朱艷慧，楊芳芳，王鑫，邢雅玲，劉雅琳

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州450046；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津301617；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850

流感分為季節(jié)性流感和大流行流感，對(duì)公共衛(wèi)生和全球經(jīng)濟(jì)造成了巨大影響［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）報(bào)道，全球每年約有10 億病例，其中300 萬(wàn)~500 萬(wàn)為重癥病例，導(dǎo)致29 萬(wàn)~65 萬(wàn)與流感相關(guān)的呼吸道疾病死亡病例［2］。流感病毒需要宿主細(xì)胞來(lái)支持其基因組復(fù)制和新病毒粒子產(chǎn)生，深入了解病毒與宿主細(xì)胞間的相互作用關(guān)系有助于防治流感［3］。

天然免疫系統(tǒng)為病毒感染提供了最初的屏障，啟動(dòng)了一系列信號(hào)通路和傳感器檢測(cè)和清除入侵的病毒。模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）通過(guò)識(shí)別病毒和細(xì)菌產(chǎn)生的保守病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）觸發(fā)天然免疫反應(yīng)［4］。根據(jù)病毒復(fù)制的位置和病毒核酸的細(xì)胞定位，不同類(lèi)型的PRR 參與天然免疫識(shí)別，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素（typeⅠinterferon）發(fā)揮抗病毒作用［5］。維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（retinoic acidinducible geneⅠ，RIG-Ⅰ）是細(xì)胞質(zhì)中關(guān)鍵的RNA傳感器之一。攜帶負(fù)極性或正極性單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA）、雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）或DNA 基因組的病毒均可產(chǎn)生RIG-Ⅰ能識(shí)別的特定RNA 種類(lèi)［6］。流感病毒復(fù)制周期中dsRNA 和ssRNA的結(jié)構(gòu)域均是RIG-Ⅰ的重要激活因子［7-8］。

LRRC23（leucine rich repeat containing 23）也稱(chēng)為L(zhǎng)RPB7，包含富亮氨酸重復(fù)（leucine rich repeat，LRR）序列、核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS）和亮氨酸拉鏈序列（consensus L-X［6］-L-x［6］-LX［6］-L）結(jié)構(gòu)，存在兩種異構(gòu)體isoform 1 和isoform 2，均含有3 個(gè)LRR 序列［9］。在植物和動(dòng)物中，蛋白通過(guò)特定的NLS靶向于細(xì)胞核［10］。亮氨酸拉鏈序列存在于許多基因調(diào)控蛋白中，如Jun／AP1 轉(zhuǎn)錄因子家族和cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白［11-13］。LRRC23 蛋白結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)定位與參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄的其他蛋白類(lèi)似（如SMAD、p38MAPK 和STAT）［14-16］，可能具有多種功能。據(jù)報(bào)道，LRRC25 與LRRC59 均可通過(guò)調(diào)控RIG-Ⅰ介導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達(dá)參與病毒感染［17-18］，而LRRC23 在病毒感染過(guò)程中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期通過(guò)對(duì)流感病毒感染小鼠肺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選到差異表達(dá)基因LRRC23、LRRC25和LRRC59。

本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)和敲低LRRC23，探討其對(duì)流感病毒感染的A549 細(xì)胞中RIG-Ⅰ表達(dá)及病毒復(fù)制的影響，為抗病毒天然免疫機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒、病毒及細(xì)胞 質(zhì)粒pcLRRC23、pcLRRC25、pcLRRC59 和空白質(zhì)粒pcDNA3.1（+）購(gòu)自山東維真生物技術(shù)有限公司；siLRRC23（small interfering LRRC23）1#、2#和3#及陰性對(duì)照siRNA 購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；Myc-LRRC23 和Flag-RIG-Ⅰ購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；pIFN-β-luc報(bào)告質(zhì)粒、pNF-κB-luc 報(bào)告質(zhì)粒和pRL-TK 內(nèi)參質(zhì)粒為輻射醫(yī)學(xué)研究所二所六室保存，病毒及細(xì)胞也由該室保存，其中A／京防／1／86（H1N1）使用SPF 級(jí)雞胚擴(kuò)增，感染A549 細(xì)胞時(shí)，用含0.2% BSA 和雙抗的F12K 培養(yǎng)基培養(yǎng)；A549細(xì)胞和MDCK 細(xì)胞分別用含10%胎牛血清、100 U／mL 青霉素、100μg／mL 鏈霉素的F12K 和DMEM 完全培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基、OPTI-MEM 培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000 Reagent 和RNAiMAX 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；2×DMEM、F12K 培養(yǎng)基和0.25%胰酶-EDTA 購(gòu)自中科邁晨科技有限公司；雙抗（青霉素、鏈霉素）購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；血清購(gòu)自德國(guó)SERA公司；流感H1N1 HA ELISA Kit（Cat：KIT11055）和HA 兔源單克隆抗體（Cat：86001-RM01）購(gòu)自北京義翹神州科技有限公司；LRRC23 兔源多克隆抗體（Cat：ab151249）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；β-actin 鼠源單克隆抗體（Cat：66009-1-Ig）、RIG-Ⅰ兔源多克隆抗體（Cat：20566-1-AP）、MAVS 兔源多克隆抗體（Cat：14341-1-AP）、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（Cat：SA00-001-1）、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（Cat：SA00001-2）、anti-Myc 兔源多克隆抗體（Cat：16286-1-AP）、anti-Flag 鼠源單克隆抗體（Cat：66008-3-Ig）、山羊抗兔CoraLite-488（Cat：SA00013-2）、山羊抗鼠CoraLite594（Cat：SA00013-3）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；anti-Myc 鼠源單克隆抗體（Cat：M192-3）購(gòu)自日本MBL 公司；RIPA 裂解液（Cat：P0013B）、DAPI 染色液（Cat：C1005）、蛋白A + G 瓊脂糖珠（Cat：P2012）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒（Promega）（Cat：E1910）購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司；NP-40 裂解液（Cat：N8031）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3過(guò)表達(dá)LRRC23 對(duì)A549 細(xì)胞中流感病毒復(fù)制能力影響的檢測(cè)

1.3.1細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將A549 細(xì)胞接種6 孔板約24 h，待細(xì)胞匯合至70%時(shí)，分為正常細(xì)胞對(duì)照組（normal control，NC）、病毒組（virus control，VC）、過(guò)表達(dá)LRRC23 組（LRRC23），分別使用Lipofecta-mine 2000 Reagent 轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pcDNA3.1（+）或質(zhì)粒pcLRRC23，轉(zhuǎn)染后6 h 換液，24 h 后以0.1 MOI 感染流感病毒，分別在感染24 和48 h 收集細(xì)胞上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆茫⑻崛〖?xì)胞總RNA和總蛋白。

1.3.2空斑試驗(yàn) 將MDCK細(xì)胞按（15~20）×104個(gè)／孔接種24 孔板，24 h 后待細(xì)胞覆蓋率達(dá)100%時(shí)，棄去24 孔板中完全培養(yǎng)基，PBS 洗滌細(xì)胞3 次，加入病毒稀釋液［用DMEM 將凍存的細(xì)胞上清液10 倍梯度稀釋?zhuān)?0-1~10-3）］，200μL／孔，NC組細(xì)胞加入等量維持液，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1 h；棄掉24 孔板中病毒液，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入營(yíng)養(yǎng)覆蓋物（含0.3%BSA、1.5% TPCK-胰酶、20μL 雙抗、1 mL 2×DMEM 培養(yǎng)液，以上成分混勻后與1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖按1∶1比例混勻），0.5 mL／孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 ~50 h。顯微鏡下觀察出斑情況，當(dāng)噬斑直徑較大時(shí)，加入4%甲醛，300μL／孔，固定1 h；棄掉甲醛及營(yíng)養(yǎng)覆蓋物，自來(lái)水洗滌，加入0.1%結(jié)晶紫，300μL／孔，染色1 h；自來(lái)水洗滌，晾干，觀察并記錄24孔板中每孔的噬斑數(shù)［19］。

1.3.3ELISA 試驗(yàn) 將凍存的細(xì)胞上清液冰上解凍，取25μL樣品，加入75μL PBS稀釋4倍，制成100μL樣品稀釋液，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)上清中流感病毒HA 蛋白表達(dá)，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)A值。

1.4過(guò)表達(dá)LRRC23 對(duì)流感病毒感染后A549 細(xì)胞mRNA 轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測(cè) 登錄NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）查找Gene ID，在PrimerBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／pga.mgh.harvard.edu／primerbank／）中輸入Gene ID 查找基因引物后，合成基因引物，引物序列見(jiàn)表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用TRIzol試劑提取A549細(xì)胞（分組同1.3.1 項(xiàng)）總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，加入引物，使用SYBR Green 法熒光定量PCR 檢測(cè)基因表達(dá)變化。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

表1 qRT-PCR試驗(yàn)中基因擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.5過(guò)表達(dá)LRRC23、LRRC25、LRRC59 對(duì)流感病毒感染后A549細(xì)胞RIG-Ⅰ信號(hào)通路影響的檢測(cè)采用Western blot 法。將A549 細(xì)胞接種6 孔板約24 h，待細(xì)胞匯合至70%時(shí)，分為NC 組、VC 組、pcLRRC23組、pcLRRC23 + 病毒組、pcLRRC25 組、pcLRRC25 +病毒組、pcLRRC59 組、pcLRRC59 + 病毒組共8 組，分別用Lipofectamine 2000 Reagent 轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pcDNA3.1（+）或質(zhì)粒pcLRRC23、pcLRRC25、pcLRRC59，轉(zhuǎn)染后6 h 換液，24 h 后以0.1 MOI 感染流感病毒，感染48 h 使用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)10% SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入RIG-Ⅰ兔源多克隆抗體（1∶1 000 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜或β-actin 鼠源單克隆抗體（1∶10 000稀釋?zhuān)┦覝胤跤?.5 h；加入山羊抗兔IgG 或HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（均1∶5 000稀釋?zhuān)?，室溫孵?.5 h；ECL法顯色后拍照。

1.6過(guò)表達(dá)LRRC23 對(duì)流感病毒感染后A549 細(xì)胞RIG-Ⅰ信號(hào)通路影響的檢測(cè)

1.6.1免疫熒光試驗(yàn) 將A549細(xì)胞按約5×104個(gè)接種激光共聚焦小皿，Myc-LRRC23 和Flag-RIG-Ⅰ共轉(zhuǎn)染或Myc-LRRC23／Flag-RIG-Ⅰ單獨(dú)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后24 h 以0.1 MOI 感染流感病毒；24 h 后棄掉培養(yǎng)基，免疫染色固定液室溫固定20 min；免疫染色通透液室溫通透10 min；QuickBlockTM免疫染色封閉液室溫封閉30 min；加入anti-Myc兔源多克隆抗體（1∶100 稀釋?zhuān)?、anti-Flag 鼠源單克隆抗體（1∶500 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜；加入山羊抗兔CoraLite-488、山羊抗鼠CoraLite594（均1∶500 稀釋?zhuān)?7 ℃避光孵育1 h；DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.6.2免疫共沉淀試驗(yàn)（co-immunoprecipitation，Co-IP） 將A549 細(xì)胞接種10 cm 平皿，培養(yǎng)24 h；Myc-LRRC23和Flag-RIG-Ⅰ共轉(zhuǎn)染或Myc-LRRC23／Flag-RIG-Ⅰ單獨(dú)轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后6 h 換液；轉(zhuǎn)染后24 h 以0.1 MOI 感染流感病毒；24 h 后棄掉培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，加入NP-40 裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF，提取總蛋白，部分用于Western blot 分析Myc-LRRC23、Flag-RIG-Ⅰ和β-actin 表達(dá)，其余用于Co-IP分析Myc-LRRC23 和Flag-RIG-Ⅰ表達(dá)。500μL 總蛋白溶液中加入Protein A／G 瓊脂糖珠30 μL，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育2 h進(jìn)行預(yù)清除；離心后取上清，加入anti-Myc兔源多克隆抗體3μL，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育6 h；加入Protein A／G瓊脂糖珠50μL，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜；離心，洗滌瓊脂糖珠，得到50μL沉淀，加入50μL 2×上樣緩沖液，煮沸10 min 后離心，取上清進(jìn)行Co-IP 分析：經(jīng)10% SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入anti-Myc 鼠源單克隆抗體（1∶10 000 稀釋?zhuān)┖蚢nti-Flag 鼠源單克隆抗體（1∶2 000 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，或β-actin 鼠源單克隆抗體（1∶10 000稀釋?zhuān)┦覝胤跤?.5 h；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋?zhuān)?，室溫孵?.5 h；ECL法顯色后拍照。

1.6.3Western blot 分析 將A549 細(xì)胞接種6 孔板約24 h；待細(xì)胞匯合至70%時(shí)，分為3 組：NC 組、VC 組、LRRC23 組，使用Lipofectamine 2000 Reagent 分別轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pcDNA3.1（+）或質(zhì)粒pcLRRC23，轉(zhuǎn)染后6 h 換液；24 h 后以0.1 MOI 感染流感病毒，感染24和48 h 用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)細(xì)胞中LRRC23、RIG-Ⅰ、MAVS及流感病毒HA蛋白的表達(dá)：經(jīng)10%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入LRRC23 兔源多克隆抗體、RIG-Ⅰ兔源多克隆抗體、MAVS兔源多克隆抗體、HA兔源單克隆抗體（均1∶1 000 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜或β-actin 鼠源單克隆抗體（1∶10 000 稀釋?zhuān)┦覝胤跤?.5 h；加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG（均1∶5 000稀釋?zhuān)?，室溫孵?.5 h；ECL法顯色后拍照。

1.6.4雙熒光素酶報(bào)告基因分析試驗(yàn) 將A549細(xì)胞接種24 孔板約24 h；待細(xì)胞匯合至70%時(shí)，分為NC組、VC 組、LRRC23 組，LRRC23 組使用Lipofectamine 2000 Reagent分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcLRRC23、pRL-TK、pIFNβ-Luc或pNF-κB-Luc，NC組、VC組分別轉(zhuǎn)染pRL-TK、pIFN-β-Luc或pNF-κB-Luc，轉(zhuǎn)染后6 h換液；轉(zhuǎn)染24 h后以0.1 MOI 感染流感病毒，感染24 h，檢測(cè)上清中螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度，具體操作按雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒（Promega）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7敲低LRRC23 對(duì)A549 細(xì)胞中流感病毒復(fù)制能力影響的檢測(cè)

1.7.1細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將A549 細(xì)胞接種6 孔板約24 h；待細(xì)胞匯合至30%時(shí)，進(jìn)行分組。對(duì)于Western blot檢測(cè)3對(duì)siLRRC23沉默效果試驗(yàn)，分為5組：NC 組、陰性對(duì)照siRNA組（siRNA）及siLRRC231#、siLRRC232#、siLRRC233#組；對(duì)于ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中流感病毒HA 蛋白表達(dá)和qRT-PCR 檢測(cè)基因mRNA 表達(dá)試驗(yàn)，分為4組：NC組、VC組及siLR-RC231#、siLRRC233#組。使用RNAiMAX分別轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)照或siLRRC231#、siLRRC232#、siLRRC233#，轉(zhuǎn)染后6 h 換液；24 h 后以0.1 MOI 感染流感病毒；48 h 后收集細(xì)胞上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2Western blot 分析 使用RIPA 裂解液提取總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入LRRC23 兔源多克隆抗體（1∶1 000 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜或β-actin 鼠源單克隆抗體（1∶10 000 稀釋?zhuān)┦覝胤跤?.5 h；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 或山羊抗兔IgG（均1∶5 000 稀釋?zhuān)?，室溫孵?.5 h；ECL法顯色后拍照。

1.7.3ELISA 試驗(yàn) 將凍存的細(xì)胞上清液冰上解凍，取25μL 樣品加入75μL PBS 稀釋4 倍，制成100μL樣品稀釋液，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)上清中流感病毒HA 蛋白表達(dá)，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)A值。

1.7.4qRT-PCR試驗(yàn) 使用TRIzol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，加入引物（同1.4項(xiàng)），使用SYBR Green 法熒光定量PCR 檢測(cè)基因表達(dá)變化。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每個(gè)試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x ± SD）表示，所用圖表均使用GraphPad Prism version 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，檢驗(yàn)方法為單因素方差分析（one-way ANOVA）或雙因素方差分析（two-way ANOVA），以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1過(guò)表達(dá)LRRC23 對(duì)A549 細(xì)胞中流感病毒復(fù)制的影響

2.1.1空斑試驗(yàn) 流感病毒感染A549 細(xì)胞后，細(xì)胞上清中病毒空斑形成數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，與VC 組相比，LRRC23 組病毒空斑形成數(shù)量明顯減少，見(jiàn)圖1。病毒感染24 h，VC 組與LRRC23 組細(xì)胞上清中流感病毒滴度分別為1.67 × 103和8.33 ×102PFU／mL；病毒感染48 h，兩組病毒滴度分別為1.43 × 104和7.00 × 103PFU／mL。與VC 組相比，LRRC23 組在病毒感染48 h 可顯著降低細(xì)胞上清中流感病毒滴度（F=328.2，P<0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 空斑試驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞上清中流感病毒滴度Fig.1 Plaque assay of influenza virus titer in supernatant of A549 cells

圖2 A549細(xì)胞上清中流感病毒滴度統(tǒng)計(jì)分析Fig.2 Statistical analysis of influenza virus titer in supernatant of A549 cells

2.1.2ELISA 試驗(yàn) 病毒感染24 h，VC 組與LRRC23 組細(xì)胞上清中HA 蛋白表達(dá)量分別為（966.95±10.03）和（710.76±24.63）pg／mL；病毒感染48 h，兩組HA 蛋白表達(dá)量分別為（3 081.24 ± 100.34）和（1 439.33±12.88）pg／mL。與VC 組相比，過(guò)表達(dá)LRRC23可在病毒感染24和48 h顯著抑制A549細(xì)胞上清中HA蛋白表達(dá)（F=2 216，P<0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 ELISA 法檢測(cè)A549細(xì)胞上清中流感病毒HA 蛋白表達(dá)量Fig.3 ELISA of expression level of influenza virus HA protein in supernatant of A549 cells

2.2過(guò)表達(dá)LRRC23 對(duì)流感病毒感染后A549 細(xì)胞中mRNA 表達(dá)的影響 與NC 組相比，病毒感染后，VC 組LRRC23mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低，與VC 組相比，LRRC23 組LRRC23mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著升高（F=1017，P<0.05），見(jiàn)圖4A。與NC 組相比，VC 組RIG-ⅠmRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著升高（F =1 177，P <0.05），與VC 組相比，LRRC23 組RIG-ⅠmRNA 相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步提高，見(jiàn)圖4B。與NC組相比，VC組和LRRC23 組MAVSmRNA 相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，見(jiàn)圖4C。與NC 組相比，A549細(xì)胞中流感病毒M1基因表達(dá)量隨感染時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，與VC 組相比，過(guò)表達(dá)LRRC23 顯著抑制病毒感染24 和48 h 流感病毒M1基因相對(duì)表達(dá)量（F=6 240，P<0.05），見(jiàn)圖4D。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)LRRC23 上調(diào)病毒感染A549細(xì)胞中RIG-ⅠmRNA 和MAVSmRNA 相對(duì)表達(dá)量，下調(diào)流感病毒M1基因相對(duì)表達(dá)量。

2.3過(guò)表達(dá)LRRC23、LRRC25、LRRC59 對(duì)流感病毒感染后A549 細(xì)胞RIG-Ⅰ信號(hào)通路的影響 與NC組相比，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染LRRC23、LRRC25和LRRC59質(zhì)粒后均可刺激RIG-Ⅰ表達(dá)。經(jīng)流感病毒處理后，與VC 組相比，過(guò)表達(dá)LRRC23 和LRRC59 進(jìn)一步上調(diào)RIG-Ⅰ蛋白表達(dá)；過(guò)表達(dá)LRRC25 下調(diào)了RIG-Ⅰ蛋白表達(dá)。表明流感病毒感染后，LRRC25 抑制了RIG-Ⅰ蛋白的表達(dá)，LRRC59 和LRRC23 促進(jìn)了RIG-Ⅰ蛋白的表達(dá)，提示LRRC25是RIG-Ⅰ介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子，而LRRC59 和LRRC23是正向調(diào)控因子。見(jiàn)圖5。

圖5 過(guò)表達(dá)LRRC23、LRRC25、LRRC59 對(duì)A549 細(xì)胞中RIG-Ⅰ表達(dá)的影響Fig.5 Effect of overexpressions of LRRC23，LRRC25 and LRRC59 on RIG-Ⅰprotein expression in A549 cells

2.4過(guò)表達(dá)LRRC23 對(duì)流感病毒感染后A549 細(xì)胞RIG-Ⅰ信號(hào)通路的影響

2.4.1免疫熒光試驗(yàn) 與Flag-RIG-Ⅰ轉(zhuǎn)染組相比，流感病毒處理后24 h，F(xiàn)lag-RIG-Ⅰ轉(zhuǎn)染+ 病毒組RIG-Ⅰ熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。與Myc-LRRC23+Flag-RIG-Ⅰ共轉(zhuǎn)染組相比，流感病毒處理使Myc-LRRC23+Flag-RIG-Ⅰ共轉(zhuǎn)染+病毒組RIG-Ⅰ熒光信號(hào)聚集在細(xì)胞核周?chē)?，?jiàn)圖6。表明流感病毒感染促使LRRC23進(jìn)入細(xì)胞核，LRRC23 與RIG-Ⅰ在細(xì)胞核周?chē)l(fā)生共定位。

圖6 免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)LRRC23和RIG-Ⅰ表達(dá)（×400）Fig.6 IFA of expressions of LRRC23 and RIG-Ⅰ（×400）

2.4.2Co-IP 試驗(yàn) Myc-LRRC23 與Flag-RIG-Ⅰ共轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞，未感染流感病毒組Flag-RIG-Ⅰ條帶較弱，而感染流感病毒組Flag-RIG-Ⅰ條帶明顯，表明流感病毒感染促進(jìn)LRRC23 與RIG-Ⅰ發(fā)生相互作用。見(jiàn)圖7。

圖7 Co-IP法檢測(cè)LRRC23與RIG-Ⅰ的相互作用Fig.7 Test for interaction of LRRC23 and RIG-Ⅰby Co-IP

2.4.3Western blot 分析 NC 組A549 細(xì)胞中RIG-Ⅰ蛋白表達(dá)較低，流感病毒感染24 和48 h，VC 組中RIG-Ⅰ蛋白表達(dá)逐漸升高，HA 蛋白表達(dá)明顯增加；與VC組相比，過(guò)表達(dá)LRRC23可促進(jìn)RIG-Ⅰ和MAVS蛋白表達(dá)，顯著抑制HA 蛋白表達(dá)。見(jiàn)圖8。表明過(guò)表達(dá)LRRC23 可通過(guò)激活RIG-Ⅰ信號(hào)通路抑制流感病毒復(fù)制。

圖8 Western blot法分析A549細(xì)胞中RIG-Ⅰ、MAVS、HA、LRRC23蛋白的表達(dá)Fig.8 Western blotting of expressions of RIG-Ⅰ，MAVS，HA and LRRC23 in A549 cells

2.4.4雙熒光素酶報(bào)告基因分析試驗(yàn) 流感病毒刺激后，VC 組IFN-β 熒光素酶活性與NC 組相比增加約5.7 倍；LRRC23 組IFN-β 熒光素酶活性與VC 組相比增加約1.8 倍（F =169.8，P <0.05），見(jiàn)圖9A，表明過(guò)表達(dá)LRRC23 可增強(qiáng)Ⅰ型干擾素的表達(dá)。流感病毒刺激后，VC 組NF-κB 熒光素酶活性與NC 組相比增加約2.9 倍；LRRC23 組NF-κB 熒光素酶活性與VC 組相比增加約1.9倍（F=84.95，P<0.05），見(jiàn)圖9B，表明過(guò)表達(dá)LRRC23 可能參與流感病毒刺激的NF-κB激活。以上結(jié)果提示，LRRC23是一個(gè)重要的RIG-Ⅰ信號(hào)通路正向調(diào)控因子，可抑制流感病毒復(fù)制。

圖9 雙熒光素酶報(bào)告基因分析試驗(yàn)檢測(cè)IFN-β-luc（A）和NF-κB-luc活性（B）Fig.9 Dual-luciferase reporter assay of activities of IFN-βluc（A）and NF-κB-luc（B）

2.5敲低LRRC23 對(duì)A549 細(xì)胞中流感病毒復(fù)制能力的影響

2.5.1Western blot分析 轉(zhuǎn)染后48 h，與NC組和siRNA組相比，siLRRC232#轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞后對(duì)LRRC23 蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響，而siLRRC231#和siLRRC233#抑制了LRRC23 蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖10。因此，選擇siLRRC231#和siLRRC233#敲低A549 細(xì)胞中LRRC23蛋白表達(dá)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。2.5.2ELISA 試驗(yàn) 病毒感染48 h，VC 組、siLRRC231#組、siLRRC233#組細(xì)胞上清中HA 蛋白表達(dá)量分別為（2 820.26±135.07）、（3 383.08±153.85）和（3 213.85±123.85）pg／mL；與VC組相比，siLRRC231#和siLRRC233#顯著增加了A549 細(xì)胞上清中HA 蛋白的表達(dá)（F=46 090，P<0.05）。見(jiàn)圖11。

圖10 Western blot 法分析siLRRC23 轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞中LRRC23蛋白的表達(dá)Fig.10 Western blotting of LRRC23 expression in A549 cells transfected with siLRRC23

圖11 ELISA法檢測(cè)siLRRC23轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞上清中流感病毒HA蛋白表達(dá)量Fig.11 ELISA of influenza virus HA expression in supernatant of A549 cells transfected with siLRRC23

2.5.3qRT-PCR 試驗(yàn) 與NC組相比，病毒感染48 h，VC 組LRRC23mRNA 相對(duì)表達(dá)量下降；與VC 組相比，siLRRC231#和siLRRC233#組LRRC23mRNA 相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步降低，下調(diào)了RIG-ⅠmRNA 和MAVSmRNA相對(duì)表達(dá)量（F分別為34.54和9.234，P<0.05），提高了流感病毒M1基因相對(duì)表達(dá)量（F =479.5，P<0.05）。見(jiàn)圖12。表明敲低LRRC23 促進(jìn)了流感病毒復(fù)制。

圖12 敲低LRRC23 對(duì)A549 細(xì)胞中LRRC23、RIG-Ⅰ、MAVS、M1 mRNA表達(dá)的影響Fig.12 Effect of LRRC23 knock-down on expressions of LRRC23，RIG-Ⅰ，MAVS and M1 mRNAs in A549 cells

3 討論

天然免疫是抵御病原體的主要防線。PRRs 識(shí)別多種微生物成分，然后迅速啟動(dòng)天然和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。流感病毒感染后至少可激活3類(lèi)PRRs：Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體［nucleotide binding and oligomerization domain（NOD）-like receptor，NLR］、維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體（RIG-Ⅰ-like receptor，RLR）［4-5］。除了漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞外，識(shí)別甲型流感病毒的天然免疫嚴(yán)格依賴(lài)于RIG-Ⅰ［20］。RIG-Ⅰ可從2個(gè)方面發(fā)揮抗流感病毒作用：①流感病毒感染后，RIG-Ⅰ與MAVS相互作用，促進(jìn)IRF3 激活轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生以及干擾素刺激因子（IFITM、Mx、PKR和OAS等）和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)；②RIG-Ⅰ通過(guò)與流感病毒核衣殼的5'ppp-dsRNA panhandle 結(jié)合，促進(jìn)病毒聚合酶復(fù)合物的解離，發(fā)揮直接抗病毒作用［21］。在甲型流感病毒復(fù)制周期中，細(xì)胞核中RIG-Ⅰ識(shí)別流感病毒核糖核蛋白復(fù)合物（virus ribonucleoprotein complex，vRNP），細(xì)胞質(zhì)RIG-Ⅰ在病毒感染后期優(yōu)先結(jié)合vRNPs44［22］。與panhandle RNA 結(jié)合的RIG-Ⅰ寡聚化是甲型流感病毒感染過(guò)程中MAVS 激活的主要機(jī)制［23-24］。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)RIG-Ⅰ被激活后在核膜上發(fā)生橋接實(shí)現(xiàn)寡聚化，進(jìn)而協(xié)同激活MAVS，觸發(fā)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和IFN-β，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生［8，25］。因此，RIG-Ⅰ受體在啟動(dòng)流感病毒感染的免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用，靶向RIG-Ⅰ信號(hào)通路有可能引起廣譜的抗病毒、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。

據(jù)報(bào)道，LRRC25 是RLR 介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，LRRC25特異性的與ISG15 相關(guān)的RIG-Ⅰ相結(jié)合，然后與p62 發(fā)生相互作用，通過(guò)選擇性自噬通路介導(dǎo)RIG-Ⅰ的降解，抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生［17］。XIAN等［18］進(jìn)一步補(bǔ)充了LRRC59是RIG-Ⅰ介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正向調(diào)控因子。在病毒感染時(shí)，LRRC59 特異性的與ISG15 相關(guān)的RIG-Ⅰ相互作用，并阻斷其與LRR-C25 的關(guān)聯(lián)。另外，LRRC25可負(fù)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，LRRC25的異常表達(dá)可抑制NF-κB激活；敲除LRR-C25激活NFκB 信號(hào)通路并促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)［26］。LRRC59參與了被微生物核酸所激活的TLRs 受體的過(guò)程，敲低LRRC59 降低了TLR3、TLR8 和TLR9 介導(dǎo)的信號(hào)通路，但對(duì)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路無(wú)影響［27］。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致，即LRRC25 抑制RIG-Ⅰ表達(dá)，LRRC59 促進(jìn)RIG-Ⅰ表達(dá)，同時(shí)LRRC23 上調(diào)了RIG-Ⅰ表達(dá)，推測(cè)其可能通過(guò)RIG-Ⅰ信號(hào)通路發(fā)揮抗病毒作用。

本研究首先通過(guò)過(guò)表達(dá)LRRC23，檢測(cè)其對(duì)流感病毒感染后A549 細(xì)胞中病毒復(fù)制的影響?？瞻咴囼?yàn)與ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)LRRC23可顯著降低A549 細(xì)胞上清中流感病毒滴度，抑制A549 細(xì)胞上清中HA 蛋白表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR 試驗(yàn)和Western blot 分析，過(guò)表達(dá)LRRC23 激活了RIG-Ⅰ-MAVS 信號(hào)通路，抑制了流感病毒M1基因和HA 蛋白表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因分析試驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)LRRC23可增強(qiáng)流感病毒刺激的IFN-β和NFκB 激活。另外，通過(guò)Co-IP 試驗(yàn)和免疫熒光試驗(yàn)揭示了流感病毒刺激促進(jìn)了LRRC23 與RIG-Ⅰ共定位發(fā)生相互作用，但二者如何發(fā)揮相互作用尚有待于進(jìn)一步研究。綜上所述，LRRC23是RIG-Ⅰ信號(hào)通路的正向調(diào)控因子，激活NF-κB，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素表達(dá)發(fā)揮抗流感病毒作用。

LRR 結(jié)構(gòu)域經(jīng)常出現(xiàn)在參與天然免疫和細(xì)胞進(jìn)程的多種蛋白中，如細(xì)胞凋亡、自噬和核mRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)。在哺乳動(dòng)物中，富含LRR 的蛋白質(zhì)家族成員已在天然免疫方面獲得較好的表征，如NLRs 和TLRs［28］。本研究豐富了含有LRR 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族成員LRRC23 對(duì)RIG-Ⅰ調(diào)控的整體認(rèn)識(shí)，為抗病毒感染提供了參考。