龍明望，王涵，張麗，賈凡，3，劉燕會(huì)，4，寧雪磊，4，陳俊英，潘玥，孫強(qiáng)明

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650118；2.云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650118；3.昆明醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650500；4.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650091

登革病毒（Dengue virus，DENV）屬于黃病毒科黃病毒屬的一類蟲(chóng)媒病毒［1］，由埃及伊蚊及白紋伊蚊叮咬進(jìn)行傳播，廣泛流行于熱帶及亞熱帶地區(qū)，每年全球約有4 億人感染［2］。DENV 是單正鏈RNA（+ssRNA）病毒，編碼3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、包膜蛋白E 和前膜蛋白PrM）和7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。DENV 根據(jù)其E 蛋白的抗原性可分為4個(gè)血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4），在初次感染或同型別感染時(shí)，通常只會(huì)引起較輕微的臨床癥狀；但在異型或同型病毒再次感染時(shí)，往往會(huì)誘發(fā)更為嚴(yán)重的臨床癥狀，如出血熱及低血容量休克綜合征等［3］。該現(xiàn)象被稱為抗體依賴性增強(qiáng)（antibody-dependent enhancement，ADE），是由HALSTEAD 等［4］于1973 年首次提出：在亞中和抗體滴度或交叉抗體存在時(shí)，病毒再次感染可通過(guò)細(xì)胞表面的FcγRⅡ介導(dǎo)，從而促進(jìn)病毒感染增強(qiáng)的現(xiàn)象。研究人員發(fā)現(xiàn)，該現(xiàn)象在多種病毒感染中均有發(fā)生，如寨卡病毒（Zika virus）［5］、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）［6］。

近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）在病毒感染過(guò)程中發(fā)揮著明顯的調(diào)控作用。如2018 年，JIANG 等［7］證實(shí)了多種RNA 病毒感染巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的LncRNAlnc-Lsm3b可通過(guò)與視黃酸誘導(dǎo)基因1（retinoic acid inducible gene-1，RIG-1）結(jié)合，調(diào)控Ⅰ型干擾素的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)病毒的感染進(jìn)程；牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）感染牛腎細(xì)胞（bovine kidney cells，MDBK）后，介導(dǎo)了許多LncRNAs的差異性表達(dá)，并且通過(guò)功能性富集分析，證實(shí)了這些差異性LncRNAs 主要調(diào)控了免疫應(yīng)答的改變［8］。在HIV-1 感染CD4+T 細(xì)胞中，LncRNA MALAT1 通過(guò)直接與轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物PCR2結(jié)合，從而解除對(duì)啟動(dòng)子的抑制作用，發(fā)揮促HIV-1 感染的功能［9］。但在DENV 感染中，尤其是DENV 介導(dǎo)的ADE 感染中缺乏相關(guān)研究，因此，本研究在急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（THP-1）水平建立Ⅲ型DENV（DENV-3，DV-3）感染和ADE 感染模型，探討胞內(nèi)LncRNA 的差異性表達(dá)，繪制競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA，CeRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及LncRNA 翻譯功能預(yù)測(cè)，旨在為今后DENV感染的研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、病毒及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 白紋伊蚊細(xì)胞（C6／36）、THP-1 細(xì)胞、BHK-21 細(xì)胞、DENV-3 和DENV-3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供；大腸埃希菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京擎科生物科技股份有限公司。

1.2主要試劑 胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；抗DENV-2 前膜單克隆抗體（Anti-DENV 2 PrM）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Trizol、PrimeScriptTMreagent kit with gDNA Eraser試劑盒和TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司；LB 液體培養(yǎng)基由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所分子流行病聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室配制；金牌PCR Mix 購(gòu)自北京擎科生物科技股份有限公司；體液病毒RNA 提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。

1.3細(xì)胞傳代培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于28 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)C6／36細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層后，按照1∶2 比例傳代。使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層后，按照1∶3比例傳代。

1.4DENV-3 的傳代擴(kuò)增 C6／36 細(xì)胞傳代生長(zhǎng)至單層，棄去培養(yǎng)基，加入2 mL 維持液（含2%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基）和100μL DENV-3，混勻，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育吸附2 h；補(bǔ)加3 mL維持液，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）為60% ~80%時(shí)，置于-80 ℃凍融1 次，860 ×g離心5 min，吸取上清，分裝后置于-80 ℃凍存。

1.5病毒滴度檢測(cè) 采用CCID50試驗(yàn)。取1 瓶（T25瓶）生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且已生長(zhǎng)為致密單層的BHK-21細(xì)胞，消化后用含2%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，接種于96孔板，100μL／孔，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度時(shí)，將DENV-3 用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基10 倍系列稀釋（10-1~10-6）；每個(gè)病毒稀釋度取100μL 感染細(xì)胞，陰性對(duì)照組加入100 μL 不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，混勻后置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)7 d觀察CPE情況，第7天判定最終的CPE情況，并按下式計(jì)算病毒滴度。

1.6病毒型別鑒定及全長(zhǎng)擴(kuò)增 采用RT-PCR 法。使用Premier primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1~表3），由北京擎科生物科技股份有限公司合成。按照體液病毒RNA 提取試劑盒和PrimeScriptTMreagent kit with gDNA Eraser 試劑盒使用說(shuō)明，提取RNA 及逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定。反應(yīng)體系：金牌PCR Mix（Green）23.0 μL，上下游引物各1.0 μL，模板（cDNA）1.0 μL。反應(yīng)條件：98 ℃2 min；98 ℃10 s，55 ℃10 s，72 ℃5 s，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃1 min。

表1 DENV-3全長(zhǎng)擴(kuò)增引物Tab.1 DENV-3 full length amplification primers

表2 DENV型別鑒定引物Tab.2 DENV type identification primers

表3 DENV-3鑒定引物Tab.3 DENV-3 identification primers

1.7DENV-3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增、鑒定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取5 μL DENV-3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，與50 μL 大腸埃希菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴30 min，42 ℃熱激90 s；將混合物置于冰上2 min 后，加入500 μL 不含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基，于37 ℃，200 r／min 活化60 min；取100μL 涂布于含氨芐青霉素（80μg／mL）的LB 固體培養(yǎng)基中，隔天挑取單菌落進(jìn)行特異引物（表3中DENV-3.2F／2R，DENV-3.3F／3R）擴(kuò)增鑒定，將鑒定正確的菌落擴(kuò)增提取質(zhì)粒，連續(xù)10倍稀釋后，進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)生成線性方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8DENV-3 感染THP-1 細(xì)胞及ADE 感染模型的建立 提前24 h 將THP-1 細(xì)胞傳代，按照MOI=0.3將細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)鋪板至24孔板中。將細(xì)胞分為ADE、DV-3、空白對(duì)照［1640（-）］和陰性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，ADE組用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基將Anti-DENV 2 PrM單抗稀釋至1∶1 024后等體積與DENV-3混勻，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，加入THP-1細(xì)胞中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h后棄上清，補(bǔ)加新的維持液；DV3組將相同感染劑量的DENV-3直接加入THP-1 細(xì)胞中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h 后棄上清，補(bǔ)加新的維持液；空白對(duì)照組將不含血清的RPMI1640 培養(yǎng)基與等劑量的DENV-3等體積混勻后，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，加入THP-1 細(xì)胞中吸附2 h 后棄上清，補(bǔ)加新的維持液；陰性對(duì)照組為THP-1 細(xì)胞。48 h 后收集上述各組細(xì)胞，Trizol 裂解后提取胞內(nèi)總RNA，通過(guò)Prime ScriptTMreagent kit with gDNA Eraser試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后，使用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)病毒核酸熒光信號(hào)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出病毒核酸拷貝數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9LncRNA 測(cè)序及差異性LncRNA 的CeRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 用Trizol裂解細(xì)胞提取胞內(nèi)總RNA 后，委托廣州基迪奧公司完成RNA-Seq測(cè)序。通過(guò)對(duì)miRNA與LncRNA、miRNA 與mRNA 間存在的負(fù)相關(guān)靶向關(guān)系（相關(guān)性小于-0.7），以及LncRNA 與mRNA 間具有正相關(guān)（相關(guān)性大于0.9）進(jìn)行篩選，對(duì)于滿足這兩項(xiàng)條件的LncRNA 進(jìn)行miRTarBase 分析，預(yù)測(cè)下游結(jié)合的miRNA 和mRNA，并通過(guò)Cytoscape 完成可視化分析，繪制CeRNA網(wǎng)絡(luò)通路示意圖。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Graphpad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間差異的比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DENV-3擴(kuò)增及滴度 顯微鏡下觀察顯示，DENV-3接種至C6／36 細(xì)胞第3 天開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞融合現(xiàn)象，第5天有空泡形成，第6天細(xì)胞明顯脫落、破碎，見(jiàn)圖1。該病毒株的病毒滴度約為1.0 × 104.64PFU／mL，見(jiàn)表4。

圖1 DENV-3感染C6／36細(xì)胞的CPE觀察（×40）Fig.1 CPE observation of C6／36 cells infected by DENV-3（×40）

表4 CCID50法檢測(cè)DENV-3的病毒滴度Tab.4 Detection of virus titer of DENV-3 by CCID50

2.2病毒型別鑒定及全長(zhǎng)擴(kuò)增 通過(guò)DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4 的分型引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該毒株確為DENV-3，見(jiàn)圖2。對(duì)DENV-3的前膜段進(jìn)行擴(kuò)增鑒定的結(jié)果與型別鑒定結(jié)果一致，該毒株確為DENV-3，見(jiàn)圖3。將該病毒基因組分為22 段分別進(jìn)行擴(kuò)增，再拼接獲取病毒的基因組全長(zhǎng)序列，見(jiàn)圖4，并將基因組全長(zhǎng)序列上傳至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（MW426463）。

圖2 DENV型別鑒定Fig.2 Type identification of DENV

圖3 DENV-3的鑒定Fig.3 Identification of DENV-3

圖4 DENV-3基因組全長(zhǎng)擴(kuò)增鑒定Fig.4 Full length amplification identification of DENV-3 genome

2.3DENV-3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品鑒定及標(biāo)準(zhǔn)曲線 2 對(duì)特異性鑒定引物（DENV-3.2F／2R，DENV-3.3F／3R）對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，證實(shí)該質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性質(zhì)粒，見(jiàn)圖5。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖6，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-0.316 4x+12.433，R2=0.998 8，表明回歸性較高，該絕對(duì)定量體系準(zhǔn)確性好。

圖5 DENV-3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品特異性引物鑒定Fig.5 Identification of DENV-3 plasmid standard specific primers

圖6 DENV-3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of DENV-3 plasmid

2.4DENV-3 感染THP-1 細(xì)胞及ADE 感染模型的建立 在MOI=0.3的感染劑量下，相較于DENV-3直接感染，1∶1 024 Anti-DENV 2 PrM 的抗體稀釋度可明顯促進(jìn)DENV-3對(duì)THP-1細(xì)胞的感染，感染倍數(shù)增加約4 倍（t= 12.768，P< 0.001）；而空白對(duì)照組由于病毒受到了一定程度的稀釋，則出現(xiàn)了感染減弱現(xiàn)象（t= 0.951，P> 0.05），見(jiàn)圖7。因此，1∶1 024 Anti-DENV 2 PrM 的抗體稀釋度可用于DENV-3 的ADE感染模型建立。

圖7 THP-1細(xì)胞株上DENV-3感染模型及ADE感染模型建立Fig.7 Establishment of DENV-3 infection model and ADE infection model on THP-1 cells

2.5各組間差異性LncRNA 的CeRNA 調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及編碼能力預(yù)測(cè) 如表5所示，將THP-1 vs DENV-3、THP-1 vs ADE、DENV-3 vs ADE 3組中表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)前5 個(gè)LncRNAs 進(jìn)行歸納，繪制的CeRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通路示意圖見(jiàn)圖8 ~ 圖10，發(fā)現(xiàn)在THP-1 vs DENV-3 中，預(yù)測(cè)到人細(xì)胞黏附蛋白相互作用蛋白（cytohesin interacting protein，CYTIP）的表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)；在THP-1 vs ADE中，預(yù)測(cè)到驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員5A（kinesin family 5A，KIF5A）表達(dá)量下調(diào)；在DENV-3 vs ADE 中，預(yù)測(cè)到簇分化抗原9（cluster differentiation antigen 9，CD9）和胰島素樣生長(zhǎng)因子2（insulin like growth factor 2，IGF2）表達(dá)量上調(diào)。此外，對(duì)這些差異性的LnRNA 進(jìn)行了翻譯能力的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)均具有開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），除了Lnc-SH3BP1 和Lnc-RPL41 以外，其余的LncRNA 均具有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)（internal ribosome binding site，IRES），見(jiàn)表5~表7，因此，這些LncRNA可能具備編碼某些小肽的能力，從而發(fā)揮其特有的生物學(xué)功能調(diào)節(jié)作用。

圖8 THP-1 vs DENV-3的LncRNA-miRNA-mRNA 構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)通路Fig.8 CeRNA network pathway constructed by LncRNAmiRNA-mRNA among THP-1 vs DENV-3

圖9 THP-1vsADE的LncRNA-miRNA-mRNA構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)通路Fig.9 CeRNA network pathway constructed by LncRNAmiRNA-mRNA among THP-1 vs ADE

圖10 DENV-3 vs ADE 的LncRNA-miRNA-mRNA 構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)通路Fig.10 CeRNA network pathway constructed by LncRNAmiRNA-mRNA among DENV-3 vs ADE

表5 THP-1 vs DENV-3 中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的前5 個(gè)差異表達(dá)的LncRNAs表達(dá)量差異、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義及編碼能力Tab.5 Differences in expression，statistical significance and coding ability of top five up-regulated and down-regulated LncRNAs expressed differentially in THP-1 vs DENV-3

表6 THP-1 vs ADE 中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的前5 個(gè)差異表達(dá)的LncRNAs表達(dá)量差異、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義及編碼能力Tab.6 Differences in expression，statistical significance and coding ability of top five up-regulated and down-regulated LncRNAs expressed differentially in THP-1 vs ADE

表7 DENV-3 vs ADE 中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的前5個(gè)差異表達(dá)的LncRNAs表達(dá)量差異、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義及編碼能力Tab.7 Differences in expression，statistical significance and coding ability of top five up-regulated and down-regulated LncRNAs expressed differentially in DENV-3 vs ADE

3 討論

近年來(lái)，隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DENV 的致病機(jī)制在多方面得到了不同程度的闡述。2008 年，CHEN 等［10］發(fā)現(xiàn)，C 型凝集素結(jié)構(gòu)域家族5（C-type lectin domain family 5，CLEC5A）是誘導(dǎo)致命性DENV感染的關(guān)鍵因素，通過(guò)誘導(dǎo)TNF-α 的分泌加重病情進(jìn)程，利用單克隆抗體對(duì)CLEC5A 進(jìn)行封閉后，可有效降低血管滲漏和致死率。2013 年，WU 等［11］證實(shí)，DENV感染人巨噬細(xì)胞后會(huì)誘發(fā)炎性反應(yīng)，而CLEC5A發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。2014 年，ZHU 等［12］發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-30e*通過(guò)調(diào)控NF-κB 通路影響干擾素表達(dá)，從而抑制Ⅱ型DENV 感染。近幾年也有許多抗病毒通路在DENV 感染中得到驗(yàn)證［13-15］。但在LncRNA 中對(duì)于DENV 感染及其ADE 感染中的研究更為缺乏，而LncRNA 已被證明參與病毒免疫逃逸和宿主感染［16-19］。因此，本研究利用體外建立的DENV感染模型和ADE 感染模型研究了胞內(nèi)LncRNA 差異性變化，并通過(guò)ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，在THP-1 vs DENV-3中，預(yù)測(cè)到CYTIP 的表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)。有研究報(bào)道，在單純皰疹病毒-1（herpes simplex virus-1，HSV-1）感染樹(shù)突狀細(xì)胞后，會(huì)介導(dǎo)CYTIP降解，從而調(diào)控細(xì)胞黏附和遷移［20］。在THP-1 vs ADE 中，預(yù)測(cè)到KIF5A 的表達(dá)量下調(diào)；在HSV 感染中，KIF5A 可調(diào)控病毒粒子的順行運(yùn)輸［21］。在DENV-3 vs ADE 中，預(yù)測(cè)到CD9和IGF2的表達(dá)量上調(diào)；在HCV 的研究中發(fā)現(xiàn)，CD9和CD81分子可識(shí)別被HCV感染的漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞，并誘導(dǎo)干擾素α 表達(dá)，從而發(fā)揮抗病毒免疫應(yīng)答［22］。IGF2 的基因多態(tài)性和HVC 的感染、清除以及肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［23］。在HCV 感染中，Lnc-IGF2-AS的表達(dá)量發(fā)生了明顯的上調(diào)，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的調(diào)控，促進(jìn)HCV 的復(fù)制［24］。因此，在DENV 感染和ADE 感染過(guò)程中，這些差異性表達(dá)的LncRNA 可能通過(guò)ceRNA 網(wǎng)絡(luò)通路調(diào)控下游不同的mRNA 表達(dá)水平，從而發(fā)揮不同程度的抗病毒或促病毒感染的生物學(xué)特性。此外，在腫瘤領(lǐng)域研究中，越來(lái)越多的LncRNA 被證實(shí)具有編碼小肽的功能，從而發(fā)揮生物學(xué)調(diào)節(jié)功能［25-27］。因此，本研究對(duì)上述差異LncRNA 進(jìn)行了ORF 和IRES 預(yù)測(cè)，證實(shí)除Lnc-SH3BP1 和Lnc-RPL41 以外，其余的LncRNA可能均有編碼小肽的能力。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在DENV 感染及其介導(dǎo)的ADE 感染中，LncRNA 的表達(dá)發(fā)生了明顯改變，并且這些差異性的LncRNA 可能通過(guò)ceRNA 及編碼小肽等多種途徑共同發(fā)揮調(diào)控病毒感染進(jìn)程的生物學(xué)活性。