牛宇輝，李洪珊，李殿玉，吳貝，李向茸，馮若飛

1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730030 2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是由585 個(gè)氨基酸組成的單鏈非糖基化的可溶性單體球狀蛋白，相對分子質(zhì)量為66 500［1］。HSA以前白蛋白的形式在肝臟中合成，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中成熟，然后從肝細(xì)胞分泌［2］。HSA的血漿濃度為35~50 g／L，生物半衰期約19 d，廣泛存在于血管內(nèi)外［3］。HSA是多功能蛋白，既能調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境壓力和血液pH 值，又可結(jié)合及運(yùn)輸各種生物活性分子，包括蛋白質(zhì)、肽、脂肪酸、激素、氨基酸、藥物、營養(yǎng)素和金屬離子等，是許多激素、離子和脂肪酸的載體蛋白［4］。HSA 還能清除對細(xì)胞生存有害的活性氧自由基［5］。這些特性使HSA成為在體外培養(yǎng)環(huán)境下維持和促進(jìn)細(xì)胞生長的理想選擇［6］。此外，由于HSA 具有較長的半衰期和極低的免疫原性，還可作為重組藥物的穩(wěn)定劑或保護(hù)劑［7］，如干擾素（interferon，IFN）［8］、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）［9］、抗體分子［10］和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）［11］。綜上，HSA 在藥物納米級傳遞、疫苗生產(chǎn)、冷凍保存、多肽融合、細(xì)胞培養(yǎng)基、抗氧化劑等方面均有著廣泛的應(yīng)用。

據(jù)估計(jì)，全世界對HSA 的需求量每年超過500噸，并且隨著HSA越來越多新應(yīng)用的發(fā)現(xiàn)，年需求量還呈穩(wěn)步增長趨勢［12］。為滿足日益增長的市場需求和避免生物安全問題，利用基因工程生產(chǎn)重組人血清白蛋白（recombinant human serum albumin，rHSA）已獲得廣泛研究及開發(fā)，其優(yōu)點(diǎn)主要是生物活性與天然HSA 相同，還兼具可大規(guī)模生產(chǎn)，來源不易受病原體污染等優(yōu)點(diǎn)［13-15］。中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相較于當(dāng)前生產(chǎn)rHSA 較為成熟的畢赤酵母和水稻表達(dá)系統(tǒng)，具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的外源蛋白與天然產(chǎn)物生物學(xué)特性及相關(guān)理化性質(zhì)更接近，易于高密度懸浮培養(yǎng)，以及分泌自身內(nèi)源蛋白較少等優(yōu)點(diǎn)。

本研究構(gòu)建了穩(wěn)定分泌表達(dá)HSA 的CHO 懸浮細(xì)胞系，并進(jìn)行培養(yǎng)工藝優(yōu)化，以期建立高效表達(dá)、可規(guī)?；?、穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝，為進(jìn)一步在生物制品領(lǐng)域以及新型動(dòng)物疫苗領(lǐng)域緩解市場供應(yīng)壓力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒及細(xì)胞 質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP、E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞及CHO 無血清全懸浮細(xì)胞由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.2標(biāo)準(zhǔn)品 HSA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液購自蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字S10820116，濃度：200 g／L，分別用PBS 稀釋成50、100、200 mg／L 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3主要試劑及儀器 DNA ladder 購自北京中科瑞泰生物科技有限公司；SFM4CHO 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含有任何來源的白蛋白）、Cell Boost 2（簡稱CB2）和Cell Boost 5（簡稱CB5）補(bǔ)料培養(yǎng)基均購自美國Cytiva 公司；高純質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、XhoⅠ購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；Human Albumin ELISA試劑盒與HRP 標(biāo)記的抗人血清白蛋白抗體購自美國Abcam 公司；Amaxa SF cellline 4D-Nucleofector X kit L電轉(zhuǎn)染試劑盒購自瑞士Lonza公司；新霉素（G418）購自美國Gibco 公司；無水葡萄糖（GLu）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丁酸鈉（NaBu）購自上海麥克林生化科技有限公司；葡萄糖測定試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；PowerPac Basic 電泳儀購自美國Bio-Rad 公司；PowerCycle SL 96 Gradient 梯度溫度PCR 儀購自德國Analytik Jena AG 公司；Amersham Imager 600電泳凝膠成像系統(tǒng)購自美國GE Healthcare Bio-Sciences AB 公司；MK3 酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；5 L 生物反應(yīng)器購自荷蘭Applikon Biotechnology公司；Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自上海睿鈺生物科技有限公司。

1.4重組質(zhì)粒的構(gòu)建 從NCBI 數(shù)據(jù)庫中獲取HSA的核苷酸序列（NM_000477.5），根據(jù)細(xì)胞密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，上游插入KpnⅠ酶切位點(diǎn)，下游插入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成基因后，克隆至pcDNA3.1 載體，構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1-HSA，轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切體系為：DEPC H2O 30μL，10× K buffer 5μL，KpnⅠ2.5μL，XhoⅠ2.5μL，重組質(zhì)粒10μL。反應(yīng)條件：37 ℃恒溫酶切2 h。質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序正確后提取高純質(zhì)粒備用。

1.5質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞 采用電轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒pcDNA3.1-HSA轉(zhuǎn)染至無血清全懸浮CHO細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染組和對照組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP）。取1 mL細(xì)胞活力高于95%、活細(xì)胞密度為（1.0~2.0）×106個(gè)／mL的CHO 細(xì)胞，77×g離心10 min；棄上清，收集細(xì)胞，分別加入電轉(zhuǎn)染試劑Nuclefector Solution和Supplement，輕輕吹打混勻，再加入10μg 質(zhì)粒后，立即將混合液轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)；將電轉(zhuǎn)后細(xì)胞懸液移至6 孔板中，補(bǔ)加SFM4CHO 培養(yǎng)基至總體積為2 mL，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h；分別取細(xì)胞和上清進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.6HSA基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測 利用Trizol 法提取上述細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物HSA-F：5'-GGTACCGCCACCATGAAGTGGGTCACC-3'（下劃線部分為KpnⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物HSAR：5'-CTCGAGCAGCCCGAGGGCAGCTTG-3'（下劃線部分XhoⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段大小為1 845 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：超純水18.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10 mmol／L dNTPs 0.5 μL，20 μmol／L 上下游引物各0.5μL，2.5 U／μL Ex Taq 酶0.5μL，2μL cDNA。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，66 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7HSA蛋白表達(dá)水平的檢測 采用Western blot法。將收集的細(xì)胞上清經(jīng)10%SDS-PAGE 分離，用PVDF膜15 V，1 A 半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜30 min；2.5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜；加入HRP 標(biāo)記的抗人血清白蛋白抗體（1∶1 000 稀釋），室溫?fù)u床孵育2 h；TBST 洗滌5 次，采用ECL高敏型顯色液進(jìn)行顯色，用Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.8CHO-rHSA 高表達(dá)單克隆細(xì)胞株篩選 在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞池中加入實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的全懸浮CHO細(xì)胞最佳G418 濃度（400 μg／mL），加壓篩選2 ~ 3代后進(jìn)行單克隆篩選，按每孔1 個(gè)細(xì)胞接種96 孔培養(yǎng)板，同時(shí)加入G418，37 ℃培養(yǎng)15 d；尋找形成細(xì)胞群落的孔，將初篩獲得的細(xì)胞命名為CHO-rHSA。從中選擇1 株HSA 高表達(dá)量的細(xì)胞進(jìn)行逐步放大培養(yǎng)并凍存。為初步確定表達(dá)水平，將該株細(xì)胞按1.0×106個(gè)／mL的密度傳代，培養(yǎng)體積為50 mL，置37 ℃，5%CO2搖床中，120 r／min培養(yǎng)3 d；215×g離心10 min；收集上清，采用Human Albumin ELISA 試劑盒檢測HSA 含量。為進(jìn)一步提高HSA 表達(dá)量，將該株細(xì)胞進(jìn)行第2 次單克隆加藥篩選，方法同上，選取其中表達(dá)量高的2 株細(xì)胞進(jìn)行逐步放大培養(yǎng)。將該2 株細(xì)胞與第1次單克隆細(xì)胞均按1.0×106個(gè)／mL的密度傳代，從第3 天開始每天取細(xì)胞懸液，與臺(tái)盼藍(lán)1∶1混合后加入加樣板中，采用Countstar 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測活細(xì)胞密度和細(xì)胞活力。待培養(yǎng)至第14 天或活力降至80%以下時(shí)，收獲細(xì)胞懸液，215 ×g離心10 min 后，收集上清，采用1.7 項(xiàng)方法及Human Albumin ELISA試劑盒檢測HSA含量。

1.9搖瓶培養(yǎng)工藝優(yōu)化

1.9.1丁酸鈉和葡萄糖對CHO-rHSA單克隆細(xì)胞株生長及HSA表達(dá)影響的檢測 將生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的CHO-rHSA單克隆細(xì)胞以1.0×106個(gè)／mL的密度傳代，培養(yǎng)體積為50 mL，置37 ℃，5% CO2搖床中120 r／min 培養(yǎng)。依據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期篩選出優(yōu)化條件［16］，實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞培養(yǎng)第48 h 添加1.0 mmol／L NaBu 與葡萄糖添加方案3.0→7.0 g／L 進(jìn)行組合培養(yǎng)。以未處理，即不添加丁酸鈉和不補(bǔ)糖組作為對照組。從第4天開始每天測定活細(xì)胞密度、細(xì)胞活力及培養(yǎng)基中葡萄糖含量，活細(xì)胞密度及細(xì)胞活力檢測方法同1.8 項(xiàng)，葡萄糖含量檢測參照葡萄糖測定試劑盒說明書進(jìn)行。待培養(yǎng)至第14 天或活力降至80%以下時(shí)收獲細(xì)胞懸液，215×g離心10 min，收集上清，采用Western blot 及ELISA 試劑盒檢測HSA 含量，檢測方法同1.7和1.8項(xiàng)。

1.9.2補(bǔ)料培養(yǎng)對CHO-rHSA 單克隆細(xì)胞株生長及表達(dá)影響的檢測 根據(jù)補(bǔ)料培養(yǎng)基不能含有HSA 的原則和Cytiva 官方對其各補(bǔ)料培養(yǎng)基特性的介紹，選擇了其市售的CB2和CB5補(bǔ)料培養(yǎng)基與SFM4CHO基礎(chǔ)培養(yǎng)基組合使用，補(bǔ)料方案見表1。將生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的CHO-rHSA 單克隆細(xì)胞以1.0×106個(gè)／mL 的密度傳代，培養(yǎng)體積為50 mL，置37 ℃，5%CO2搖床中，120 r／min培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組按表1進(jìn)行補(bǔ)料，以未處理組，即不添加補(bǔ)料培養(yǎng)基和不補(bǔ)糖組作為對照。從第4天開始每天測定活細(xì)胞密度、細(xì)胞活力及培養(yǎng)基中葡萄糖含量，活細(xì)胞密度及細(xì)胞活力檢測方法同1.8 項(xiàng)，葡萄糖含量檢測參照葡萄糖測定試劑盒說明書進(jìn)行。培養(yǎng)至第14 天或活力降至80%以下收獲細(xì)胞懸液，215×g離心10 min，收集上清，采用Western blot及ELISA試劑盒檢測HSA含量，檢測方法同1.7和1.8項(xiàng)。

表1 4種補(bǔ)料方案Tab.1 Four supplemental medium schemes

1.105 L 生物反應(yīng)器放大培養(yǎng) 為明確5 L 生物反應(yīng)器培養(yǎng)方案，將補(bǔ)料方案組合前期優(yōu)化條件設(shè)置了3 種培養(yǎng)方案進(jìn)行篩選，見表2。將CHO-rHSA 單克隆細(xì)胞以1.0×106個(gè)／mL 的密度接種5 L 生物反應(yīng)器。培養(yǎng)參數(shù)設(shè)置為：溫度37 ℃，溶氧40%，pH（7.00±0.10），初始轉(zhuǎn)速150 r／min。接種后每天取樣監(jiān)測活細(xì)胞密度、細(xì)胞活力及培養(yǎng)基中葡萄糖含量，活細(xì)胞密度及細(xì)胞活力檢測方法同1.8 項(xiàng)，葡萄糖含量檢測參照葡萄糖測定試劑盒說明書進(jìn)行。待細(xì)胞活力降至80%以下收獲細(xì)胞懸浮液，215×g離心10 min，收集上清，采用Western blot 及ELISA 試劑盒檢測HSA含量，檢測方法同1.7和1.8項(xiàng)。

表2 生物反應(yīng)器不同培養(yǎng)方案Tab.2 Different culture schemes of bioreactors

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0 軟件繪圖，利用單因素分析ANOVAs或t檢驗(yàn)法計(jì)算各組數(shù)據(jù)間顯著性差異。數(shù)據(jù)以均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HSA的鑒定 質(zhì)粒pcDNA3.1-HSA的雙酶切（KpnⅠ／XhoⅠ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 845 bp 的插入片段和5 428 bp 的載體片段，大小均與理論值相符，見圖1。測序結(jié)果顯示，質(zhì)粒pcDNA3.1-HSA與NCBI 數(shù)據(jù)庫中HSA的核苷酸序列同源性為100%，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HSA的雙酶切（KpnⅠ／XhoⅠ）鑒定Fig.1 Restriction map of recombinant plasmid pcDNA3.1-HSA（KpnⅠ／XhoⅠ）

2.2質(zhì)粒pcDNA3.1-HSA在CHO細(xì)胞中的表達(dá) 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞48 h 后，RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，僅pcDNA3.1-HSA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清中可見HSA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，見圖2A；Western blot分析結(jié)果顯示，SFM4CHO培養(yǎng)基、未轉(zhuǎn)染組及對照組均未檢測到HSA表達(dá)，僅pcDNA3.1-HSA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清中可見明顯HSA表達(dá)，見圖2B。表明重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HSA在CHO細(xì)胞中成功分泌表達(dá)。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HSA 在CHO 細(xì)胞中表達(dá)的鑒定Fig.2 Identification of expression of recombinant plasmid pc DNA3.1-HSA in CHO cell

2.3CHO-rHSA 高表達(dá)單克隆細(xì)胞株篩選 CHOrHSA 細(xì)胞經(jīng)單克隆及持續(xù)加藥篩選獲得27 株單克隆細(xì)胞，從中篩選出1 株表達(dá)量相對較高的單克隆細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，命名為CHO-rHSA-7H2，將其傳代培養(yǎng)3 d 后，ELISA 法檢測上清中HSA 表達(dá)量為5.96 mg／L。為進(jìn)一步提高CHO-rHSA 單克隆細(xì)胞株中HSA 表達(dá)，將CHO-rHSA-7H2 細(xì)胞株進(jìn)行2 次單克隆，經(jīng)初步篩選獲得CHO-rHSA-7H2A9 和CHOrHSA-7H2D12，見圖3。將上述2 株2 次單克隆細(xì)胞及CHO-rHSA-7H2繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3株細(xì)胞最大活細(xì)胞密度及細(xì)胞活力相差不大，見圖4；但CHO-rHSA-7H2A9 和CHO-rHSA-7H2D12 細(xì)胞中HSA 表達(dá)量顯著高于CHO-rHSA-7H2細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為24.07和19.07，P均<0.05），見圖5。ELISA 法檢測CHO-rHSA-7H2A9 和CHO-rHSA-7H2D12 細(xì)胞中HSA 表達(dá)量分別為29.37和25.26 mg／L，見圖6。因在傳代過程中發(fā)現(xiàn)CHO-rHSA-7H2A9細(xì)胞中HSA表達(dá)更穩(wěn)定，因此后期試驗(yàn)所用細(xì)胞株均為CHOrHSA-7H2A9。

注：a表示與CHO-rHSA-7H2細(xì)胞相比，P<0.05。

圖3 2次單克隆細(xì)胞（×100）Fig.3 Secondary monoclonal cells（×100）

圖4 2次單克隆細(xì)胞活細(xì)胞密度（A）及細(xì)胞活力（B）對比Fig.4 Comparison of viable cell density（A）and cell viability（B）of secondary monoclonal cells

圖5 2次單克隆細(xì)胞HSA表達(dá)的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of expression of HSA in secondary monoclonal cell

2.4搖瓶培養(yǎng)工藝優(yōu)化

2.4.1丁酸鈉和葡萄糖對CHO-rHSA 單克隆細(xì)胞生長及HSA 表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)組最大活細(xì)胞密度為12.40×106個(gè)／mL，與對照組差異較?。粚?shí)驗(yàn)組培養(yǎng)周期與對照組相比有所延長。見圖7。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中HSA 表達(dá)明顯提高，見圖8，平均表達(dá)量達(dá)到85.64 mg／L，比對照組平均提高了68.30%。表明前期優(yōu)選出的丁酸鈉和葡萄糖培養(yǎng)方案也能促進(jìn)該單克隆細(xì)胞中HSA的表達(dá)。

圖7 丁酸鈉和葡萄糖對CHO-rHSA 單克隆細(xì)胞生長的影響Fig.7 Effects of sodium butyrate and glucose on growth of CHO-rHSA monoclonal cells

圖8 丁酸鈉和葡萄糖對CHO-rHSA 單克隆細(xì)胞HSA 表達(dá)影響的Western blot分析Fig.8 Western blot analysis of effects of sodium butyrate and glucose on HSA expression in CHO-rHSA monoclonal cells

2.4.2補(bǔ)料方案對CHO-rHSA單克隆細(xì)胞生長及HSA表達(dá)的影響 各實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞活力差異較小，其中補(bǔ)料方案①組最大活細(xì)胞密度達(dá)到15.27×106個(gè)／mL，HSA表達(dá)量為91.36 mg／L；補(bǔ)料方案③組最大活細(xì)胞密度與對照組差異較小，達(dá)到11.88×106個(gè)／mL，但HSA表達(dá)量為109.00 mg／L，比同期對照組平均提高了158.80%；補(bǔ)料方案②組最大活細(xì)胞密度達(dá)到16.02×106個(gè)／mL，但表達(dá)量僅為54.14 mg／L。單純使用CB5 作為補(bǔ)料培養(yǎng)基的補(bǔ)料方案①和③的最大活細(xì)胞密度差異較小，但表達(dá)量相較于補(bǔ)料方案②和④差異明顯。綜合考慮，選擇補(bǔ)料方案①和③在5 L生物反應(yīng)器進(jìn)行放大培養(yǎng)驗(yàn)證。見圖9~圖11。

圖9 不同補(bǔ)料方案的比較Fig.9 Comparison of different supplemental medium schemes

圖10 不同補(bǔ)料方案HSA表達(dá)的Western blot分析Fig.10 Western blot analysis of HSA expression in different supplementalmedium schemes

圖11 不同補(bǔ)料方案HSA表達(dá)的ELISA檢測Fig.11 Detection of HSA expression in different supplemental medium schemes by ELISA

2.55 L 生物反應(yīng)器放大培養(yǎng) 培養(yǎng)方案Ⅰ中最大活細(xì)胞密度僅為9.19 × 106個(gè)／mL，HSA 表達(dá)量達(dá)到82.21 mg／L；培養(yǎng)方案Ⅱ和Ⅲ中最大活細(xì)胞密度分別為13.09× 106和17.10× 106個(gè)／mL，HSA 表達(dá)量分別達(dá)到116.66 和166.12 mg／L。在3 種培養(yǎng)方案細(xì)胞活力差別不大的情況下，培養(yǎng)方案Ⅱ和Ⅲ的最大活細(xì)胞密度和HSA 平均表達(dá)量均高于方案Ⅰ，表明補(bǔ)料方案③相較于①更有利于CHO-rHSA-7H2A9細(xì)胞的培養(yǎng)，且本次實(shí)驗(yàn)最大活細(xì)胞密度接近2.5 項(xiàng)。綜合考慮，選擇培養(yǎng)方案Ⅲ，即優(yōu)化后的補(bǔ)料方案③結(jié)合48 h添加1.0 mmol／L NaBu以及葡萄糖添加方案3.0→7.0 g／L進(jìn)行培養(yǎng)。見圖12~圖14。

圖13 生物反應(yīng)器不同培養(yǎng)方案HSA表達(dá)的Western blot分析Fig.13 Western blot analysis of HSA expression in different culture schemes of bioreactors

圖14 生物反應(yīng)器不同培養(yǎng)方案HSA表達(dá)的ELISA檢測Fig.14 Detection of HSA expression in different culture schemes of bioreactors by ELISA

3 討論

HSA 在生物制品領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，其作為一種重要的藥用輔料，可充當(dāng)新型動(dòng)物疫苗高密度懸浮培養(yǎng)所需無血清培養(yǎng)基的重要添加組分及藥物制劑的載體、穩(wěn)定劑或保護(hù)劑等。目前，市場上HSA來源有限，供給緊張。而傳統(tǒng)提取HSA 主要受到血漿來源有限和獻(xiàn)血者可能引起的高風(fēng)險(xiǎn)的病毒傳播的限制。因此，基因重組技術(shù)生產(chǎn)rHSA 已成為研究熱點(diǎn)，其中相較于較為成熟的酵母和水稻表達(dá)系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物CHO 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)產(chǎn)物生理學(xué)特性與天然產(chǎn)物高度相似，來源不受病原體污染等特點(diǎn)，逐漸成為rHSA領(lǐng)域優(yōu)勢替代物［17-20］。

本研究首先構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HSA，并將其電轉(zhuǎn)染至本課題組前期馴化的全懸浮CHO細(xì)胞中，通過G418 篩選初步獲得穩(wěn)定分泌表達(dá)HSA的單克隆細(xì)胞株。已有研究表明，可在細(xì)胞培養(yǎng)過程中將獲得的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行第2 甚至3 次單克隆篩選，以獲得高表達(dá)外源蛋白細(xì)胞株［21］。因此，本研究將單克隆細(xì)胞株CHO-rHSA-7H2 進(jìn)行了2 次單克隆篩選，從而提高HSA 表達(dá)量。2 次篩選后，將篩選出的HSA表達(dá)量較高的細(xì)胞株與初始單克隆細(xì)胞株CHO-rHSA-7H2（5.96 mg／L）進(jìn)行比較，確定得到了2 株高表達(dá)HSA 的2 次單克隆細(xì)胞株CHOrHSA-7H2A9（29.37 mg／L）和CHO-rHSA-7H2D12（25.26 mg／L）。2 次單克隆篩選后，將重組CHO 細(xì)胞中的HSA 表達(dá)量提高了5 倍左右。之后將實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化條件在2 次單克隆細(xì)胞株上進(jìn)行培養(yǎng)驗(yàn)證，明確了前期優(yōu)化條件在2 次單克隆細(xì)胞株上同樣適用，并用于接下來的工藝優(yōu)化。在哺乳動(dòng)物CHO 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，伴隨著CHO 細(xì)胞的生長和培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，在適宜的時(shí)間添加濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)基對細(xì)胞生長具有一定的促進(jìn)作用，可延長細(xì)胞培養(yǎng)周期，最終提高外源蛋白表達(dá)［17］。根據(jù)Cytiva 公司的補(bǔ)料培養(yǎng)基適用說明以及本實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基中不能含有HSA 等要求，選擇了CB2 和CB5作為CHO 工程細(xì)胞的補(bǔ)料培養(yǎng)基，并制定了4 種補(bǔ)料方案進(jìn)行篩選。4 種補(bǔ)料方案間的區(qū)別主要包括2點(diǎn)：補(bǔ)料方案①和③均為單獨(dú)使用CB5作為補(bǔ)料培養(yǎng)基；補(bǔ)料方案③和④在傳代時(shí)已加入一定量的CB5 補(bǔ)料培養(yǎng)基。補(bǔ)料方案篩選結(jié)果表明，補(bǔ)料培養(yǎng)使細(xì)胞最大增殖密度相較于前期實(shí)驗(yàn)提升效果顯著，且細(xì)胞培養(yǎng)周期從8 d 左右延長至12 ~ 20 d，表明補(bǔ)料培養(yǎng)的效果顯著，且2 次單克隆細(xì)胞株CHOrHSA-7H2A9中HSA表達(dá)量達(dá)到100.00 mg／L左右。在5 L生物反應(yīng)器上進(jìn)行了放大培養(yǎng)驗(yàn)證試驗(yàn)，將篩選出的補(bǔ)料方案與前期初步優(yōu)化方案進(jìn)行組合培養(yǎng)，選取3種培養(yǎng)方案進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定培養(yǎng)方案Ⅲ作為5 L 生物反應(yīng)器基礎(chǔ)培養(yǎng)方案。但生物反應(yīng)器上還有一系列相關(guān)培養(yǎng)參數(shù)待優(yōu)化，如pH、溶氧及降溫溫度等，具體培養(yǎng)方案仍需進(jìn)一步探索。此外，對無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞培養(yǎng)有效成分進(jìn)行篩選，通過改變其所占比例，在不影響細(xì)胞生長甚至促進(jìn)生長的條件下降低無血清培養(yǎng)基成本也需進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HSA，并成功轉(zhuǎn)染至全懸浮CHO 細(xì)胞，獲得了2 株高表達(dá)HSA的單克隆細(xì)胞株CHO-rHSA-7H2A9和CHO-rHSA-7H2D12。在搖瓶水平上將前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件進(jìn)行培養(yǎng)驗(yàn)證以及補(bǔ)料方案篩選試驗(yàn)后，將前期優(yōu)化條件及補(bǔ)料方案在5 L生物反應(yīng)器上進(jìn)行放大培養(yǎng)驗(yàn)證，確定了以補(bǔ)料方案③結(jié)合48 h添加1.0 mmol／L NaBu和補(bǔ)糖3.0→7.0 g／L 為基礎(chǔ)的培養(yǎng)方案Ⅲ作為生物反應(yīng)器培養(yǎng)方案，可使細(xì)胞培養(yǎng)上清中HSA 表達(dá)量達(dá)到166.12 mg／L，最大活細(xì)胞密度達(dá)到17.10×106個(gè)／mL，相較于第1次單克隆細(xì)胞CHO-rHSA-7H2上清中HSA的表達(dá)量提升了30倍左右。