潘亞菲，趙志軍，，黨甜甜，康宇婷，賈偉，

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心，寧夏銀川750004；2.寧夏病原微生物重點實驗室，寧夏銀川750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，寧夏銀川750004

近年，碳青霉烯類耐藥腸桿菌在全球范圍內(nèi)急劇增加，給公眾健康造成了極大危害［1］。腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性主要由碳青霉烯酶引起，OXA-48 是全球最流行的碳青霉烯酶之一［2］。2001 年，研究人員首次從土耳其肺炎克雷伯菌的分離物中鑒定出產(chǎn)生OXA-48 的腸桿菌［3］，blaOXA-48基因在多種致病性革蘭陰性菌中均可檢測到，包括肺炎克雷伯菌、E.coli、鮑曼不動桿菌等。blaOXA-48基因通常位于質(zhì)?；蛘先旧w中可高度傳播的移動遺傳元件上。質(zhì)粒的有效水平轉(zhuǎn)移可將blaOXA-48基因轉(zhuǎn)移至毒力及適應(yīng)性更強的菌株中，導(dǎo)致攜帶OXA-48的細(xì)菌具有更廣泛的抗藥性及更強的傳播性［4-5］。

在組織損傷誘導(dǎo)與修復(fù)的炎性反應(yīng)中，Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）能起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，TLRs 介導(dǎo)的信號通路可幫助機(jī)體抵抗病原菌的侵襲。機(jī)體先天性免疫應(yīng)答在TLRs 的作用下被激活并介導(dǎo)炎性反應(yīng)，進(jìn)而殺滅侵入機(jī)體的病原微生物，得以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［6-7］。據(jù)文獻(xiàn)報道，缺失TLR2和髓系分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）基因的小鼠對金黃色葡萄球菌敏感，表明TLRs 信號通路對機(jī)體抵抗細(xì)菌的侵害可能發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。迄今為止，國內(nèi)外尚無TLRs 介導(dǎo)的信號通路與表達(dá)OXA-48 腸桿菌科細(xì)菌所致感染性的報道。本研究采用多種方法評價過表達(dá)OXA-48對E.coli耐藥性、適應(yīng)性及小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中TLRs 通路的影響，以期為TLRs 介導(dǎo)的信號通路在碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌感染過程中作用機(jī)制的深入研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、質(zhì)粒及菌株 小鼠肺泡巨噬細(xì)胞系MH-S購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；質(zhì)粒pET32a（+）-OXA-48及陰性菌株pET32a（+）-BL21（DE3）均購自南京金斯瑞生物科技有限公司；感受態(tài)E.coliBL21（DE3）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2主要試劑 LB液體培養(yǎng)基、Mueller-hintot（MH）瓊脂平板、亞胺培南（Imipenem，IPM）、美羅培南（Meropenem，MEM）、頭孢曲松（Ceftriaxone，CRO）、頭孢吡肟（Cefepime，F(xiàn)EP）藥敏紙片及IPTG均購自北京索萊寶生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-10 ELISA試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ購自日本TaKaRa公司。

1.3重組菌株的構(gòu)建 將質(zhì)粒pET32a（+）-OXA-48轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliBL21（DE3）中，37 ℃孵育過夜；挑取單菌落，用通用引物（正向：5'-ATTACGGAATGCCTGGGTAGC-3'，反向：5'-TCATCCTTAACCACGCCCAAATCG-3'）進(jìn)行菌落PCR 鑒定，以陰性菌株pET32a（+）-BL21（DE3）為對照，并將鑒定正確的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，篩選含有blaOXA-48基因的重組菌株，命名為pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）。

1.4誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 將重組菌pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）接種于含Amp（100μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜；當(dāng)A600達(dá)一定數(shù)值時，加入IPTG，于37 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)，收集菌體，進(jìn)行10% SDSPAGE 分析。并通過qRT-PCR 法檢測blaOXA-48基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，以A600、IPTG終濃度及誘導(dǎo)時間為變量，mRNA轉(zhuǎn)錄水平為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平正交試驗，優(yōu)化質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)，試驗設(shè)計見表1。以未誘導(dǎo)的pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）為對照。

表1 3因素3水平正交試驗條件Tab.1 Conditions of orthogonal test with three factors and three levels

1.5過表達(dá)OXA-48對菌株耐藥性影響的檢測 采用紙片擴(kuò)散法。將重組菌株pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）接種至LB平板上，于37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，以最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，7 000×g離心5 min，收集菌體，用無菌生理鹽水按不同A600進(jìn)行倍比稀釋（記為A1、A2、A3），用酶標(biāo)儀檢測A600，每個A600均設(shè)相應(yīng)陰性菌株pET32a（+）-BL21（DE3）對照（記為N1、N2、N3），涂布于MH平板上，10 min內(nèi)貼上IPM、MEM、CRO、FEP藥敏紙片，于37 ℃培養(yǎng)12~16 h，測量抑菌圈。試驗重復(fù)3次。

1.6過表達(dá)OXA-48對菌株適應(yīng)性影響的檢測

1.6.1生物膜形成試驗 將pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）、pET32a（+）-BL21（DE3）及E.coliBL21（DE3）按1∶100的體積分?jǐn)?shù)接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃孵育至A600達(dá)0.5。轉(zhuǎn)移至96孔板中，200μL／孔，同時設(shè)陰性對照（LB液體培養(yǎng)基），37 ℃孵育24 h；用0.01 mol／L 磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，加入1%結(jié)晶紫染色，200μL／孔，室溫染色20 min；干燥后，加入95%乙醇溶解結(jié)合染料，200μL／孔，用酶標(biāo)儀檢測A600。試驗重復(fù)3次。

1.6.2血清抵抗力試驗 同1.6.1 項將3 種菌液培養(yǎng)至A600為0.5時，取1 mL培養(yǎng)物，7 000×g離心5 min，取沉淀，用0.01 mol／L磷酸鹽緩沖液重懸，取100μL與含20%血清的900μL PBS混合，于37 ℃振蕩孵育3 h；均勻涂布于瓊脂平板上，37 ℃孵育過夜；統(tǒng)計活菌數(shù)量。以熱滅活的正常血清作為對照，驗證滅菌效果。以正常血清中的CFU與細(xì)菌懸浮液中CFU的比值作為存活率。試驗重復(fù)3次。

1.7過表達(dá)OXA-48 對宿主細(xì)胞TLRs 信號通路影響的檢測 根據(jù)GenBank中登錄的TLR2（NG_016229）、TLR4（NG_011475）、NF-κB（P65）（NG_029971）、GAPDH（NG_007073）基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，引物序列見表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。將MH-S 細(xì)胞按1×106個／孔接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)至密度達(dá)80%，將pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）、pET32a（+）-BL21（DE3）和E.coliBL21（DE3）分別接種至LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期，采用最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，PBS洗滌3次；按MOI=50感染MH-S細(xì)胞，同時設(shè)正常細(xì)胞組，每組設(shè)3個復(fù)孔，感染6、12和24 h；棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃30 s，60 ℃20 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因拷貝數(shù)。各時間點每個樣品重復(fù)檢測3次。

表2 用于qRT-PCR的引物序列Tab.2 Primer sequences of qRT-PCR

1.8過表達(dá)OXA-48 對宿主細(xì)胞炎性因子水平影響的檢測 按1.7 項方法將pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）、pET32a（+）-BL21（DE3）和E.coliBL21（DE3）感染MH-S 細(xì)胞6、12 和24 h，收集上清液，采用相應(yīng)ELISA試劑盒檢測IL-6、TNF-α、TGF-β和IL-10的水平。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1重組菌的鑒定 重組菌pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見224 bp的目的條帶，大小與預(yù)期一致，陰性菌株未見該條帶，見圖1。測序結(jié)果表明，目的基因序列與blaOXA-48基因一致，見圖2。證明重組菌構(gòu)建正確。

圖1 重組菌pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）的菌落PCR鑒定Fig.1 ColonyPCRidentificationofrecombinantstrainpET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）

圖2 重組菌pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）一代測序的部分結(jié)果Fig.2 Partial results of first generation sequencing of recombinant strain pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）

2.2最佳誘導(dǎo)條件 不同誘導(dǎo)條件下均可表達(dá)OXA-48，于相對分子質(zhì)量約48 000 處可見目的蛋白，大小與預(yù)期相符。與陰性菌株比較，不同誘導(dǎo)條件下blaOXA-48基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯升高（t=4.70～32.30，P均<0.05），其中，A600為0.3，IPTG終濃度為0.6 mmol／L，誘導(dǎo)2 h時表達(dá)量最高，因此確定該條件為最佳誘導(dǎo)條件。見圖3和圖4。

圖3 不同誘導(dǎo)條件下OXA-48蛋白的表達(dá)情況Fig.3 Expression of OXA-48 protein under different induction conditions

圖4 不同誘導(dǎo)條件下blaOXA-48基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 mRNA expression level of blaOXA-48 gene under different induction conditions

2.3過表達(dá)OXA-48 對菌株耐藥性的影響 在不同A600下，重組菌pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）對IPM、MEM、CRO和FEP 4種抗生素均表現(xiàn)出耐藥性，但明顯低于陰性菌株（t=7.14～22.32，P均<0.05）。見表3。

表3 重組菌pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）對4種抗生素的耐藥性（抑菌圈，mm±s，n=3）Tab.3 Resistance of recombinant strain pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）to four antibiotics（inhibition zone，mm，x ± s，n=3）

表3 重組菌pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）對4種抗生素的耐藥性（抑菌圈，mm±s，n=3）Tab.3 Resistance of recombinant strain pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）to four antibiotics（inhibition zone，mm，x ± s，n=3）

注：a表示與陰性菌株比較，P<0.05。

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2.4過表達(dá)OXA-48對菌株適應(yīng)性的影響

2.4.1生物膜形成試驗E.coli BL21（DE3）、pET32a（+）-BL21（DE3）及pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）菌株的A600分別為（0.19±0.02）、（0.26±0.02）、（0.45±0.02）。pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）菌株形成的生物膜明顯多于pET32a（+）-BL21（DE3）菌株（t=15.69，P<0.05）。

2.4.2血清抵抗力試驗E.coliBL21（DE3）、pET32a（+）-BL21（DE3）及pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）菌株在血清中的存活率分別為（19.66 ± 0.77）%、（16.76 ± 0.68）%、（35.24 ± 2.43）%。pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）菌株在血清中的存活率顯著高于pET32a（+）-BL21（DE3）菌株（t=10.60，P<0.05）。

2.5過表達(dá)OXA-48 對宿主細(xì)胞TLRs 信號通路的影響與正常細(xì)胞組比較，pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）組TLR2表達(dá)量于感染6、12和24 h持續(xù)升高，且于24 h 時，明顯高于pET32a（+）-BL21（DE3）組（t=5.77，P <0.05）；感染12 和24 h 時，pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）組TLR4及NF-кB（p65）的表達(dá)量明顯高于正常細(xì)胞組及pET32a（+）-BL21（DE3）組（t=3.71～10.06，P均<0.05）。見圖5。

圖5 宿主細(xì)胞中TLR2（A）、TLR4（B）和NF-кB（p65）（C）基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 Transcription levels of TLR2（A），TLR4（B）and NFкB（p65）（C）mRNA in host cells

2.6過表達(dá)OXA-48 對宿主細(xì)胞中炎性因子表達(dá)水平的影響 感染6、12和24 h時，pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）組IL-6 的表達(dá)水平顯著高于正常細(xì)胞組（t=7.90～13.44，P均<0.05），且感染12及24 h時，明顯高于pET32a（+）-BL21（DE3）組（t分別為2.92和3.79，P均<0.05）；與正常細(xì)胞組比較，pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）組TNF-α的表達(dá)水平顯著升高（t=5.40 ～6.32，P均<0.01），IL-10 表達(dá)水平均顯著下降（t=3.15～4.08，P均<0.05），TGF-β的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.013 ～1.41，P均>0.05）。見圖6。

圖6 宿主細(xì)胞中IL-6（A）、IL-10（B）、TNF-α（C）和TGF-β（D）的表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of IL-6（A）、IL-10（B）、TNF-α（C）and TGF-β（D）in host cells

3 討論

本研究將含有blaOXA-48基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）誘導(dǎo)表達(dá)，重組菌對IPM、MEM、CRO 和FEP 4種抗生素的耐藥性增加。在適應(yīng)性方面，OXA-48過表達(dá)菌株生物膜形成顯著增加（P<0.05），且在體外血清中存活率顯著增強（P<0.05）。但由于質(zhì)粒之間存在差異，攜帶碳青霉烯酶基因質(zhì)粒的適應(yīng)性和耐藥性的協(xié)同作用不能一概而論［9］。這些數(shù)據(jù)表明，即使在無抗生素壓力的情況下，產(chǎn)生碳青霉烯酶的革蘭陰性病原菌也可能傳播，并可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的感染，表明制定多種針對抗菌藥物耐藥性的策略是十分必要的［10］。

宿主細(xì)胞TLRs與病原菌的相互作用可活化NF-κB，并分泌大量炎性因子，進(jìn)而觸發(fā)固有免疫反應(yīng)［11］。TLRs 激活相關(guān)信號酶的介導(dǎo)途徑主要分為依賴MYD88 途徑和非依賴MYD88 途徑［12］。TLRs 通路活化可誘導(dǎo)炎性因子轉(zhuǎn)錄，上調(diào)NF-кB、MAPK 等炎性因子的表達(dá)，激活自然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)，從而調(diào)節(jié)各種免疫及炎性介質(zhì)的基因表達(dá)，以達(dá)到對病原體及感染細(xì)胞的清除作用［13-15］。在腸桿菌科細(xì)菌細(xì)胞壁成分中，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為效果最強的一種免疫刺激劑，可被TLR4識別并活化其下游的信號傳導(dǎo)途徑［16］。與LPS 的機(jī)制類似，在免疫和炎性反應(yīng)過程中，其細(xì)胞脂蛋白（braunlipoprotein，BLP）的脂類成分也起到了關(guān)鍵作用。經(jīng)相關(guān)研究證實，作為E.coli外膜最豐富成分之—的BLP，可經(jīng)TLR2 介導(dǎo)機(jī)體炎性應(yīng)答［17］。因此，TLR2和TLR4在E.coli侵染誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用，而在攜帶OXA-48的腸桿菌科細(xì)菌感染中，TLRs 介導(dǎo)信號通路的作用目前尚未見報道。因此，本研究檢測了細(xì)菌特異性識別受體TLR2、TLR4和NF-кB（p65）基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平及細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β、IL-6 和IL-10 的表達(dá)水平，初步評價過表達(dá)OXA-48 對E.coliBL21（DE3）宿主細(xì)胞TLRs信號通路的影響，結(jié)果顯示，pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）與pET32a（+）-BL21（DE3）組比較，感染6 及12 h 時，TLR2基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著增加（P< 0.05）；感染12 和24 h 時，TLR4及NF-кB（p65）基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量顯著增加（P<0.05），表明此時TLR2 和TLR4 可識別pET32a（+）-OXA48-BL21（DE3）菌株，結(jié)合MYD88 后調(diào)節(jié)機(jī)體免疫通路的變化，同時，pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）組下游細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)水平顯著高于對照組及pET32a（+）-BL21（DE3）組（P<0.05）。提示pET32a（+）-OXA48-BL21（DE3）可能通過TLRs途徑誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)。

耐藥基因blaOXA-48的過表達(dá)使細(xì)菌耐藥性和適應(yīng)性產(chǎn)生變化，同時影響宿主細(xì)胞TLRs 信號通路及下游細(xì)胞因子的表達(dá)水平。YIN 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，blaMCR-3基因的表達(dá)使細(xì)菌耐藥性增強，同時通過逃逸宿主巨噬細(xì)胞的吞噬可增強耐藥菌的致病性。另有研究對新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1基因（New Delhi metallobeta-lactamase-1,N，NDM-1)過表達(dá)菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析并探討其差異基因表達(dá)，結(jié)果表明，blaNDM-1基因在E.coliBL21（DE3）中的表達(dá)能調(diào)控許多編碼轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)，進(jìn)而對細(xì)菌的耐藥性與代謝產(chǎn)生影響［19］。目前，OXA-48對于細(xì)菌的作用及pET32a（+）-OXA-48-BL21（DE3）激活宿主細(xì)胞TLRs 信號通路的具體機(jī)制尚未明確，今后將進(jìn)一步深入研究OXA-48對E.coliBL21（DE3）耐藥性和代謝的影響。