6~8 周齡，體質(zhì)量18 ~ 22 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號：SYXK（滇）K2019-0003。本研究均以科研為目的對小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，且按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查規(guī)定進(jìn)行操作（GB／T 35892-2018），批準(zhǔn)文號為：DWSP202206007。

1.3主要試劑及儀器 蛋白胨、酵母提取物和NaCl購自美國OXOID 公司；FastDigest 限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ、XhoⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ和SalⅠ購自美國Thermo公司；限制性內(nèi)切酶PacⅠ和PmeⅠ購自美國NEB公司；INVI DNA RNA Transfection Reagent購自美國InvigentechTM公司；Plasmid Mini KitⅠ、Endo-Free Plasmid Maxi Kit和Gel Extraction Kit購自美國Omega公司；FITC-Goat anti-Mouse IgG／FITC-Goat anti-Rabbit IgG 和超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自美國Proteintech公司；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco 公司；T4 DNA連接酶、PrimeSTARMax、MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit、PrimeScript?One Step RT-PCR Kit和腺病毒滴度測定試劑盒購自日本TaKaRa 公司；Tween-20 和Triton-RX-100 購自德國BioFoxx 公司；Kanamycin、Ampicillin sodium、BSA、Cy3-Goat-anti-Mouse IgG PAB、Cy3-Goat-anti-Rabbit IgG PAB、抗熒光衰減封片劑及含DAPI、TMB 單組分顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；Anti-SARS-CoV-2 N rMAB、HRP-Goat-anti-MouseIgGPAB和HRP-Goat-anti-Rabbit IgG PAB購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；VAHTS DNA clean Beads 和anti-SARS-CoV-2 RBD mMAB 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；多聚甲醛購自西隴科學(xué)股份有限公司；RIPA 裂解液購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；PAGE 凝膠快速制備試劑盒（10%）購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；1 ×DPBS 緩沖液購自北京蘭杰柯科技有限公司；EASY spin Plus 組織／細(xì)胞RNA 快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；His-H1N1 NP 蛋白和His-SARS-CoV-2 Delta RBD 蛋白購自北京義翹神州科技股份有限公司；TMB 顯色終止液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Core700 純化分離柱購自美國GE公司。

1.4基因及引物合成 委托金斯瑞生物科技股份有限公司化學(xué)合成SARS-CoV-2 印度突變株B.1.617N基因和RBD基因序列，插入pUC57 載體中。使用Primer 3.5 Plus 在線軟件分別設(shè)計(jì)上下游引物，引物序列India nCOV-RBD（pc3.0BA）UP：5'-CGGATATCCGGCCACCATGAGAGTCCAACCAACAGAA-3'，DOWN：5'-CCCTCGAGGGTTAGAAATTGACACATTTGTT-3'；India nCOV-N（pc3.0BA）UP：5'-GGGGTACCCCGCCACCATGTCTGATAATGGACCCC-3'，DOWN：5'-CGGGATCCCGTTAGGCCTGAGTTGAGTCAGC-3'；將RBD-N插入pShuttle-CMV上的引物序列India nCOVRBD-N（pShuttle）UP：5'-GCGTCGACGTGCCACCATGAGAGTCCAACCAACAGAA-3'，DOWN：5'-CGGATATCCGTTAGGCCTGAGTTGAGTCAGC-3'。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

1.5目的基因的擴(kuò)增 將含SARS-CoV-2 B.1.617 株N基因和RBD基因序列的pUC57 載體轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，用含100 μg／mL 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基篩選陽性單克隆菌株，小量質(zhì)粒提取試劑盒提取菌液質(zhì)粒，以其為模板，PCR 擴(kuò)增目的片段。1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，膠回收目的基因片段。

1.6重組腺病毒載體的構(gòu)建

1.6.1雙順反子原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將回收的RBD片段與pcDNA3.0BA 載體分別經(jīng)EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切，回收RBD片段與載體片段，用T4 DNA 連接酶過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，用含100μg／mL 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基篩選陽性單克隆菌株，小量質(zhì)粒提取試劑盒提取菌液質(zhì)粒，進(jìn)行酶切、PCR 及基因測序（北京擎科生物科技股份有限公司完成）鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pcDNA-3.0BA-RBD。

將回收的N片段與pcDNA3.0BA-RBD分別經(jīng)KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收N片段與pcDNA3.0BARBD，用T4 DNA連接酶過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，用含100 μg／mL 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基篩選陽性單克隆菌株，小量質(zhì)粒提取試劑盒提取菌液質(zhì)粒，進(jìn)行酶切、PCR 及基因測序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pcDNA3.0BA-RBD-N。

1.6.2穿梭質(zhì)粒的連接 將質(zhì)粒pcDNA3.0BA-RBDN用pShuttle 上下游引物PCR 擴(kuò)增RBD-CMV-N片段，膠回收后與pShuttle-CMV 穿梭載體分別經(jīng)SalⅠ和EcoRⅤ雙酶切，回收RBD-CMV-N與pShuttle-CMV片段，用T4 DNA 連接酶過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，用含100μg／mL 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基篩選陽性單克隆菌株，小量質(zhì)粒提取試劑盒提取菌液質(zhì)粒，進(jìn)行酶切及基因測序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pShuttle-RBD-N。

1.6.3同源重組 將pShuttle-RBD-N用內(nèi)切酶PmeⅠ線性化，膠回收后進(jìn)行去磷酸化處理，將去磷酸化產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化后，電轉(zhuǎn)化入轉(zhuǎn)有pAdeasy-1 載體的E.coliBJ5138 感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物加入LB培養(yǎng)基中重懸培養(yǎng)，用含100μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基篩選陽性單克隆菌株，小量質(zhì)粒提取試劑盒提取菌液質(zhì)粒，進(jìn)行酶切及基因測序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pAdeasy-1-RBD-N。

1.7重組腺病毒的包裝 將pAdeasy-1-RBD-N陽性單克隆菌株進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，用無內(nèi)毒素大量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用內(nèi)切酶PacⅠ線性化后，進(jìn)行磁珠純化。將純化的質(zhì)粒用INVI DNA RNA Transfection Reagent 陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至6 孔板培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞中（細(xì)胞融合度為70%~80%），轉(zhuǎn)染后第7 天開始顯微鏡觀察細(xì)胞變化，待顯微鏡視野內(nèi)所有細(xì)胞均出現(xiàn)腺病毒病變反應(yīng)后，反復(fù)凍融細(xì)胞3 次，離心，收獲下層沉淀細(xì)胞碎片和上清，即為原代病毒液。

1.8重組腺病毒的鑒定

1.8.1PCR鑒定 用MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit 提取重組腺病毒Ad-RBD-N的DNA，分別用RBD和N的上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分析重組腺病毒中是否攜帶RBD和N基因。

1.8.2重組腺病毒中RBD和N基因轉(zhuǎn)錄的檢測 將收獲的下層沉淀細(xì)胞碎片用PBS洗凈，EASYspin Plus組織／細(xì)胞RNA 快速提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit 擴(kuò)增RBD和N基因，觀察重組腺病毒中RBD和N基因在HEK293 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。

1.8.3重組腺病毒中RBD和N蛋白表達(dá)的檢測

1.8.3.1Western blot 法 將收獲的下層沉淀細(xì)胞碎片用PBS 洗凈，RIPA 裂解液提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。取10 μg 蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%牛奶室溫封閉2 h；加入anti-RBD（PBST 1∶2 000稀釋）／anti-N（PBST 1∶1 000稀釋）一抗，4 ℃孵育過夜；PBST洗滌，加入HRP-Goat anti-Mouse IgG／HRP-Goat anti-Rabbit IgG（PBST 1∶10 000稀釋），室溫孵育2 h；PBST 洗滌，ECL 顯色，在超高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。以β-actin為內(nèi)參對照。

1.8.3.2免疫熒光法 將200μL 原代病毒液接種至放有25 nm MA104細(xì)胞爬片的6孔板中（細(xì)胞融合度約為80%），37 ℃，5% CO2恒溫孵育48 h；PBS 洗滌，用2%多聚甲醛固定；PBS 洗滌，用2% BSA 37 ℃封閉1 h；PBS 洗滌，加入anti-RBD（3% BSA 1∶100 稀釋）／anti-N（3%BSA 1∶200稀釋）一抗；PBST洗滌，避光加入Cy3-Goat anti-Mouse IgG／Cy3-Goat anti-Rabbit IgG（3% BSA 1∶500 稀釋）；PBST 洗滌，加入含DAPI 抗熒光衰減封片劑，染色封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.8.4小鼠免疫及血清抗體效價(jià)檢測 用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒，用Core700純化分離柱純化收獲的病毒液，經(jīng)30 KD 超濾管濃縮純化后，用腺病毒滴度測定試劑盒檢測病毒滴度。

將BALB／c小鼠隨機(jī)分成2組，采用后肢內(nèi)側(cè)肌肉注射方式分別注射重組腺病毒與PBS，50 μL／只，重組腺病毒注射劑量為5×109copies／只。免疫后14 d經(jīng)尾靜脈采血，200μL／只，37 ℃水浴1 h，4 ℃靜置過夜，離心取上層血清備用。以SARS-CoV-2 Delta RBD／N 蛋白為抗原（0.25μg／孔），用0.05 mol／L碳酸鹽溶液包被96 孔板，4 ℃過夜；PBST 洗滌，用3%BSA 封閉1 h；PBST 洗滌，加入等比稀釋的血清，以加入PBS作為空白對照，加入免疫前血清作為陰性對照，加入商業(yè)化抗體anti-SARS-CoV-2 RBD mMAB／Anti-SARS-CoV-2 N rMAB 作為陽性對照，37 ℃孵育1 h；PBST 洗滌，加入Goat anti-Mouse IgG（3% BSA 1∶20 000稀釋），37 ℃孵育1 h；PBST洗滌，加入TMB單組分顯色液顯色5 min；加入TMB 顯色終止液終止2 min，酶標(biāo)儀讀取A450-650值。以A450-650> 0.105 判為陽性，陽性稀釋度倒數(shù)的GMT 值為IgG 抗體效價(jià)，結(jié)果以Log2GMT表示。

1.9數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 9.5.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果

2.1重組腺病毒載體的構(gòu)建

2.1.1雙順反子原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，重組質(zhì)粒pcDNA3.0BA-RBD經(jīng)EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切，可見687 bp 的特異片段，重組質(zhì)粒pcDNA3.0BA-RBD-N經(jīng)KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切，可見1 272 bp的特異片段，大小均與預(yù)期一致，見圖1。重組質(zhì)粒pcDNA3.0BA-RBD和pcDNA3.0BARBD-N的PCR 產(chǎn)物也分別可見687 和1 272 bp 的目的片段，見圖2。測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中相應(yīng)大小的外源基因片段為目的片段。

圖1 雙順反子的雙酶切鑒定Fig.1 Identification of double cistron by double enzyme digestion

圖2 雙順反子的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of double cistron

2.1.2穿梭質(zhì)粒的連接 1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，重組質(zhì)粒pShuttle-RBD-N經(jīng)SalⅠ和EcoRⅤ雙酶切，可見約3 000 bp的特異片段，大小與預(yù)期相符，見圖3。測序結(jié)果也表明，重組質(zhì)粒中相應(yīng)大小的外源基因片段為目的片段。

圖3 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-RBD-N的雙酶切鑒定（SalⅠ／EcoRⅤ）Fig.3 Restriction map of recombinant shuttle plasmid pShuttle-RBD-N（SalⅠ／EcoRⅤ）

2.1.3同源重組 1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，重組質(zhì)粒pAdeasy-1-RBD-N經(jīng)PacⅠ單酶切，可見約30 000 bp的大片段和4 500 bp的小片段，大小均與預(yù)期相符，見圖4。測序結(jié)果也表明，重組質(zhì)粒中相應(yīng)大小的外源基因片段為目的片段。

圖4 重組質(zhì)粒pAdeasy-1-RBD-N的單酶切鑒定（PacⅠ）Fig.4 Restriction map of recombinant plasmid pAdeasy-1-RBD-N（PacⅠ）

2.2重組腺病毒的包裝 顯微鏡觀察顯示，pAdeasy-1-RBD-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)染第7 天后，HEK293 細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞病變，見圖5。

圖5 重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞的顯微鏡觀察（×200）Fig.5 Microscopy of HEK293 cells infected with recombinant adenovirus（×200）

2.3重組腺病毒的鑒定

2.3.1PCR 及RT-PCR 鑒定 PCR 及RT-PCR 結(jié)果表明，重組腺病毒攜帶目的基因片段，且目的基因可在HEK293細(xì)胞中正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，見圖6和圖7。

圖6 重組腺病毒的PCR鑒定Fig.6 PCR identification of recombinant adenovirus

圖7 重組腺病毒的RT-PCR鑒定Fig.7 RT-PCR identification of recombinant adenovirus

2.3.2RBD和N蛋白的表達(dá) Western blot及免疫熒光檢測結(jié)果表明，重組腺病毒RBD和N蛋白能在MA104細(xì)胞中正常表達(dá)，見圖8和圖9。

圖8 重組腺病毒RBD（A）和N（B）蛋白表達(dá)的Western blot鑒定Fig.8 Western blot identification of recombinant adenovirus RBD（A）and N（B）protein expression

圖9 重組腺病毒的免疫熒光鑒定（×100）Fig.9 Immunofluorescence identification of recombinant adenovirus（×100）

2.3.3效價(jià) 重組腺病毒免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了針對SARS-CoV-2 Delta 突變株S 蛋白RBD 和N蛋白的特異性IgG 抗體，抗體平均滴度分別為64 和16 384，見圖10。

圖10 免疫后14 d 小鼠血清與S 蛋白RBD 和N 蛋白的ELISA結(jié)合抗體效價(jià)Fig.10 ELISA-binding antibody titer of mouse serum to S protein RBD and N protein 14 d after immunization

3 討論

目前，SARS-CoV-2 仍在全球流行。2020 年，印度發(fā)現(xiàn)Delta（B.1.617.2）變異株［22］；2023 年，出現(xiàn)了由Omicron 和Delta 兩個(gè)變異株結(jié)合而成的重組變異體Deltacron［23］。Delta 和Deltacron 等變異株的出現(xiàn)不僅對全球經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生產(chǎn)生了巨大影響，而且給醫(yī)療秩序和社會穩(wěn)定帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。Delta（B.1.617.2）和Omicron（B.1.1.529）具有對現(xiàn)有SARS-CoV-2疫苗及單抗藥物一定程度的免疫逃逸能力，使得SARSCoV-2 的傳播和控制變得更加復(fù)雜［24］。有研究對19種COVID-19疫苗進(jìn)行分析對比，表明這些疫苗大體上對原始毒株和變體均具有很高的效力，且耐受性良好，但仍部分表現(xiàn)出對Delta 突變株保護(hù)力的下降［25］。而泰國的一項(xiàng)初步研究發(fā)現(xiàn)，在接受2 劑中國生物技術(shù)股份有限公司研發(fā)生產(chǎn)的滅活SARS-CoV-2疫苗CoronaVac的受試者中，接種第3劑BNT162b2／AZD1222后，針對Delta突變株的中和抗體有所增加［26］。因此，針對Delta 突變株的疫苗研發(fā)不僅對Delta 突變株流行的預(yù)防至關(guān)重要，在異源疫苗接種方面也具有良好的發(fā)展前景［27］。

本研究成功構(gòu)建了表達(dá)SARS-CoV-2 Delta 突變株S 蛋白RBD 和N 蛋白的重組腺病毒，免疫小鼠后產(chǎn)生了針對靶標(biāo)蛋白的特異性IgG抗體，為后續(xù)Delta突變株重組蛋白疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，為與不同種類SARS-CoV-2 疫苗的聯(lián)合免疫方案提供了新的選擇，也為針對新出現(xiàn)的變體的預(yù)防，終結(jié)SARS-CoV-2的流行起到了重要作用。

但本研究仍存在如下問題：在對重組腺病毒感染后的HEK293 細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot 識別后，結(jié)果RBD 蛋白大小并非是常見的34 000，而是約為70 000，推測可能為RBD蛋白的二聚體結(jié)構(gòu)［28］，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；而這種Delta突變株RBD 序列在腺病毒載體中表達(dá)為二聚體結(jié)構(gòu)的機(jī)制，這種二聚體結(jié)構(gòu)對其抗原性和免疫原性的影響以及與N 蛋白聯(lián)合免疫后的保護(hù)力尚不明確，且免疫小鼠后產(chǎn)生的針對N 蛋白的特異性IgG 抗體水平遠(yuǎn)高于RBD 蛋白，相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。